液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速檢測刺參中硝基呋喃類代謝物方法

劉 峰，孫遠(yuǎn)遠(yuǎn)，安 萍，張守峰，史德杰

(日照市海洋與漁業(yè)研究院，山東 日照 276800)

硝基呋喃類藥物是一種人工合成的具有5-硝基呋喃基本結(jié)構(gòu)的廣譜抗生素，常見有呋喃唑酮(FZD)、呋喃西林(NFZ)、呋喃妥因(NFT)和呋喃它酮(FTD)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，該類藥物在動物體內(nèi)快速分解產(chǎn)生的代謝物可與動物體內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)合而長時間穩(wěn)定存在，對人體產(chǎn)生“三致”潛在危害(肖曼等，2020)。隨著刺參大規(guī)模人工養(yǎng)殖的發(fā)展，粗放的養(yǎng)殖管理以及高密度養(yǎng)殖等原因?qū)е虏『Φ葐栴}接踵而至。養(yǎng)殖者為控制疾病發(fā)生，使用抗生素等化學(xué)藥物進(jìn)行預(yù)防和治療。盡管硝基呋喃類藥物已被列為水產(chǎn)禁用藥，但通過目前對刺參進(jìn)行的多次質(zhì)量安全檢查發(fā)現(xiàn)，硝基呋喃類代謝物在刺參苗種和市售產(chǎn)品中仍偶有檢出，人們更加重視刺參產(chǎn)品質(zhì)量安全問題。

本文采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法來測定刺參產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物，通過優(yōu)化衍生溫度、衍生時間以及衍生試劑含量，縮短前處理過程，建立了刺參中硝基呋喃類代謝物快速檢測方法，以期為開展刺參產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管提供科學(xué)的數(shù)據(jù)支持，從而推動刺參養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，保障消費(fèi)者身體健康。

一、材料與方法

1.儀器與設(shè)備

超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent 1260/6460A)、電子分析天平、渦旋混合器、電熱恒溫培養(yǎng)箱、臺式高速離心機(jī)、水浴氮吹儀、超聲儀、固相萃取裝置、可調(diào)式移液器、量筒、容量瓶等。

2.試劑配制

0.2摩爾/升鹽酸溶液：取鹽酸4毫升，用水稀釋至200毫升，混勻。

0.05摩爾/升2-硝基苯甲醛溶液：取2-硝基苯甲醛0.052 9 克，溶解于7 毫升二甲亞砜中，混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.0摩爾/升磷酸氫二鉀溶液：取三水合磷酸氫二鉀45.6 克，用水溶解并稀釋至200 毫升，混勻。

0.002摩爾/升乙酸銨溶液：取乙酸銨0.045 克，加300 微升甲酸，用水溶解并稀釋至300毫升，超聲去氣泡，現(xiàn)配現(xiàn)用。

甲醇溶液：200毫升甲醇中加200微升甲酸。

定容液：甲醇溶液∶乙酸銨溶液＝1∶4。

100納克/毫升4種硝基呋喃類代謝物的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確吸取100 微克/毫升4 種硝基呋喃類代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液50 微升于50 毫升容量瓶中，用超純水定容配制成100 納克/毫升4 種硝基呋喃類代謝物的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，貯存于棕色試劑瓶中，2～8℃下冷藏保存，有效期1個月。

10 納克/毫升4 種硝基呋喃類代謝物的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確吸取100 納克/毫升的4 種硝基呋喃類代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液5 毫升于50 毫升容量瓶中，用超純水定容配制成10納克/毫升的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，貯存于棕色試劑瓶中，2～8℃下冷藏保存，有效期1個月。

100納克/毫升4種硝基呋喃類代謝物的內(nèi)標(biāo)混合溶液：準(zhǔn)確吸取100 微克/毫升4 種硝基呋喃類代謝物內(nèi)標(biāo)混合溶液50 微升于50 毫升容量瓶中，用超純水定容配制成100 納克/毫升4 種硝基呋喃類代謝物內(nèi)標(biāo)混合溶液，貯存于棕色試劑瓶中，2～8℃下冷藏保存，有效期1個月。

3.方法

(1)實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)共設(shè)置5 個優(yōu)化條件(第1～5 組)，以37℃下避光震蕩16 小時(第6組)為對照，見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化設(shè)置

(2)測定步驟。向2.00克刺參陰性樣品中準(zhǔn)確加入50 微升內(nèi)標(biāo)混合溶液(100 納克/毫升)、5 毫升鹽酸溶液(0.2 摩爾/升)和相應(yīng)體積的衍生化試劑(0.05摩爾/升)，渦旋混合50秒，按表1所列條件于電熱恒溫培養(yǎng)箱中衍生。衍生結(jié)束后取出冷卻至室溫，加入5 毫升磷酸氫二鉀(1.0 摩爾/升)、6 毫升乙酸乙酯，渦旋振蕩2 分鐘，4 000 轉(zhuǎn)/分離心5 分鐘后，提取上清液至10 毫升離心管中，在60℃水浴氮吹儀中吹干。加入1毫升定容液，渦旋振蕩溶解殘留物，再加入3毫升正己烷，渦旋混合1 分鐘，于7 000 轉(zhuǎn)/分下離心8 分鐘，提取凈化去除油脂，棄去上層有機(jī)相后，吸取下層溶液，經(jīng)0.45 微米濾膜過濾，上機(jī)測定。按相同方法測定2.5微克/千克質(zhì)控樣回收率和0.25微克/千克檢出限信噪比。

(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作。用移液槍依次吸取10 納克/毫升標(biāo)準(zhǔn)工作液50、100 微升和100 納克/毫升標(biāo)準(zhǔn)工作液25、50、100、200 微升進(jìn)行測定，制成濃度為0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0納克/毫升的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

(4)上機(jī)條件。色譜柱為C18 柱，柱溫31℃，進(jìn)樣量為20 微升，流動相A 相為0.002 摩爾/升乙酸銨溶液，B 相為甲醇溶液，洗脫程序見表2。離子化模式為大氣壓電噴霧離子源正離子模式。

表2 流動相洗脫程序

(5)判定依據(jù)。當(dāng)實(shí)驗(yàn)組檢測結(jié)果滿足《農(nóng)業(yè)農(nóng)村部783號公告》要求，即實(shí)驗(yàn)組與對照組保留時間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在5%以內(nèi)、離子豐度比相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤20%、回收率在80%～110%以內(nèi)、0.25 微克/千克檢出限信噪比≥10時，判定該方法可行。

二、結(jié)果

各優(yōu)化條件的檢測結(jié)果見表3。結(jié)果表明，除70℃下衍生0.5 小時(4 組)的檢出限未出現(xiàn)目標(biāo)峰、不符合檢測要求外，其他優(yōu)化條件均能找到目標(biāo)峰，且保留時間相對偏差≤5%、線性回歸R2≥0.995、80%≤加標(biāo)回收率≤110%、檢出限信噪比≥10，均滿足檢測要求，可作為硝基呋喃代謝物快速檢測方法，其中以加入150 微升衍生化試劑在60℃下衍生1小時的衍生條件為最佳，在保證檢測結(jié)果可靠性的同時最大限度縮短了衍生時間，更加節(jié)能環(huán)保。

表3 不同優(yōu)化條件下檢測情況

三、討論

目前硝基呋喃類代謝物快速檢測方法以快檢試劑盒檢測為主，該方法只對藥物殘留進(jìn)行定性分析，無法給出準(zhǔn)確的殘留量，4 種物質(zhì)單獨(dú)檢測，不僅費(fèi)時費(fèi)力，而且檢測過程中使用的一次性實(shí)驗(yàn)耗材容易造成環(huán)境污染，不利于資源節(jié)約。本文通過優(yōu)化設(shè)置5種衍生條件，最終構(gòu)建了60℃下衍生1小時這一最佳快速檢測方法，不僅可以同時對水產(chǎn)品中4種硝基呋喃類代謝物殘留進(jìn)行快速準(zhǔn)確地定性和定量分析，大大提高檢測效率，而且節(jié)省實(shí)驗(yàn)耗材，達(dá)到節(jié)能環(huán)保目的。該方法可為開展刺參產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估和實(shí)施科學(xué)監(jiān)管提供科學(xué)的數(shù)據(jù)支持，進(jìn)而推動刺參養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展，保障消費(fèi)者身體健康。

通常硝基呋喃類代謝物在用乙酸乙酯提取時采用4 000 轉(zhuǎn)/分離心，氮吹后用正己烷去脂時采用7 000 轉(zhuǎn)/分離心，但部分水產(chǎn)品脂肪水平較高，在此速率下離心易出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，難以分層，因此在實(shí)際操作中常通過提高轉(zhuǎn)速來實(shí)現(xiàn)分離(任召珍等，2019)。而本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，由于刺參屬于高蛋白質(zhì)、低脂肪、營養(yǎng)品質(zhì)上乘的優(yōu)質(zhì)參，粗脂肪水平較低，在用乙酸乙酯提取時采用4 000轉(zhuǎn)/分離心5 分鐘、氮吹后用正己烷去脂時采用7 000 轉(zhuǎn)/分離心8 分鐘，即可取得較好的分離效果，無須再增加轉(zhuǎn)速。此外，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中檢測水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物時均規(guī)定用乙酸乙酯提取2次，本文通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，硝基呋喃類藥物采用內(nèi)標(biāo)定量法，結(jié)果較穩(wěn)定，一次性加6毫升乙酸乙酯提取1次，硝基呋喃類藥物的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均在要求范圍內(nèi)。因此，采用一次提取法既可滿足檢測要求，又可提高檢測效率，同時減少了試劑使用量，可推廣應(yīng)用于刺參中硝基呋喃類代謝物的快速檢測。