一株大黃魚源乳酸菌的分離鑒定和抑菌分析

范正利，梁倩蓉

（1.溫州市漁業(yè)技術(shù)推廣站，浙江 溫州 325000；2.浙江省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，浙江 杭州 310023）

大黃魚養(yǎng)殖周期長，養(yǎng)殖各階段會暴發(fā)各類病害。病害一旦發(fā)生，往往在短時間內(nèi)出現(xiàn)魚迅速傳染和死亡。多年來，抗生素在預防及治療大黃魚細菌性疾病方面發(fā)揮著不可替代的重要作用。然而，抗生素的大量使用會導致產(chǎn)生耐藥菌株、破壞微生態(tài)平衡、抑制免疫系統(tǒng)等諸多弊端，甚至會在水產(chǎn)品中產(chǎn)生藥物殘留。因此，加強抗生素替代品尤其是抗菌益生菌的創(chuàng)新研究更為重要。本研究通過健康大黃魚腸道分離益生菌、16S rDNA 基因序列分析結(jié)合生理生化鑒定，以殺香魚假單胞菌為指示菌評估抑菌效果，以期為大黃魚細菌性疾病治療與綠色防控提供參考。

一、材料與方法

1.材料

(1)樣品。在溫州洞頭、瑞安、平陽、蒼南4 個區(qū)域大黃魚養(yǎng)殖基地各隨機抽取5 尾近期未使用抗生素的健康大黃魚，體長29～32 厘米，體重450～500克，冰鮮保存帶至實驗室。

(2)試劑與儀器。MRS 瓊脂培養(yǎng)基、NA 培養(yǎng)基、LB 固體培養(yǎng)基、LB 液體培養(yǎng)基、牛津杯(8 毫米)均購自青島海博生物技術(shù)有限公司；生理氯化鈉溶液，購自四川科倫藥業(yè)股份有限公司；PCR試劑，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；此外還有低溫離心機(德國賀默HERMLE)、落地式垂直超凈工作臺(上海蘇坤實業(yè)有限公司)、生化恒溫培養(yǎng)箱、立式高溫滅菌鍋(上海博訊實業(yè)有限公司)、顯微鏡(德國蔡司ZEISS)、全自動微生物鑒定儀(法國梅里埃)、紫外分光光度計(上海儀電)、游標卡尺(綠林)。

2.大黃魚腸道益生菌的分離和純化

取大黃魚樣品收集腸道3 厘米，置于裝有600 毫升無菌水(ddH2O)的1.5 毫升已滅菌EP 管中，研磨棒研磨勻漿。取100 毫升涂布MRS 固體培養(yǎng)基、芽孢桿菌培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)24 小時后，挑取單個菌落進一步劃線純化。將純化培養(yǎng)基編號進行保存。

3.大黃魚源益生菌的革蘭氏染色和生化鑒定

將分離純化的菌株挑單個菌落，轉(zhuǎn)移至LB 培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)和相應(yīng)孵育。挑取純化培養(yǎng)后的單菌落，均勻涂布于含有一滴生理鹽水的載玻片中央，經(jīng)火焰固定，進行結(jié)晶紫染色、碘染、酒精脫色和蕃紅復染后用光學顯微鏡觀察分析。同時將3 毫升無菌鹽水加入一個透明的塑料試管(12 毫米×75毫米)中。挑取純化單個菌落，置于塑料管中制成菌懸液0.5～0.63麥氏單位濁度。根據(jù)革蘭氏染色結(jié)果，將菌懸液和對應(yīng)的陽性或者陰性細菌鑒定(GN)卡放入全自動微生物鑒定儀卡架中，參照法國梅里埃全自動細菌鑒定儀使用手冊，按相關(guān)操作進行鑒定。

4.大黃魚源益生菌的分子鑒定

選取純化培養(yǎng)基的單個菌落，制備菌懸液，采用熱裂解法分離純化得到細菌DNA 提取，以DNA作為模板，選擇細菌16S rRNA通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')對16S rRNA 基因序列進行PCR 擴增。測序結(jié)果采用BLAST 細菌數(shù)據(jù)庫進行比對后，選取得分最高、序列一致性在99%以上的已知細菌種類確定為目標物種。

5.牛津杯法抑菌實驗

提前制備好LB固體培養(yǎng)基放4℃冰箱備用，以LB 液體培養(yǎng)基+0.2%的瓊脂粉制備半固體培養(yǎng)基。將新培養(yǎng)的指示劑菌液(殺香魚假單胞菌)測定OD 600 值，稀釋到107cfu/毫升。120 毫升LB 半固體培養(yǎng)基滅菌后再加3 毫升指示菌菌液(107cfu/毫升)，倒于固體培養(yǎng)基上，制成LB 雙層平板。待LB 雙層平板培養(yǎng)基上層半固體培養(yǎng)基凝固后，用無菌鑷子夾取無菌牛津杯(直徑8毫米)等距離置于雙層平板上。向牛津杯中注入待測的乳酸菌液、恩諾沙星(0.125～1 微克/毫升)、褐藻寡糖(2.5～20 毫克/毫升)各100 微升，設(shè)置陰性對照CK(LB 液體培養(yǎng)基)。室溫靜置2 小時，轉(zhuǎn)28℃，培養(yǎng)16 小時，觀察記錄抑菌圈直徑。每組設(shè)置3個平行。

二、結(jié)果

1.分離菌革蘭氏染色與特征

在培養(yǎng)基表面可看到白色圓形菌落，表面凸起、邊緣完整有光澤且光滑；革蘭氏染色結(jié)果顯示，分離菌株為紅色革蘭氏陰性球形菌，將分離菌株命名為LAB202301。

2.分離菌生理生化特征

基于VTTEK 2 的64 個生化反應(yīng)的分析提示，分離菌LAB202301 呈苦杏仁苷、β-半乳糖吡喃糖苷酶、D-半乳糖、蔗糖、乙酰-D-氨基葡萄糖、新生霉素耐受等陽性，鑒定結(jié)果為戊糖片球菌，其具體生理生化特性見表1。

表1 分離菌生理性狀

3.分離菌分子鑒定

用細菌16S rDNA 通用引物對LAB202301 菌株的基因進行PCR 擴增，得到長度為1451 bp 的片段。序列經(jīng)NCBI 上BLAST 比對分析后，與戊糖片球菌同源性均在99%以上。綜合上述形態(tài)學特征、生理生化鑒定及16S rDNA 基因序列比對結(jié)果，鑒定分離菌LAB202301為乳酸菌戊糖片球菌。

4.分離菌的抑菌效果

LAB202301乳酸菌菌液、抗生素及寡糖對大黃魚內(nèi)臟白點病致病菌殺香魚假單胞菌具顯著的抑菌效果，抑菌直徑見表2。結(jié)果顯示恩諾沙星、寡糖的濃度越高，抑菌效果越好。乳酸菌菌液的抑菌效果優(yōu)于1 微克/毫升抗生素，但兩者不存在顯著性差異(P＞0.05)。乳酸菌的抑菌效果雖不如20、10毫克/毫升寡糖，兩者也不存在顯著性差異(P＞0.05)。乳酸菌的抑菌效果優(yōu)于其他濃度抗生素，且存在顯著性差異(P＜0.05)。R1乳酸菌的抑菌效果優(yōu)于5 毫克/毫升寡糖，但兩者不存在顯著性差異(P＞0.05)。R1乳酸菌菌液的抑菌效果顯著優(yōu)于2.5毫克/毫升寡糖(P＜0.05)。

三、討論

乳酸菌是主要的益生菌之一，在食品、飼料及動保產(chǎn)品等多個方面廣泛應(yīng)用。魚通過對水環(huán)境或飼料中乳酸菌的攝取，并定殖于消化道內(nèi)與其他有益菌形成優(yōu)勢菌群，共同抑制致病菌繁殖，可有效改善魚腸道的微生態(tài)平衡。

本研究通過分離大黃魚腸道內(nèi)的乳酸菌，篩選了一株具有明顯抑制殺香魚假單胞菌的乳酸菌菌株，經(jīng)過16S rRNA 分子鑒定及生理生化鑒定后確定為戊糖片球菌。該菌株與抗生素、褐藻寡糖對殺香魚假單胞菌的抑菌效果比較可知，能夠有效抑制和殺滅殺香魚假單胞菌，具有良好的防治大黃魚內(nèi)臟白點病的應(yīng)用潛力。同時，益生菌通過競爭作用抑制有害菌的生長，對病原菌不會產(chǎn)生耐藥性，也不會對水產(chǎn)品造成藥物殘留。研究結(jié)果可進一步證實魚的腸道中存在著具有高活性抑制致病菌的有益乳酸菌，完全可以作為一種水產(chǎn)養(yǎng)殖病害綠色防控的有效手段，可作為抗生素替代品。下一步可以以乳酸菌戊糖片球菌展開相關(guān)飼料發(fā)酵工藝、致病菌攻毒試驗，研究乳酸菌預防與治療效果、養(yǎng)殖生產(chǎn)示范應(yīng)用推廣等，以更好地將大黃魚源乳酸菌戊糖片球菌實際應(yīng)用于預防和治療大黃魚內(nèi)臟白點病。