HPLC法同時(shí)檢測(cè)抗癢醑中苯酚和水楊酸的含量

吳小純 張韞琪 黃久遂

廣州市皮膚病防治所 廣東廣州 510095

抗癢醑是廣州市皮膚病防治所的所內(nèi)制劑,由苯酚、水楊酸、薄荷腦和乙醇制成的酊劑。適用于皮膚瘙癢、蚊蟲叮咬等癥。本品中水楊酸具有溶解角質(zhì)、止癢和抗真菌作用[1-3]。苯酚具有抗菌作用,但同時(shí)苯酚還有較強(qiáng)的刺激和腐蝕作用[4-5],濃度過(guò)高可能會(huì)產(chǎn)生皮膚過(guò)敏等不良反應(yīng),為保證制劑的質(zhì)量和用藥安全,應(yīng)重視對(duì)苯酚濃度的監(jiān)測(cè)。該制劑現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為自擬標(biāo)準(zhǔn),實(shí)驗(yàn)過(guò)程復(fù)雜,分析速度較慢,消耗較多試劑,干擾因素較多。為了更好地控制產(chǎn)品的質(zhì)量,提高其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),本文參考相關(guān)文獻(xiàn)[6-10],采用高效液相色譜法,建立可同時(shí)測(cè)定苯酚、水楊酸含量的方法,并進(jìn)行方法學(xué)的研究,為該制劑探索新的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 儀器和試劑

1.1 儀器

UltiMate 3000液相色譜儀(配備紫外檢測(cè)器):賽默飛有限公司;電子天平MS:梅特勒-托利儀器有限公司;電子天平ME:梅特勒-托利儀器有限公司

1.2 試劑

抗癢醑(廣州市皮膚病防治所,生產(chǎn)批號(hào):20230301、20230302、20230303),缺苯酚陰性樣品(自制),缺水楊酸陰性樣品(自制),缺苯酚和水楊酸空白樣品(自制),乙醇(湖南湘易康制藥股份有限公司,批號(hào):100320221211),苯酚原料(成都華邑藥用輔料制造有限責(zé)任公司,批號(hào)：20220101),水楊酸(華陰市錦前程藥業(yè)有限公司,批號(hào):Y2112050),苯酚對(duì)照品(上海阿拉丁生化科技股份有限公司,99.5%,批號(hào):L2007332),水楊酸對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院,99.9%,批號(hào):100106-202106),甲醇(上海阿拉丁生化科技股份有限公司,色譜純,批號(hào):C2112359);冰醋酸(廣東廣試試劑科技有限公司,分析純,批號(hào):2021090213)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱;流動(dòng)相:甲醇-水-冰醋酸(50 ∶50 ∶1);檢測(cè)波長(zhǎng)271 nm,進(jìn)樣體積20 μL;柱溫30 ℃;流速為1.0 mL/min。理論板數(shù)苯酚和水楊酸峰均不低于3 000,苯酚和水楊酸相鄰峰之間的分離度大于1.5,分離度良好。

2.2 供試品溶液與對(duì)照品溶液制備

精密量取本品5 mL,置100 mL量瓶中,用流動(dòng)相釋至刻度,搖勻,精密量取5 mL,置50 mL量瓶中,用流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液(每1 mL供試品中含苯酚0.1 mg、水楊酸0.075 mg)。分別取苯酚25 mg、水楊酸19 mg精密稱定,用流動(dòng)相定量稀釋制成每1 mL含苯酚0.1 mg、水楊酸0.075 mg的混合溶液,作為對(duì)照品溶液。

按上述色譜條件分別進(jìn)樣上述供試品溶液與對(duì)照品溶液各20 μL,進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)圖1～2。

圖1 供試品溶液測(cè)定結(jié)果色譜圖

圖2 對(duì)照品溶液測(cè)定結(jié)果色譜圖

2.3 專屬性考察

按“2.2”項(xiàng)制備供試品溶液與對(duì)照品溶液;精密量取缺苯酚的陰性樣品5 mL,置100 mL量瓶中,用流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻,精密量取5 mL,置50 mL量瓶中,用流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻,作為陰性樣品溶液1;精密量取缺水楊酸的陰性樣品5 mL,置100 mL量瓶中,用流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻,精密量取5 mL,置50 mL量瓶中,用乙腈稀釋至刻度,搖勻,作為陰性樣品溶液2。

照“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣陰性樣品溶液1(缺苯酚)、陰性樣品溶液2(缺水楊酸)、溶劑、對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL,測(cè)定并記錄色譜圖,結(jié)果見(jiàn)圖3～7。

試驗(yàn)結(jié)果表明,供試品溶液在與對(duì)照品溶液各主峰的出峰的位置上有相同的色譜峰出現(xiàn),而溶劑、陰性樣品溶液在與對(duì)照品溶液各主峰的出峰的位置上未見(jiàn)有干擾峰出現(xiàn),方法專屬性良好。

圖3 溶劑色譜圖

圖4 陰性樣品溶液1(缺苯酚)色譜圖

圖5 陰性樣品溶液2(缺水楊酸)色譜圖

圖6 對(duì)照品溶液色譜圖

圖7 供試品溶液色譜圖

2.4 線性和范圍

取苯酚對(duì)照品約25 mg(實(shí)際稱樣量:25.45 mg)、水楊酸對(duì)照品19 mg(實(shí)際稱樣量:19.35 mg),精密稱定,置50 mL量瓶中,用流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻,得每1 mL含苯酚為0.509 mg、水楊酸0.387 mg的混合對(duì)照品貯備液。精密量取上述貯備液2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL,分別置25 mL量瓶中,用流動(dòng)相稀釋至刻度,得每1 mL含苯酚0.040 72 mg、水楊酸0.030 9 6 mg混合對(duì)照品溶液1;含苯酚0.061 08 mg、水楊酸0.046 44 mg混合對(duì)照品溶液2;含苯酚0.081 44 mg、水楊酸0.061 92 mg混合對(duì)照品溶液3;含苯酚0.101 80 mg、水楊酸0.077 4 mg混合對(duì)照品溶液4;含苯酚0.122 16 mg、水楊酸0.092 88 mg混合對(duì)照品溶液 5;含苯酚0.14 252 mg、水楊酸0.108 36 mg混合對(duì)照品溶液6。照“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別注入上述6份對(duì)照液,測(cè)定結(jié)果并記錄色譜圖,以濃度(μL /mL)為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸分析,結(jié)果。得到苯酚線性方程:y=316.83x+0.140 3,R2=0.999 9。得到水楊酸線性方程y=87.528x+0.037 5,R2=0.998 4。

結(jié)果表明,苯酚在0.040 72～0.142 52 mg/mL濃度范圍內(nèi),與峰面積呈良好的線性關(guān)系;水楊酸在0.030 96～0.108 36mg/mL濃度范圍內(nèi),與峰面積呈良好的線性關(guān)系;

2.5 精密度試驗(yàn)

取每1 mL含苯酚為0.102 84 mg、水楊酸為0.078 52 mg的混合對(duì)照品液,照“2.1”項(xiàng)下色譜條件,重復(fù)進(jìn)樣6次,測(cè)定苯酚與水楊酸峰面積,記錄色譜圖,結(jié)果苯酚峰面積RSD為0.1%,水楊酸的峰面積RSD為0.6%。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供批樣品溶液(20230301),按“2.1”項(xiàng)下色譜條件,分別在0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果苯酚的峰面積RSD為0.4%(n=7),水楊酸的峰面積RSD為0.6%(n=7)結(jié)果表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

取抗氧醑陰性樣品(自制),分別加入80%、100%、120%的水楊酸和苯甲酸對(duì)照,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,記錄色譜圖,按外標(biāo)法計(jì)算回收率。高中低三個(gè)濃度苯酚的平均回收率為100.52%,RSD為0.19%;水楊酸的平均回收率為101.11%,RSD為0.45%。

2.8 樣品測(cè)定

取抗癢醑3批樣品(20230301、20230302、20230303),按“2.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積,按外標(biāo)法計(jì)算含量,測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 波長(zhǎng)的確定

對(duì)苯酚和水楊酸對(duì)照品分別在200～400 nm進(jìn)行掃描,結(jié)果苯酚在209 nm和264 nm處有最大吸收,水楊酸在227 nm和300 nm處有最大吸收,參考有關(guān)文獻(xiàn)[11-12],對(duì)比色譜圖,兼顧二者,綜合選定271 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 流動(dòng)相的確定

按2020版《中國(guó)藥典(二部)》收載方法,苯酚的含量測(cè)定是采用滴定法[13]。一些文獻(xiàn)采用HPLC法測(cè)定苯酚選擇相甲醇-醋酸鹽緩沖液系統(tǒng)作為流動(dòng)相和溶劑[14-16],但鹽類緩沖溶液系統(tǒng)容易導(dǎo)致柱效下降,色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定。本試驗(yàn)用的是十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱,故選擇甲醇-水系統(tǒng),摸索實(shí)驗(yàn)考察過(guò)甲醇-水(50 ∶50)和甲醇-水(48 ∶52)比例作為流動(dòng)相和溶劑,峰型不好,無(wú)法積分;不同柱溫(25 ℃ 、30 ℃ 、35 ℃)和不同流速(0.8、1.0、1.2 mL/min)最終結(jié)果顯示,當(dāng)流動(dòng)相以甲醇-水-冰醋酸(50 ∶50 ∶1)比例,檢測(cè)溫度30 ℃;流速1.0 mL/min,溶劑為流動(dòng)相時(shí),苯酚和水楊酸都可以在較短的時(shí)間內(nèi)出峰,苯酚的保留時(shí)間為5.5 min,水楊酸的保留時(shí)間為8.2 min,兩峰的分離度為14,分離度良好。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定抗癢醑中苯酚和水楊酸,方法操作簡(jiǎn)便,準(zhǔn)確,靈敏度高,專屬性強(qiáng),可有效控制本品的質(zhì)量。對(duì)于醫(yī)院制劑抗癢醑的安全性、有效性起到保證作用,為提升抗癢醑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。