金屬抗菌肽SIF4對大腸桿菌呼吸代謝與能量代謝的抑制機(jī)理

李玉珍，肖懷秋,,*，劉 淼，王 琳，曾夢琪，趙謀明

（1.湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院制藥與生物工程學(xué)院，湖南 株洲 412000；2.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510000）

肉制品和乳制品等食品因富含蛋白質(zhì)、多糖和脂質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)而易受到食源性致病菌與腐敗菌的生物污染，特別是大腸桿菌，其引發(fā)的食源性疾病已成為當(dāng)前食品公共衛(wèi)生主要威脅之一，食源性大腸桿菌的生物防控是現(xiàn)代食品安全領(lǐng)域的研究熱點[1-2]。糖酵解途徑（Embden-Meyerhof pathway，EMP）和三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA）是大多數(shù)生物共有的基本代謝途徑，不僅是物質(zhì)代謝中樞途徑，也是能量代謝關(guān)鍵途徑[3]。葡萄糖可經(jīng)EMP和TCA氧化并產(chǎn)生大量能量，或經(jīng)磷酸戊糖途徑（hexose monophosphate pathway，HMP）降解生成6-磷酸葡萄糖并產(chǎn)生還原型輔酶（coenzyme，Co）I和CoII[4-5]。EMP、TCA和HMP是大腸桿菌最重要的3 條呼吸代謝產(chǎn)能途徑，菌體呼吸代謝水平是菌體代謝活力的重要體現(xiàn)，呼吸代謝受到抑制可影響菌體能量與物質(zhì)代謝生物進(jìn)程[6-7]。戴錦銘[8]研究發(fā)現(xiàn)，山蒼子精油可通過抑制TCA途徑實現(xiàn)對大腸桿菌O157:H7的呼吸抑制。大腸桿菌能量代謝關(guān)鍵酶主要錨定在細(xì)胞質(zhì)膜上或分布在細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞質(zhì)膜參與呼吸氧化產(chǎn)能等關(guān)鍵代謝過程，是維持細(xì)胞生理機(jī)能的重要膜基質(zhì)載體[9]，離子跨膜轉(zhuǎn)運也是細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和物質(zhì)轉(zhuǎn)運的生化基礎(chǔ)，胞內(nèi)離子保持穩(wěn)態(tài)對菌體能量與物質(zhì)代謝極為重要[10]，如細(xì)胞質(zhì)膜離子通道Na＋K＋-ATP酶和Ca2＋Mg2＋-ATP酶對維持細(xì)胞質(zhì)膜通透性、低鈉高鉀環(huán)境、細(xì)胞靜息電位及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有重要意義[11-12]。李婷等[13]研究了姜厚樸水提物對大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)膜離子通道ATP酶的影響，發(fā)現(xiàn)姜厚樸水提物作用4 h后Na＋K＋-ATP酶活性顯著上升，可能與應(yīng)激適應(yīng)有關(guān)。胞內(nèi)ATP含量變化能直接反映菌體存活狀態(tài)[14]。戴錦銘[8]研究發(fā)現(xiàn)，山蒼子精油可導(dǎo)致大腸桿菌O157:H7胞內(nèi)ATP合成速度降低或水解程度增強(qiáng)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，金屬抗菌肽SIF4為金屬陽離子抗菌肽，具有較好的胃腸耐受性和熱穩(wěn)定性，對大腸桿菌具有較好抑菌活性，對大腸桿菌最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）為0.4 mg/L[15]，對EMP和TCA關(guān)鍵酶有不同程度的抑制作用，可造成細(xì)胞質(zhì)膜氧化損傷和誘導(dǎo)氧化應(yīng)激產(chǎn)生過量活性氧自由基，破壞細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)與功能[16]，但SIF4對大腸桿菌菌體呼吸代謝及能量代謝抑制機(jī)理尚未可知。鑒于EMP和TCA代謝的普遍性及其對大腸桿菌能量生成的重要性，本實驗著重從EMP和TCA視角分析金屬抗菌肽SIF4對大腸桿菌呼吸代謝和能量代謝的影響，以期為SIF4在食源性大腸桿菌的生物防控提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金屬抗菌肽SIF4由本課題組自制[15]；大腸桿菌ATCC25922購自菌種保藏中心；刃天青 上海源葉生物科技有限公司；碘乙酸、丙二酸、磷酸鈉、TritionX-100國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；ATP含量測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；Na＋K＋-ATP酶和Ca2＋Mg2＋-ATP酶試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；溶菌酶 南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2600紫外-可見分光光度計 日本島津公司；多功能酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；超聲細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物有限公司；高速冷凍離心機(jī) 湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；便攜式微量溶氧儀 北京恒奧德儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌體新陳代謝活力分析

參考Magnani等[17]方法并修改。將活化菌種接種至牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37 ℃、120 r/min培養(yǎng)12 h，8 000 r/min離心10 min，無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.03 mol/L、pH 7.2，下同）洗滌并重懸。取4 份菌懸液，分別加入SIF4使其終質(zhì)量濃度為1/2 MIC、MIC和2 MIC（MIC為0.4 mg/L，通過前期研究[15]確定），以不添加SIF4組為陰性對照。將刃天青溶液加入各菌懸液中（終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%），37 ℃避光振蕩培養(yǎng)2 h，使其充分?jǐn)U散至胞內(nèi)。取等量樣品離心（10 000 r/min、4 min）后取上清液，用多功能酶標(biāo)儀測定熒光強(qiáng)度，激發(fā)和發(fā)射波長分別設(shè)置為560 nm和590 nm。通過測定對照孔與刃天青無菌去離子水溶液熒光強(qiáng)度進(jìn)行背景修正。

1.3.2 菌體呼吸代謝途徑分析

當(dāng)抗菌肽與典型呼吸抑制劑所抑制的主要呼吸代謝途徑差異越大時，由于增效作用，疊加率會越高，反之亦然[18]，因此，當(dāng)金屬抗菌肽SIF4與典型抑制劑作用于不同代謝途徑時，存在協(xié)同增效作用，疊加率會增大，而若金屬抗菌肽SIF4與典型抑制劑作用于同一呼吸代謝途徑時，無協(xié)同增效作用，疊加率較小，可通過疊加率判斷SIF4作用的呼吸代謝途徑。測定對照組初始呼吸速率（R0）和SIF4＋碘乙酸、SIF4＋丙二酸和SIF4＋磷酸鈉等組別呼吸速率（R1），計算呼吸抑制率（inhibition rate，IR）以評價對菌體的呼吸抑制率，計算各組別呼吸疊加率（superposing rate，SR）以判定菌體的呼吸代謝抑制途徑[8]。

1.3.2.1 初始呼吸速率測定

在離心管中加入3.6 mL無菌PBS、0.4 mL 1%葡萄糖溶液和1 mL大腸桿菌菌液（106CFU/mL），充分?jǐn)嚢? min；將離心管用封口膜包裹形成封閉系統(tǒng)并靜置1 min以制備初始反應(yīng)體系，體系穩(wěn)定后利用便攜式微量溶氧儀測定菌懸液溶氧量/（μmol O2/g），計算呼吸速率R0/（μmol O2/（g·min））。

1.3.2.2 呼吸抑制率測定

在離心管中分別加入3.6 mL PBS、0.4 mL 1%葡萄糖溶液和1 mL大腸桿菌菌液，再分別加入3 種典型呼吸抑制劑（碘乙酸、丙二酸、磷酸鈉，終質(zhì)量濃度為500 mg/L）、SIF4（終質(zhì)量濃度分別為1/2 MIC、MIC和2 MIC），攪拌5 min后，將離心管用封口膜包裹形成一個封閉系統(tǒng)并靜置1 min，待體系穩(wěn)定后利用便攜式微量溶氧儀測定菌懸液溶氧量/（μmol O2/g），計算呼吸速率R1/（μmol O2/（g·min）），并按式（1）計算IR[8]。

1.3.2.3 呼吸疊加率測定

在離心管中分別加入3.6 mL PBS溶液、0.4 mL 1%葡萄糖溶液、1 mL大腸桿菌菌液和SIF4（終質(zhì)量濃度分別為1/2 MIC、MIC和2 MIC），充分?jǐn)嚢? min后將離心管用封口膜包裹形成一個封閉系統(tǒng)并靜置1 min，待體系穩(wěn)定后利用便攜式微量溶氧儀測定菌懸液溶氧量/（μmol O2/g），計算呼吸速率R1。隨后分別加入碘乙酸、丙二酸、磷酸鈉（終質(zhì)量濃度為500 mg/L），在密閉系統(tǒng)中利用便攜式微量溶氧儀測定菌懸液溶氧量/（μmol O2/g），計算呼吸速率R2，并按式（2）計算SR[8]。

式 中：R1為S I F4處 理 后 菌 體 呼 吸 速率/（μmol O2/（g·min））；R2為添加典型抑制劑后菌體呼吸速率/（μmol O2/（g·min））。

1.3.3 細(xì)胞質(zhì)膜離子通道ATP酶活力的測定

參考李婷等[13]的方法并修改。將對數(shù)生長期菌體以2%接種量接種至含SIF4（終質(zhì)量濃度分別為0 MIC、1/2 MIC、MIC和2 MIC）的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，以TritionX-100處理組（終質(zhì)量濃度為100 mg/L，下同）為陽性對照，37 ℃、120 r/min培養(yǎng)12 h，每4 h取10 mL培養(yǎng)液，于4 000 r/min離心10 min，收集菌體沉淀，PBS洗滌3 次并重懸，超聲細(xì)胞破碎儀破碎（超聲功率200 W，超聲3 s，間隔10 s，重復(fù)30 次，下同），8 000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清液置冰浴中待測。按試劑盒說明測定Na＋K＋-ATP和Ca2＋Mg2＋-ATP酶活力。

1.3.4 胞內(nèi)ATP生物合成分析

參考毛雪芳[19]的方法并修改。按2%接種量接種對數(shù)生長期菌體到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)中，37 ℃、120 r/min培養(yǎng)12 h，4 ℃、6 000 r/min離心10 min，收集菌體沉淀，用無菌PBS洗滌3 次，加入牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基重懸至OD600nm＝2.0。取4 份菌懸液并加入SIF4使其終質(zhì)量濃度分別為0 MIC、1/2 MIC、MIC和2 MIC，37 ℃、120 r/min培養(yǎng)12 h，每4 h取樣1 mL，以0 MIC組為陰性對照，以TritionX-100組為陽性對照。取1 mL細(xì)胞培養(yǎng)液用福林-酚法測定菌體蛋白質(zhì)量濃度。取1 mL SIF4處理菌懸液，添加500 μL溶菌酶（10 mg/mL）和500 μL TE緩沖液混勻，37 ℃保溫20 min。加入3 mL無菌PBS稀釋后進(jìn)行冰浴間隔超聲破碎，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，收集上清液，用試劑盒測定胞內(nèi)ATP含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n＝3）表示，采用SPSS 25.0軟件中單因素方差檢驗進(jìn)行組內(nèi)或組間均數(shù)差異多重比較（以P＜0.05表示差異顯著），方差齊性時采用最小顯著性差異法，非齊性時使用塔姆黑尼T2法。

2 結(jié)果與分析

2.1 對菌體新陳代謝活力的影響

刃天青為氧化還原指示劑，可被胞內(nèi)氧化還原酶不可逆還原為試鹵靈，使其從初始的深藍(lán)色弱熒光轉(zhuǎn)變?yōu)榉奂t色強(qiáng)熒光并彌散至培養(yǎng)基，其不可逆還原程度與細(xì)胞新陳代謝活力呈正相關(guān)[20]。SIF4對大腸桿菌細(xì)胞代謝活力影響如圖1所示。

圖1 SIF4對大腸桿菌新陳代謝活力的影響Fig.1 Effect of SIF4 on cell metabolic activity

從圖1可看出，對照組（0 MIC組）菌體新陳代謝活力維持在正常水平，并未出現(xiàn)明顯波動，表明菌體能量代謝生產(chǎn)與釋放正常，細(xì)胞新陳代謝活力正常（＞97%）；經(jīng)1/2 MIC、MIC和2 MIC的SIF4處理后，菌體新陳代謝活力顯著下降（P＜0.05），具有新陳代謝活力細(xì)菌占比分別下降至（63.09±2.02）%、（47.45±2.11）%和（28.80±2.03）%，相比對照組，菌體新陳代謝活力分別下降了35.17%、51.23%和70.41%，表明SIF4對大腸桿菌菌體新陳代謝有一定抑制作用。前期研究表明，SIF4可能以“毯式”模型破壞大腸桿菌菌體細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)細(xì)胞質(zhì)膜通透性，并引起細(xì)胞膜去極化[15]，同時，SIF4還可導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)膜氧化損傷并誘導(dǎo)氧化應(yīng)激產(chǎn)生過量自由基，從而破壞細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)與功能[16]。大腸桿菌新陳代謝過程中，為其傳遞能量的電子傳遞鏈主要位于細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)表面，當(dāng)菌體細(xì)胞質(zhì)膜受到SIF4刺激與破壞之后，可能喪失為新陳代謝傳遞能量的功能[17]，因此，菌體代謝活力顯著降低。

2.2 對菌體呼吸代謝途徑抑制的影響

EMP是大腸桿菌最重要的能量與物質(zhì)代謝途徑，在有氧條件下，EMP生成的NADH＋H＋經(jīng)由電子呼吸鏈以氧作為氫受體，最終生成H2O和NAD＋，無氧條件下，可將代謝中間產(chǎn)物（如丙酮酸）還原并生成NAD＋；EMP代謝產(chǎn)生的乙酰輔酶A經(jīng)TCA可徹底氧化為CO2和H2O，并釋放大量能量；6-磷酸葡萄糖可作為HMP代謝起始物，為生物合成提供不同含碳數(shù)的碳骨架和還原力，HMP與EMP共同構(gòu)成細(xì)胞糖分解代謝與有關(guān)合成代謝的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。碘乙酸、丙二酸和磷酸鈉分別是EMP、TCA和HMP途徑的典型標(biāo)準(zhǔn)抑制劑，可抑制相應(yīng)代謝途徑從而降低呼吸代謝速率[21]。磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GPD）為巰基酶，是EMP生成ATP的關(guān)鍵酶，活性中心—SH可被碘乙酸不可逆抑制；琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）是TCA途徑中的重要酶，能催化琥珀酸脫氫生成延胡索酸，并將2H轉(zhuǎn)移生成FADH2，丙二酸為琥珀酸結(jié)構(gòu)類似物，是SDH競爭性抑制劑，為TCA典型抑制劑；6-磷酸葡糖脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD）是HMP途徑關(guān)鍵酶，為四亞基寡聚酶，完全受NADPH/NADP＋的相對比例控制，胞內(nèi)NADPH濃度高，HMP就會受到抑制，反之則被激活，磷酸鈉為HMP途徑典型抑制劑[22]。SIF4與標(biāo)準(zhǔn)呼吸代謝典型抑制劑對大腸桿菌菌體呼吸抑制效果如表1所示。

表1 SIF4及典型抑制劑對大腸桿菌呼吸抑制率的影響Table 1 Inhibitory effects of SIF4 and typical inhibitors on the respiration of Escherichia coli

由 表1 可 看 出，1/2 M I C、M I C 和2 M I C 組SIF4菌體呼吸抑制率分別為（6.692±0.451）%、（19.387±0.168）%和（25.222±0.326）%，呼吸抑制率與處理劑量呈正相關(guān)關(guān)系，且組間差異顯著（P＜0.05）。碘乙酸、丙二酸和磷酸鈉組菌體呼吸抑制率分別為（20.719±0.326）%、（24.047±0.165）%和（23.446±0.157）%，組間有顯著性差異（P＜0.05）。如上文所述，當(dāng)SIF4與典型呼吸抑制劑抑制的主要呼吸代謝途徑相差越大時，由于增效作用，疊加率會越高，反之亦然[18]，因此，若SIF4與典型抑制劑無協(xié)同增效作用，則疊加率較小，可由此判定SIF4的呼吸代謝抑制機(jī)理。SIF4與典型抑制劑復(fù)配對呼吸疊加率的影響如表2所示。

表2 SIF4及典型抑制劑對大腸桿菌呼吸疊加率的影響Table 2 Synergistic inhibitory effect of SIF4 combined with typical inhibitors on the respiration of Escherichia coli

由表2可看出，碘乙酸、丙二酸和磷酸鈉與SIF4復(fù)配的呼吸疊加率分別為（1 9.9 8 2±0.1 3 3）%、（27.207±0.178）%和（33.304±0.566）%，碘乙酸和SIF4復(fù)配的呼吸疊加率最低，表明SIF4很可能通過抑制EMP影響菌體能量與物質(zhì)代謝。前期研究發(fā)現(xiàn)，SIF4主要通過抑制大腸桿菌EMP的已糖激酶活性來表現(xiàn)高抗菌活性[16]，本研究結(jié)果與前期研究所發(fā)現(xiàn)糖代謝抑制機(jī)理基本一致。

2.3 對菌體細(xì)胞質(zhì)膜離子通道ATP酶的影響

Na＋K＋-ATP酶和Ca2＋Mg2＋-ATP酶是極其重要的細(xì)胞質(zhì)膜離子通道ATP酶，對維持細(xì)胞質(zhì)膜通透性、結(jié)構(gòu)完整性、低鈉高鉀胞內(nèi)環(huán)境、靜息電位以及信號傳導(dǎo)有重要意義[23-24]，Na＋K＋-ATP酶和Ca2＋Mg2＋-ATP酶的活性受膜流動性影響并受ATP水平調(diào)控[25]。

SIF4對細(xì)胞質(zhì)膜離子通道Na＋K＋-ATP酶活性的影響如圖2所示，經(jīng)SIF4處理后，菌體細(xì)胞質(zhì)膜離子通道Na＋K＋-ATP酶活力與對照組相比均顯著降低（P＜0.05），1/2 MIC組、MIC和2 MIC組處理8 h時Na＋K＋-ATP酶活力比處理4 h時均有所上升，分別從（30.47±0.92）、（23.69±0.86）、（21.67±0.95）U/mg上升至（31.80±0.91）、（26.03±0.72）、（23.99±0.44）U/mg，特別是MIC組和2 MIC組，組內(nèi)差異均顯著（P＜0.05）；8 h后Na＋K＋-ATP酶活力均顯著下降，可能是由于SIF4處理前期菌體為應(yīng)激適應(yīng)階段，通過增加細(xì)胞質(zhì)膜離子通道ATP酶活力來增強(qiáng)菌體呼吸代謝和抵御外界不利環(huán)境[16]；金屬抗菌肽SIF4為金屬陽離子抗菌肽，帶正電荷，可與革蘭氏陰性菌細(xì)胞膜上脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）通過靜電吸附作用結(jié)合于細(xì)胞膜脂質(zhì)膜中，從而牽引整個抗菌肽分子進(jìn)入質(zhì)膜，擾亂質(zhì)膜上蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的有序排列，通過“位移”而聚合形成跨膜通道，從而破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性并導(dǎo)致胞內(nèi)容物外溢，進(jìn)而起到抑菌作用[16]，推斷細(xì)胞質(zhì)膜是SIF4重要的抑菌效應(yīng)靶點。TritonX-100組隨處理時間延長，細(xì)胞質(zhì)膜離子通道Na＋K＋-ATP酶活力顯著下降，處理12 h時，Na＋K＋-ATP酶活力由初始的（39.03±1.00）U/mg顯著降低至（2.41±0.67）U/mg（P＜0.05），降幅為93.83%，主要是由于TritonX-100為具有親水和疏水基團(tuán)的非離子型去垢劑，可將膜蛋白從細(xì)胞質(zhì)膜解離，破壞細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)并增強(qiáng)膜通透性[26]。細(xì)胞質(zhì)膜受損會影響能量代謝和膜內(nèi)外質(zhì)子濃度差[17]，并影響Na＋K＋-ATP酶活性，使基于細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運代謝無法完成并誘導(dǎo)細(xì)胞提前程序性凋亡[15]。

圖2 SIF4對大腸桿菌Na＋K＋-ATP酶活力的影響Fig.2 Effect of SIF4 on Na+K+-ATPase activity in Escherichia coli

SIF4對細(xì)胞質(zhì)膜離子通道Ca2＋Mg2＋-ATP酶活力影響如圖3所示，對照組Ca2＋Mg2＋-ATP酶活力穩(wěn)定，無明顯波動（P＞0.05）。SIF4處理8 h后，與處理4 h相比，1/2 MIC和MIC組Ca2＋Mg2＋-ATP酶活力略有上升，2 MIC組則呈下降趨勢。SIF4處理12 h時，1/2 MIC、MIC和2 MIC組Ca2＋Mg2＋-ATP酶活力由初始的（27.55±0.88）U/mg分別降至（20.27±0.58）、（14.30±0.74）U/mg和（7.65±0.53）U/mg（P＜0.05），降幅分別為26.42%、48.09%和72.23%，可能是由于SIF4破壞了細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，改變了細(xì)胞質(zhì)膜通透性，使胞內(nèi)Ca2＋、Mg2＋、Na＋、K＋等離子泄露，破壞了膜內(nèi)外離子電動勢，從而使細(xì)胞質(zhì)膜離子通道Ca2＋Mg2＋-ATP酶活力顯著下降[15-16]；此外，1/2 MIC和MIC組出現(xiàn)短暫Ca2＋Mg2＋-ATP酶活力升高現(xiàn)象，隨后Ca2＋Mg2＋-ATP酶活力顯著降低，可能與菌體應(yīng)激適應(yīng)有關(guān)[27]。有研究表明，胞內(nèi)Ca2＋過量可損害能量系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能，誘導(dǎo)產(chǎn)生過量自由基并導(dǎo)致組織與細(xì)胞損傷[28]，因此，Ca2＋Mg2＋-ATP酶活性與細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)完整及細(xì)胞質(zhì)膜氧化損傷有一定關(guān)系[16]。本研究還發(fā)現(xiàn)，TritonX-100組Ca2＋Mg2＋-ATP酶活力組內(nèi)差異顯著（P＜0.05），這與其具有很強(qiáng)的細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)破壞作用和影響細(xì)胞質(zhì)膜通透性能力有關(guān)[26]。

圖3 SIF4對大腸桿菌Ca2＋Mg2＋-ATP酶活力的影響Fig.3 Effect of SIF4 on Ca2+Mg2+-ATPase activity in Escherichia coli

2.4 對菌體胞內(nèi)ATP生物合成的影響

當(dāng)細(xì)胞質(zhì)膜受損或細(xì)胞凋亡時，胞內(nèi)ATP含量迅速下降，ATP含量變化能直接反映菌體存活狀態(tài)[14]。由圖4可看出，初始階段組間胞內(nèi)ATP含量無顯著差異（P＞0.05）。處理4 h時，實驗組與對照組均存在顯著差異（P＜0.05），但1/2 MIC與MIC組、MIC與2 MIC組組間無顯著性差異（P＞0.05），而1/2 MIC與2 MIC組存在顯著性差異（P＜0.05），可能與1/2 MIC組處理劑量較低和處理時間過短有關(guān)；處理8 h和12 h時，組間均存在顯著差異（P＜0.05）。本研究還發(fā)現(xiàn)，對照組培養(yǎng)0～12 h時，胞內(nèi)ATP酶含量由初始（46.13±0.70）×10-6μmol/g上升至（67.82±0.70）×10-6μmol/g，增幅為47.02%，可能與菌體代謝旺盛，需要大量ATP為菌體物質(zhì)代謝提供能量來源和碳骨架等中間體，以及菌體處于對數(shù)生長期等因素有關(guān)[29-30]。TritonX-100組胞內(nèi)ATP酶含量呈明顯降低的趨勢，從初始的（46.13±0.70）×10-6μmol/g下降至處理12 h時的（6.09±0.72）×10-6μmol/g，降幅達(dá)到86.80%，這與TritonX-100有較強(qiáng)的細(xì)胞質(zhì)膜裂解能力有關(guān)[26]；SIF4處理后，除呼吸代謝受到抑制外，胞內(nèi)ATP含量也呈下降趨勢，特別是2 MIC組對胞內(nèi)ATP合成抑制最為明顯，胞內(nèi)ATP含量減少可能與ATP合成速率降低或胞內(nèi)ATP水解加速有關(guān)，或與細(xì)胞質(zhì)膜高度受損導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)膜錨定的能量代謝酶功能受損、細(xì)胞質(zhì)膜滲透性增加以及生物氧化與電子傳遞鏈不可逆受損[16]等有關(guān)，本研究結(jié)果與Santos[31]和Chingaté[32]等報道結(jié)果相似。

圖4 SIF4對大腸桿菌胞內(nèi)ATP含量的影響Fig.4 Effect of SIF4 on intracellular ATP concentration of Escherichia coli

3 結(jié) 論

本實驗研究了SIF4對菌體新陳代謝活力、呼吸代謝途徑、細(xì)胞質(zhì)膜離子通道ATP酶及胞內(nèi)ATP生物合成的影響。結(jié)果表明，金屬抗菌肽SIF4處理可顯著降低菌體新陳代謝活力（P＜0.05），經(jīng)2 MIC SIF4處理后，新陳代謝活力降低了70.41%；SIF4對菌體有較好的呼吸抑制作用，MIC和2 MIC組呼吸抑制率分別高達(dá)（19.39±0.17）%和（25.22±0.32）%；呼吸疊加率分析結(jié)果表明，SIF4可能通過抑制EMP影響菌體呼吸代謝；此外，SIF4處理后，大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)膜離子通道Na＋K＋-ATP酶和Ca2＋Mg2＋-ATP酶活力顯著降低（P＜0.05），推斷細(xì)胞質(zhì)膜是SIF4重要的抑菌效應(yīng)靶點；處理8 h和12 h時，實驗組組間胞內(nèi)ATP含量均存在顯著差異（P＜0.05），胞內(nèi)ATP含量降幅最明顯，特別是2 MIC組，可能與細(xì)胞質(zhì)膜受損、ATP合成減少或消耗增加、細(xì)胞質(zhì)膜通透性增加等因素有關(guān)。