咖啡酸苯乙酯對(duì)HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激和脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)作用

劉 暢，常 超，陳瑞達(dá)，林萌慧，孫 蓉，蔡成崗，趙敏潔，蔡海鶯,,3,*

（1.浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310023；2.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058；3.美欣達(dá)集團(tuán)有限公司，浙江 湖州 313002）

隨著居民膳食結(jié)構(gòu)的變化，高脂膳食攝入的不斷增加成為日益顯著的現(xiàn)象，過量攝入的高脂膳食會(huì)導(dǎo)致機(jī)體物質(zhì)和能量代謝失衡[1]，引起體質(zhì)量增加、脂肪積累、氧化應(yīng)激提高以及系統(tǒng)性炎癥[2-3]，并且伴隨著肥胖、非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）、代謝綜合征等多種疾病的產(chǎn)生[4-5]。引起人們廣泛關(guān)注的脂代謝紊亂也和高脂膳食的過量攝入關(guān)系密切[6]，當(dāng)大量的能量被吸收后，未被消耗的能量會(huì)在脂肪組織中儲(chǔ)存[7]，脂肪積累在現(xiàn)有的脂肪細(xì)胞中，從而增大細(xì)胞體積，然而脂肪細(xì)胞儲(chǔ)存脂肪的能力有限，多余的脂肪無法被脂肪組織吸收，從而引起血液、肝臟等的功能紊亂，而脂肪組織的擴(kuò)大會(huì)逐漸導(dǎo)致肥胖[8-9]?？Х人岜揭阴ィ╟affeic acid phenethyl ester，CAPE）是來源于蜂膠中的天然活性物質(zhì)[10]，具有許多生物學(xué)特性，如抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤[11-13]等。Sun Lulu等[14]的研究表明，CAPE具有改善脂代謝紊亂的作用，其能夠調(diào)節(jié)不同組織脂代謝的多個(gè)信號(hào)通路，改善高脂膳食脂肪合成調(diào)控的一系列關(guān)鍵基因的表達(dá)，抑制組織中的脂肪細(xì)胞分化，減少脂肪的積累。遲樂[15]研究發(fā)現(xiàn)，CAPE通過調(diào)節(jié)過氧化物酶體増殖物激活受體-γ（peroxisome proliferator activated receptor-γ，PPAR-γ）、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α（enhancer binding protein α，CEBPα）和轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor β，TGF-β）信號(hào)通路影響3T3-L1細(xì)胞生成脂肪，抑制脂質(zhì)合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和下游相關(guān)因子的表達(dá)，顯著降低細(xì)胞中甘油三酯（triglyceride，TG）含量和甘油-3-磷酸脫氫酶的活性，具有潛在的抗肥胖作用。有研究顯示，CAPE可通過抑制糖尿病小鼠和人肝臟腫瘤細(xì)胞（HepG2）模型的應(yīng)激，活化蛋白激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）炎癥信號(hào)通路，改善胰島素抵抗[16]。目前這些研究都只集中于CAPE調(diào)節(jié)脂代謝的生化指標(biāo)測定以及信號(hào)通路的驗(yàn)證，對(duì)于其直接作用的位點(diǎn)尚不明確。本研究用CAPE處理油酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞高脂肪模型，通過轉(zhuǎn)錄組測序，對(duì)2.5 μmol/L CAPE及高脂肪組的細(xì)胞進(jìn)行測序，擬從轉(zhuǎn)錄組水平分析CAPE處理后HepG2細(xì)胞的基因表達(dá)差異，進(jìn)而對(duì)基因進(jìn)行富集分析，同時(shí)篩選出與脂代謝相關(guān)的基因，以期揭示CAPE調(diào)節(jié)脂代謝的潛在機(jī)理，為改善由高脂膳食引起的脂代謝紊亂提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CAPE、油酸、油紅O 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；MEM（minimum essential medium）培養(yǎng)基、HepG2細(xì)胞 武漢普諾賽生命科技有限公司；TRIzol試劑南京諾唯贊生物科技股份有限公司；CCK-8細(xì)胞活力試劑盒、TG試劑盒、總膽固醇（total cholesterol，T-CHO）試劑盒、總蛋白定量試劑盒（BCA法） 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

超凈工作臺(tái)、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、Sorvall? ST 8小型臺(tái)式離心機(jī) 美國賽默飛世爾科技有限公司；CKX53倒置顯微鏡 日本Olympus公司；SpectraMax iD3多功能酶標(biāo)儀 北京眾力挽生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞處理

將復(fù)蘇后的HepG2細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)80%～90%，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。HepG2細(xì)胞培養(yǎng)在10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）胎牛血清混合1%青霉素-鏈霉素試液的MEM完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，常規(guī)換液、傳代，當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)取出進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。參考文獻(xiàn)[17]的結(jié)果，使用0.2 mmol/L的油酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞形成高脂肪模型的效果最佳，因此將細(xì)胞分為正常組（NCD）、高脂肪組（HFD）、高脂肪＋處理組（包括HFD＋7.5 μmol/L CAPE（CAPE7.5）、HFD＋5 μmol/L CAPE（CAPE5）、HFD＋2.5 μmol/L CAPE（CAPE2.5）、HFD＋2 μmol/L CAPE（CAPE2）、HFD＋1 μmol/L CAPE（CAPE1）），每組設(shè)置6 個(gè)平行對(duì)照，對(duì)處理后的細(xì)胞進(jìn)行染色觀察，在冰水浴條件下超聲破碎細(xì)胞（300 W超聲3～5 s/次，間隔20 s）后進(jìn)行理化指標(biāo)檢測，選出降脂效果最優(yōu)組別進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組水平分析。

1.3.2 指標(biāo)檢測

1.3.2.1 CCK-8細(xì)胞活力檢測

細(xì)胞按照正常組（NCD）、高脂肪組（HFD）、高脂肪＋處理組（包括HFD＋10 μmol/L CAPE、HFD＋7.5 μmol/L CAPE、HFD＋5 μmol/L CAPE、HFD＋2.5 μmol/L CAPE、HFD＋2 μmol/L CAPE、HFD＋1 μmol/L CAPE）分組，使用CCK-8試劑盒檢測各處理組細(xì)胞活力。

1.3.2.2 油紅O染色觀察及吸光度測定

正常組、高脂組及高脂肪＋處理組細(xì)胞棄掉舊培養(yǎng)液并用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）潤洗2 次后，加入200 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液，將孔板轉(zhuǎn)移到4 ℃冰箱內(nèi)固定20 min，棄廢液，用PBS潤洗2 次，24 孔板中每孔加入200 μL 油紅O染色10 min。待染色觀察樣品采用60%（體積分?jǐn)?shù)，下同）異丙醇或70%乙醇溶液快速潤洗，吸去廢液，每孔加入1 mL PBS后在顯微鏡下觀察拍照；待測吸光度樣品使用60%異丙醇或70%乙醇溶液[18]萃取油紅O，室溫放置20 min，將萃取出的染液以500 μL/孔轉(zhuǎn)移至24 孔培養(yǎng)板中，測定其在490 nm波長處吸光度[19]。

1.3.2.3 細(xì)胞內(nèi)TG和T-CHO水平測定

分別收集各處理組細(xì)胞并制備成勻漿液。參照相應(yīng)試劑盒說明書，測定各組HepG2細(xì)胞內(nèi)的TG、T-CHO水平，并通過定量細(xì)胞中的蛋白進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.3.2.4 計(jì)算機(jī)預(yù)測靶點(diǎn)

通過S w i s s T a r g e t P r e d i c t i o n（h t t p://swisstargetprediction.ch/）數(shù)據(jù)庫[20]檢索CAPE的作用靶蛋白及對(duì)應(yīng)基因，通過GeneCards（https://www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫[21]檢索脂代謝相關(guān)靶點(diǎn)基因，將結(jié)果導(dǎo)入STRING（https://string-db.org/）數(shù)據(jù)庫構(gòu)建共有靶點(diǎn)基因的蛋白相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)[22]。使用DAVID（https://david.ncifcrf.gov）數(shù)據(jù)庫[23]對(duì)共有的靶點(diǎn)基因進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。以核心靶點(diǎn)基因編碼蛋白為受體、CAPE為配體，采用AutoDock4軟件進(jìn)行分子對(duì)接，模擬CAPE調(diào)節(jié)脂代謝靶點(diǎn)。

1.3.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組樣本處理及轉(zhuǎn)錄組測序分析

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)調(diào)節(jié)脂代謝指標(biāo)效果較顯著的HFD＋2.5 μmol/L CAPE組進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組水平分析。取對(duì)數(shù)生長期[24]的HepG2細(xì)胞，以5×105個(gè)/孔接種于6 孔細(xì)胞板中，每個(gè)條件設(shè)置3 組平行，即HFD-1、HFD-2、HFD-3（HFD組）和CAPE-1、CAPE-2、CAPE-3（HFD＋2.5 μmol/L CAPE組）。待細(xì)胞密度達(dá)到80%左右[25]，加入0.2 mmol/L油酸將細(xì)胞誘導(dǎo)成高脂肪模型。培養(yǎng)24 h后，處理組棄去舊液，加入0.2 mmol/L油酸＋2.5 μmol/L CAPE混合培養(yǎng)液。孵育24 h后，用移液槍吸去孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)基，每孔加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰酶1 mL，消化細(xì)胞3～5 min，吸取MEM完全培養(yǎng)基5 mL終止細(xì)胞消化，收集細(xì)胞后轉(zhuǎn)入10 mL離心管中，4 ℃、200×g離心5 min，棄上清液，再加入3 mL PBS重懸，重復(fù)離心步驟，細(xì)胞沉淀中加入5×106個(gè)/mL TRIzol試劑[26]，吹打混勻，1 mL/管分裝入1.5 mL RNase-free離心管中，液氮速凍0.5 h，包埋在干冰中送樣。細(xì)胞樣品RNA質(zhì)量檢測及轉(zhuǎn)錄組分析由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。轉(zhuǎn)錄組測序步驟：利用Illumina測序平臺(tái)對(duì)基因序列進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測序；通過Fastp軟件對(duì)原始測序序列5’→3’的堿基質(zhì)量及測序數(shù)據(jù)中A、T、G、C堿基含量進(jìn)行評(píng)估，將與分析標(biāo)準(zhǔn)不符合的讀數(shù)（reads）刪除，保留對(duì)后續(xù)分析有幫助的高質(zhì)量讀數(shù)（clean reads）。

1.3.2.6 差異表達(dá)基因功能注釋及富集分析

通過Hisat2軟件進(jìn)行基因序列比對(duì)分析，綜合蛋白質(zhì)直系同源簇（clusters of orthologous groups of proteins，COG）、非冗余蛋白庫（non-redundant protein sequence database，NR）、基因本體（gene ontology，GO）、KEGG、蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫（Swiss-Prot protein sequence database，Swiss-Prot）、蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫（protein families database，Pfam）對(duì)所表達(dá)的基因進(jìn)行注釋；利用DESeq2、DEGseq和edgeR軟件進(jìn)行基因表達(dá)量差異分析。差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）篩選標(biāo)準(zhǔn)：|log2FC|≥1（FC：實(shí)驗(yàn)組基因表達(dá)量/對(duì)照組基因表達(dá)量）且P≤0.05。采用美吉生信云分析平臺(tái)（https://cloud.majorbio.com/）對(duì)基因集中的基因/轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行KEGG通路富集分析[27]，當(dāng)P＜0.05時(shí)認(rèn)為該通路富集顯著。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Origin 2019軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析與處理，并用GraphPad prism6軟件作圖，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析（ANOVA），以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 CAPE對(duì)油酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)代謝的影響

根據(jù)文獻(xiàn)[28-29]報(bào)道，CAPE在高于20 μmol/L時(shí)具有一定細(xì)胞毒性，CCK-8細(xì)胞活力檢測結(jié)果顯示，10 μmol/L CAPE顯著降低細(xì)胞活力，而CAPE濃度為7.5、5、2.5、2、1 μmol/L時(shí)，HepG2細(xì)胞的活力均保持在98%以上，因此，確定調(diào)節(jié)脂代謝的CAPE濃度為1～7.5 μmol/L。采用油紅O染色觀察各組細(xì)胞脂滴積累情況，并于490 nm波長處測定其吸光度。和NCD組相比，HFD組油紅O染色效果變化顯著（圖1），說明油酸誘導(dǎo)高脂肪模型建模成功。根據(jù)染色效果及吸光度結(jié)果分析，在CAPE濃度為2.5 μmol/L時(shí)，其對(duì)脂質(zhì)積累的抑制效果最為顯著。對(duì)改善脂肪積累效果最佳的處理組和高脂肪組（即2.5 μmol/L CAPE組和HFD組）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，并對(duì)2 組細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色以確定處理效果，結(jié)果如圖2A、B所示。和HFD組相比，CAPE 2.5組細(xì)胞脂肪積累水平顯著降低。進(jìn)一步測定破碎細(xì)胞中TG及T-CHO水平，經(jīng)過蛋白校準(zhǔn)后的細(xì)胞TG和T-CHO水平變化如圖2C、D所示。與HFD組對(duì)比，CAPE 2.5組細(xì)胞中TG水平有明顯的下降趨勢，但CAPE處理對(duì)于膽固醇代謝調(diào)節(jié)效果不顯著，這進(jìn)一步證明CAPE干預(yù)具有明顯緩解高脂細(xì)胞模型中脂滴積累的效果。

圖1 經(jīng)CAPE處理的HepG2細(xì)胞染色觀察及吸光度Fig.1 Observation and absorbance of stained HepG2 cells treated with CAPE

圖2 經(jīng)2.5 μmol/L CAPE處理HepG2細(xì)胞的染色及指標(biāo)檢測Fig.2 Observation and characterization of stained HepG2 cells treated with 2.5 μmol/L CAPE

2.2 經(jīng)CAPE處理的HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序及DEGs分析

對(duì)CAPE處理的HepG2細(xì)胞與高脂肪組細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序及DEGs分析，CAPE組和HFD組經(jīng)過過濾后的序列數(shù)量（即clean reads數(shù)目）分別有47 575 973 條和47 867 835 條，所占比例分別為96.07%和96.03%，根據(jù)經(jīng)CAPE處理的HepG2細(xì)胞中基因表達(dá)的變化情況，共篩選出3 270 個(gè)DEGs。其中，表達(dá)上調(diào)的DEGs有1 351 個(gè)，表達(dá)下調(diào)的DEGs有1 919 個(gè)，DEGs表達(dá)模式聚類見圖3。

圖3 DEGs表達(dá)模式聚類Fig.3 Clustering analysis of DEGs expression pattern

2.3 經(jīng)CAPE處理的HepG2細(xì)胞DEGs KEGG通路功能注釋及富集分析

為進(jìn)一步明確DEGs的功能，對(duì)HFD組及CAPE組之間的DEGs進(jìn)行KEGG功能注釋分析。如圖4所示，DEGs分別注釋到代謝、遺傳信息的處理、環(huán)境信息處理、細(xì)胞過程、有機(jī)系統(tǒng)和人類疾病中。經(jīng)CAPE處理的HepG2高脂肪模型細(xì)胞的DEGs在脂代謝上有相關(guān)注釋，說明脂代謝相關(guān)基因在CAPE的影響下產(chǎn)生差異性表達(dá)。

圖4 KEGG通路功能注釋分析Fig.4 Functional annotation analysis of KEGG pathways

前15 條顯著富集的KEGG通路如表1所示，表中比例表示相應(yīng)KEGG通路在目標(biāo)基因集中所占比例，分子為基因集中富集到該KEGG通路的基因或轉(zhuǎn)錄本數(shù)目，分母為該基因集中具有KEGG注釋的基因或轉(zhuǎn)錄本總數(shù)目，將P＜0.05定義為該功能顯著富集，可以發(fā)現(xiàn)顯著富集的通路主要集中在代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)上。對(duì)DEGs進(jìn)行KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)DEGs主要參與果糖和甘露糖代謝（fructose and mannose metabolism）、糖酵解/糖異生（glycolysis/gluconeogenesis）、HIF-1信號(hào)通路（HIF-1 signaling pathway）、脂肪酸降解（fatty acid degradation）等。進(jìn)一步分析KEGG通路中與脂質(zhì)代謝和氧化應(yīng)激相關(guān)的主要富集信號(hào)通路基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)，在HIF-1α信號(hào)通路上DEGs顯著富集，推測CAPE通過HIF-1α通路改善高脂誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激，從而改善脂代謝紊亂和氧化應(yīng)激壓力；另外，多個(gè)脂肪酸降解通路相關(guān)關(guān)鍵基因表達(dá)量差異顯著，脂肪酸代謝上游調(diào)控基因PPARα表達(dá)也發(fā)生上調(diào)，而PPARα信號(hào)通路與脂肪酸分解代謝[30-31]關(guān)系密切。與GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）[21]靶點(diǎn)預(yù)測結(jié)果一致，CAPE對(duì)肝臟細(xì)胞具有多個(gè)作用靶點(diǎn)，其通過與靶點(diǎn)的相互作用調(diào)節(jié)脂代謝相關(guān)的多個(gè)代謝通路。Sun Lulu等[14]所進(jìn)行的小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CAPE能夠調(diào)節(jié)不同組織脂代謝的多個(gè)信號(hào)通路以及脂肪合成的一系列關(guān)鍵基因的表達(dá)，改善高脂膳食小鼠脂代謝紊亂，說明CAPE對(duì)脂代謝調(diào)節(jié)具有多靶點(diǎn)作用。

2.4 CAPE調(diào)節(jié)HepG2細(xì)胞HIF-1α通路改善氧化應(yīng)激

轉(zhuǎn)錄組DEGs分析顯示，CAPE處理能上調(diào)高脂誘導(dǎo)細(xì)胞的HIF-1α基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平（提高了0.326 倍），并且顯著調(diào)節(jié)HIF-1α下游厭氧呼吸等通路基因PDK1、HK1、PFKP、PFKFB3、LDHA、ALDOC、ENO1、PGK1、EGLN3的表達(dá)（表2），表明CAPE處理能調(diào)節(jié)HIF-1α通路。另外，CAPE組細(xì)胞RTK、MEK、elf4E相關(guān)基因表達(dá)相較于高脂肪組分別上升了1.5、1.37、1.2 倍，且4E-BP1表達(dá)量下降了42%，表明CAPE可能通過MEK-ERK-4E-BP1-elf4E通路上調(diào)HIF-1α的表達(dá)（圖5）。計(jì)算機(jī)輔助預(yù)測發(fā)現(xiàn)，mTOR和MAPK相關(guān)的蛋白激酶為CAPE的潛在作用靶點(diǎn)，表明CAPE分子能通過與潛在靶點(diǎn)相互作用，影響HIF-1α蛋白翻譯表達(dá)。進(jìn)一步分析顯示，CAPE組中參與HIF-1α泛素化降解通路的基因PHD表達(dá)量降低，表明CAPE處理能抑制泛素化介導(dǎo)的HIF-1α蛋白降解，提高HIF-1α蛋白積累水平。因此，CAPE處理能調(diào)節(jié)HIF-1α的翻譯和泛素化降解，促進(jìn)機(jī)體無氧呼吸的進(jìn)程，緩解高脂處理細(xì)胞的氧化應(yīng)激壓力。氧化應(yīng)激在脂代謝紊亂及相關(guān)疾病中的重要作用備受矚目[32]。研究表明，機(jī)體氧化應(yīng)激的增加常伴隨脂質(zhì)的異常堆積加劇以及脂質(zhì)從頭合成的顯著改變[33]。另外，活性氧和炎癥誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激能夠?qū)е轮|(zhì)過氧化、線粒體和過氧化物酶體的脂肪酸氧化功能損傷，并促進(jìn)細(xì)胞因子釋放，進(jìn)一步加劇炎癥和肝細(xì)胞纖維化，這是酒精性脂肪肝和其他肝臟疾病的主要發(fā)展機(jī)制[34]。

表2 HIF-1α通路DEGs表達(dá)Table 2 Expression of DEGs associated with HIF-1α signaling pathway

圖5 CAPE調(diào)節(jié)HIF-1α通路的潛在機(jī)制分析Fig.5 Analysis of the underlying mechanism of CAPE regulation of HIF-1α signaling pathway

2.5 CAPE調(diào)節(jié)HepG2細(xì)胞脂肪酸分解代謝通路

經(jīng)KEGG信號(hào)通路基因差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，CAPE能改善高脂HepG2細(xì)胞的脂肪酸分解代謝和PPARα信號(hào)通路相關(guān)多個(gè)基因的表達(dá)（表3）。PPARα通路參與調(diào)節(jié)脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)、脂肪酸氧化[35]、脂肪酸降解及膽固醇代謝等重要脂代謝通路。如圖6所示，相較于高脂肪組，CAPE組細(xì)胞PPARα下游與脂肪酸氧化代謝相關(guān)的蛋白表達(dá)量明顯上升，如肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶I（carnitine palmotoyltransferase I，CPT1）和肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶II（carnitine palmotoyltransferase II，CPT2），其中調(diào)控CPT1、CPT2、PPARα表達(dá)的CPT1A、CPT2、PPARα基因分別上調(diào)了1.039、0.755、0.661 倍，調(diào)控脂肪酸結(jié)合蛋白5表達(dá)的FABP5基因上調(diào)了1.598 倍，表明CAPE處理促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的活化進(jìn)程。另外，CAPE組高脂誘導(dǎo)細(xì)胞脂肪酸β氧化進(jìn)程相關(guān)酶基因表達(dá)上調(diào)，在脂肪酸β氧化的氧化、水合、脫氫、硫解[36]4 個(gè)過程中，調(diào)控?；o酶A脫氫酶（acyl-coenzyme A dehydrogenase，ACADM）合成的基因ACADM表達(dá)量上升了0.38 倍，編碼長鏈酰基輔酶A脫氫酶（acyl coenzyme a dehydrogenase very long chain，ACADVL）合成的基因ACADVL表達(dá)量上升了0.39 倍；調(diào)控烯醇輔酶A水合酶S1（enoylcoenzyme A hydratase S1，ECHS1）和烯酰輔酶A 水合酶（hydroxyacyl-coenzyme A dehydrogenase，HADHA）合成的基因ECHS1及HADHA表達(dá)量分別升高了0.2 倍和0.31 倍；調(diào)控L-β-羥脂酰CoA脫氫酶（hydroxyacylcoenzyme A dehydrogenase，HADH）合成基因HADH表達(dá)量提高了1.42 倍；編碼脂酰CoA硫解酶（cetyl-coenzyme A acyltransferase，ACAA）合成的基因ACAA1和ACAA2表達(dá)量分別沒有變化和提高了0.47 倍，促進(jìn)了長鏈脂肪酸的氧化分解。由此可知，CAPE處理可能通過PPARα通路和脂肪酸β氧化通路改善高脂誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)的脂代謝。

表3 PPARα通路DEGs表達(dá)Table 3 Expression of DEGs associated with PPARα signaling pathway

圖6 CAPE調(diào)節(jié)脂肪酸分解的潛在通路分析Fig.6 Analysis of the underlying pathways of CAPE regulation of fatty acid breakdown

對(duì)CAPE調(diào)節(jié)脂代謝作用具體機(jī)制的研究表明，可能存在多種作用靶點(diǎn)和調(diào)節(jié)通路以及組織和細(xì)胞特異性[37]。遲樂[15]對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，CAPE通過調(diào)節(jié)PPAR-γ、CEBPα和TGF-β信號(hào)通路影響脂肪合成，抑制脂質(zhì)合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和下游相關(guān)因子的表達(dá)，發(fā)揮抗肥胖的作用。Nie Jiarui等[16]研究發(fā)現(xiàn)，CAPE可通過抑制糖尿病小鼠和HepG2細(xì)胞模型的JNK和NF-κB炎癥信號(hào)通路改善胰島素抵抗和糖脂代謝。最近有研究表明，CAPE能顯著抑制小鼠腸道菌群膽鹽水解酶（bile salt hydrolase，BSH）活性，提高膽汁酸中牛磺β-鼠膽酸含量，從而選擇性抑制膽汁酸法尼醇X受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR），抑制高脂膳食引起的神經(jīng)酰胺含量升高和脂肪生成，同時(shí)改善胰高血糖素樣肽-1（glucagonlike peptide-1，GLP-1）分泌，改善小鼠NAFLD[38]。另外，金銘等[39]利用25-羥固醇（25-hydroxycholesterol，25-OHC）通過14-3-3η信號(hào)蛋白研究蛋白組磷酸化修飾作用誘導(dǎo)肝臟上皮L02細(xì)胞的脂代謝紊亂，發(fā)現(xiàn)CAPE可通過泛素化依賴途徑促進(jìn)14-3-3η信號(hào)蛋白降解，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)25-OHC誘導(dǎo)的肝臟細(xì)胞脂代謝紊亂。有別于小鼠實(shí)驗(yàn)以及脂肪細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)研究，本研究采用HepG2細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)和轉(zhuǎn)錄組測序高通量篩選方法，進(jìn)一步分析CAPE對(duì)脂肪酸誘導(dǎo)的高脂肪模型細(xì)胞的直接作用靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，CAPE對(duì)肝細(xì)胞同樣具有多重靶點(diǎn)，與脂代謝相關(guān)的作用通路包括調(diào)節(jié)HIF-1α通路（緩解高脂細(xì)胞氧化應(yīng)激）和脂肪酸分解代謝通路。CAPE通過調(diào)節(jié)HIF-1α的翻譯和泛素化降解，促進(jìn)機(jī)體無氧呼吸的進(jìn)程，緩解高脂處理細(xì)胞的氧化應(yīng)激壓力，改善細(xì)胞代謝微環(huán)境和脂代謝紊亂；CAPE處理可能通過調(diào)節(jié)PPARα通路和脂肪酸β氧化通路多個(gè)關(guān)鍵基因表達(dá)從而改善高脂誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)的脂代謝。

3 結(jié) 論

CAPE對(duì)細(xì)胞脂代謝的改善機(jī)制和關(guān)鍵靶基因的研究并不完善，本研究結(jié)果顯示，CAPE可以顯著影響油酸誘導(dǎo)的HepG2高脂肪模型細(xì)胞的基因表達(dá)譜，表明CAPE調(diào)節(jié)脂代謝的靶點(diǎn)具有多重性。KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果表明，CAPE的主要調(diào)節(jié)通路包括HIF-1α通路和脂肪酸降解通路，CAPE處理促進(jìn)高脂細(xì)胞模型中HIF-1α的表達(dá)，并抑制了HIF-1α蛋白的泛素化降解，通過對(duì)下游調(diào)節(jié)基因表達(dá)的調(diào)控，緩解肝細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激并改善細(xì)胞微環(huán)境。此外，受CAPE影響的高脂細(xì)胞模型PPARα通路被激活，與脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)和氧化代謝相關(guān)的CPT1、CPT2等蛋白表達(dá)量升高，表明CAPE也可通過PPARα通路調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂肪酸氧化分解，改善脂代謝。本研究為CAPE調(diào)節(jié)脂代謝的分子機(jī)制研究提供了一定的理論依據(jù)，為膳食干預(yù)高脂膳食引起的脂代謝紊亂提供參考。