烯殼鐵氮磁珠介導(dǎo)Survivin ASO對腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和抑制作用

張曉旭 ， 肖向茜，2 ， 潘逸群 ， 顧燁翔 ， 董禮 ， 黨浩然 ， 康茜 ， 王明連，2

1.北京工業(yè)大學(xué)環(huán)境與生命學(xué)部，北京 100124；2.抗病毒藥物北京市國際科技合作基地，北京 100124

惡性腫瘤增殖迅速且易于產(chǎn)生耐藥性，因此治療困難［1］。近年來，寡核苷酸療法因其高效性、安全性、藥物制備相對容易等優(yōu)勢，在腫瘤治療方面顯示出優(yōu)越的前景［2］。其中，反義寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASO）是一類由人工設(shè)計(jì)合成以反義方式調(diào)控目的基因表達(dá)的寡核苷酸片段，通常由15～25個(gè)核苷酸組成，通過與mRNA形成雜合體后被RNase H降解，這種降解作用依賴ASO與目的基因的嚴(yán)格匹配，所以較其他小核酸藥物具有不易脫靶的優(yōu)越性，如此使目的基因沉默，阻止其翻譯合成蛋白質(zhì)。目前，一些ASO藥物已獲得美國食品和藥物管理局（United States Food and Drug Adminis-tration，F(xiàn)DA）認(rèn)證，如Fomivirsen、Eteplirsen、Golodirsen、Viltolarsen和Casimersen等［3］。ASO技術(shù)由于其序列配對的高度選擇性、設(shè)計(jì)過程簡易及體外可大量合成等優(yōu)點(diǎn)［4］，在腫瘤治療領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。

Survivin是凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis proteins，IAP）家族成員，作為一種細(xì)胞凋亡抑制基因，它在胚胎和腫瘤組織中均表達(dá)，而在正常分化的組織中幾乎不表達(dá)［5］。過表達(dá)的Survivin能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，其抗凋亡作用在于能夠促進(jìn)有絲分裂，加快細(xì)胞增殖，并且抑制Caspase-3、Caspase-7表達(dá)和細(xì)胞凋亡［6-7］。Survivin在肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、前列腺癌和乳腺癌等多種腫瘤組織中高表達(dá)，被認(rèn)為是腫瘤治療的靶分子［8-9］。針對Survivin mRNA序列和二級結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)合成ASO，抑制Survivin表達(dá)，有望實(shí)現(xiàn)抗腫瘤的作用。

寡核苷酸需要進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，而核酸的負(fù)電性使其難以跨膜；無處不在的核酶使得寡核苷酸易被降解，因此，寡核苷酸藥物的遞送方式就顯得十分重要［10］。核酸藥物的遞送方式大體分為病毒載體和非病毒載體［11-13］。病毒載體包括腺病毒（adenovirus， AdV）、慢病毒（lentivirus， LV）、逆轉(zhuǎn)錄病毒（retrovirus， RV）等，病毒載體生產(chǎn)技術(shù)繁瑣、價(jià)格高，且安全性一直被質(zhì)疑。非病毒載體包括陽離子脂質(zhì)體、無機(jī)納米粒子和聚合物等［14］，因成本低、制作方便而發(fā)展迅速，但有些因成分而異會產(chǎn)生一定細(xì)胞毒性和/或轉(zhuǎn)染效率較低的問題。

烯殼鐵氮磁珠（graphene-shelled ferro-nitride magnetic beads，GFeNMB）作為一種新型納米材料，具有核殼結(jié)構(gòu)，可通過低溫等離子體法大量制備［15］，制造成本低，原料和產(chǎn)物均無害。不同于目前大多以Fe、Fe2O3、Fe3O4［16］為主要成分的納米磁珠，GFeNMB外殼是多層石墨烯，內(nèi)部以Fe和Fe4N為磁芯，擁有著更強(qiáng)的磁響應(yīng)性，在有著納米載體優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)還具有優(yōu)越的靶向特性。GFeNMB兼有石墨烯的生物相容性、特殊的吸附性能和磁響應(yīng)性，對其表面進(jìn)行基團(tuán)修飾后可用于細(xì)胞分選和病毒富集等領(lǐng)域［17］。GFeNMB外層包覆的石墨烯具有較高的穩(wěn)定性和生物相容性，因其結(jié)構(gòu)特征會與裸露的堿基發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用，其中π-π堆積作用和氫鍵都有助于單鏈核酸和石墨烯之間產(chǎn)生親和力，從而對單鏈核酸有著較強(qiáng)的吸附能力［18-20］。吸附核酸的石墨烯能起到保護(hù)核酸的作用，使核酸免受酶的消化［21］。由于熒光共振能量的轉(zhuǎn)移，石墨烯可以抑制附著的熒光，猝滅吸附的熒光團(tuán)［22-23］。雙鏈核酸較單鏈核酸而言，空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變時(shí)，堿基被包裹在磷酸鹽骨架內(nèi)，石墨烯無法與其接觸，從而對雙鏈核酸的吸附能力減弱。因此，石墨烯吸附單鏈核酸后，一旦單鏈核酸與同一環(huán)境中的互補(bǔ)鏈發(fā)生雜交形成雙鏈結(jié)構(gòu)，就會從石墨烯表面解吸附［24-25］。因此，可以用熒光團(tuán)修飾單鏈核酸，通過熒光團(tuán)的熒光強(qiáng)度來監(jiān)測石墨烯對單鏈核酸的吸附與解吸附情況。綜上，GFeNMB對單鏈核酸的吸附性和磁靶向性，使其作為ASO載藥工具遞送到細(xì)胞具有天然獨(dú)到的優(yōu)勢。

GFeNMB外殼成分石墨烯的安全性已被許多研究證實(shí)，石墨烯對細(xì)胞幾乎無毒性，不影響細(xì)胞生長，以該磁珠材料分選的細(xì)胞可以附著于磁珠，且增殖旺盛［26-27］，一些研究已將石墨烯用于藥物遞送的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)［28］。GFeNMB內(nèi)核的氮和鐵元素均是體內(nèi)細(xì)胞的固有元素，性質(zhì)相近的鐵氧納米懸液在體內(nèi)藥物使用中已有應(yīng)用［29-30］。因此GFeNMB作為基礎(chǔ)材料具有安全性和細(xì)胞相容性等優(yōu)勢。

本研究設(shè)計(jì)合成了靶向Survivin的ASO，GFeNMB吸附ASO形成載藥體，將其磁性轉(zhuǎn)染至腫瘤細(xì)胞中，通過檢測轉(zhuǎn)染情況和對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，對GFeNMB作為單鏈寡核苷酸藥物運(yùn)載工具的可行性進(jìn)行了初步探討。

1 材料與方法

1.1 磁珠均質(zhì)溶液配制

GFeNMB通過低溫等離子體法［15］制備，呈黑色粉末狀，不易溶于水，需要經(jīng)過超聲儀處理后形成均質(zhì)溶液。稱取GFeNMB粉末20 mg，溶于40 mL去離子水，高壓滅菌處理2 h，超聲處理1 h，形成均勻的磁珠懸浮液（0.5 mg·mL-1）。

1.2 Survivin ASO

NCBI網(wǎng)址搜索人類細(xì)胞凋亡抑制基因Survivin的mRNA序列（GenBank登錄號U75285.1），通過RNA Draw程序［31］預(yù)測了1619 bp Survivin mRNA在37 ℃的二級結(jié)構(gòu)，在沒有堿基互補(bǔ)配對的區(qū)域，RNA序列呈現(xiàn)單鏈構(gòu)象，相對來說是反義寡核苷酸易于靠近的雜交區(qū)段。有效反義靶點(diǎn)的二級結(jié)構(gòu)多為不穩(wěn)定部位，如發(fā)夾、內(nèi)部環(huán)、膨脹環(huán)、多分支環(huán)等。Survivin mRNA的大單鏈環(huán)序列以及由短雙鏈間隔連接起來的小單鏈環(huán)序列都可能是反義寡核苷酸的有效雜交區(qū)段?；谧R別位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了一系列針對Survivin mRNA不同區(qū)域的20-mer反義寡核苷酸序列。寡核苷酸由上海生工公司合成及修飾，兩端經(jīng)硫代修飾以防止核酸酶降解。其中，用于顯微鏡觀察的示蹤ASO，在5'端以FAM修飾。使用可搜索數(shù)據(jù)庫（Advanced BLASTN）檢查序列與其他人類基因的同源性。

1.3 磁珠對Survivin ASO的吸附量檢測

以FAM熒光團(tuán)標(biāo)記的ASO來研究單位質(zhì)量GFeNMB的吸附量，通過不同質(zhì)量磁珠吸附ASO后液體熒光強(qiáng)度減弱的幅度，來反應(yīng)磁珠的吸附量，吸附后上清熒光強(qiáng)度減弱不大則吸附量少，減弱程度大則吸附量也大。按質(zhì)量梯度（0、5、10、15、20 μg）分別吸?。?、10、20、30、40 μL）的磁珠溶液（0.5 mg·mL-1）與0.1 μmol·L-1的Survivin ASO（10 μL）在離心管中混合，加入不同體積的超純水，使每管體積均為100 μL，每組3個(gè)復(fù)孔，渦旋振蕩5 s，用錫紙包裹置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min。所有工作溶液均采用超純水。所有實(shí)驗(yàn)組的FAM-ASO濃度固定為0.1 μmol·L-1，反應(yīng)體系為100 μL。用磁鐵對離心管進(jìn)行磁吸處理，視野中磁珠沉于離心管底部，吸取上清80 μL轉(zhuǎn)移至微孔板中，酶標(biāo)儀（吸收波長485 nm，發(fā)射波長528 nm）測量熒光強(qiáng)度。

1.4 磁珠吸附ASO的時(shí)間優(yōu)化

以FAM熒光團(tuán)標(biāo)記的ASO來研究吸附熒光探針的最佳時(shí)間，通過計(jì)算不同時(shí)間磁珠吸附ASO后上清熒光強(qiáng)度的大小，研究最佳吸附時(shí)間，當(dāng)上清熒光強(qiáng)度趨于不變，則吸附完全。將10 μL Survivin ASO（0.1 μmol·L-1）與30 μL磁珠溶液（0.5 mg·mL-1）在離心管中混合，加入60 μL超純水，每管體積為100 μL，按時(shí)間梯度（0、10、20、30、60 min）每組3個(gè)復(fù)孔，渦旋振蕩5 s，用錫紙進(jìn)行包裹并在37 ℃培養(yǎng)箱進(jìn)行孵育。所有工作溶液均采用超純水。所有實(shí)驗(yàn)組的FAM標(biāo)記Survivin ASO濃度固定為0.1 μmol·L-1。反應(yīng)體系為100 μL。用磁鐵對離心管進(jìn)行磁吸處理，視野中磁珠沉于離心管底部，吸取上清80 μL于96孔板中，酶標(biāo)儀（Enspire， Perkin Elmer）于吸收波長485 nm，發(fā)射波長528 nm測量熒光強(qiáng)度。

1.5 GFeNMB吸附反義寡核苷酸前后表征

GFeNMB由多層石墨烯片層包圍，內(nèi)核是氮化鐵磁芯。GFeNMB由于石墨烯外殼具有石墨烯易團(tuán)聚的特點(diǎn)，磁珠溶液中的實(shí)際顆粒是由大小和形狀不同的顆粒組成，因此進(jìn)行顆粒粒度檢測，通常以平均粒徑來表征顆粒的粒徑。采用納米顆粒粒徑檢測方法進(jìn)行GFeNMB吸附Survivin ASO后的表征，包括以下步驟。①觀察GFeNMB的形貌，將GFeNMB和GFeNMB-Survivin ASO置于TEM（JEM 2010，Japan）下觀察粒徑大小并拍照。②GFeNMB的粒度分析，將GFeNMB和GFeNMBSurvivin ASO使用激光粒度儀（Mastersizer 3000，Britain）檢測磁珠于水相中的平均粒徑。

1.6 GFeNMB的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

將GFeNMB和空脂質(zhì)體（Solarbio）分別制備成懸浮液加于細(xì)胞，比較兩者在不同時(shí)間條件下對細(xì)胞的毒性作用，對GFeNMB的安全性進(jìn)行評估。將肺癌A549細(xì)胞接種在96孔板中，每孔鋪1×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)基體積為100 μL，待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時(shí)，將細(xì)胞分3組：GFeNMB組、空脂質(zhì)體組、細(xì)胞對照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，另設(shè)空白孔（只加100 μL培養(yǎng)基），按照時(shí)間梯度（0、24、48、72 h）常規(guī)培養(yǎng)后，每孔加入10 μL CCK-8（Sigma公司），培養(yǎng)箱中放置1.5 h后，觀察到明顯的顏色變化，溶液呈橙黃色，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測定各孔450 nm處吸光度，觀察細(xì)胞活性。

1.7 GFeNMB-ASO轉(zhuǎn)染

構(gòu)建GFeNMB-ASO成功后進(jìn)行磁轉(zhuǎn)染。圖2是GFeNMB吸附Survivin ASO形成載藥體對細(xì)胞進(jìn)行磁轉(zhuǎn)染的過程，圖3是載藥體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的轉(zhuǎn)染模擬圖，包括載藥體進(jìn)入胞內(nèi)囊泡，經(jīng)歷核內(nèi)體逃逸后，ASO分別與胞內(nèi)、核內(nèi)Survivin mRNA發(fā)生雜交，ASO發(fā)揮作用阻斷翻譯，實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)下調(diào)。轉(zhuǎn)染步驟如下。①鋪皿，在15 mm小皿（Corning）中將肺癌細(xì)胞A549培養(yǎng)于含10%胎牛血清、5%青霉素和鏈霉素的DMEM（Gibco公司，pH 7.2）培養(yǎng)基中，每皿2×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)基體積為1 mL；放置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱（Thermo公司）中，待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。②轉(zhuǎn)染，GFeNMB溶液磁吸后棄去上清，用1 mL無血清培養(yǎng)基重懸，加入Survivin ASO（152 μL，0.5 μmol·L-1）吹打混勻，在培養(yǎng)箱中孵育20 min，制成GFeNMB-Survivin ASO復(fù)合物，加入小皿中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為對照。將磁鐵放置在小皿底部，培養(yǎng)箱孵育40 min后撤掉磁鐵，4 h后更換成10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。③固定，吸出培養(yǎng)基，將細(xì)胞用PBS溶液清洗2遍后，用4%的多聚甲醛固定液固定細(xì)胞，每個(gè)皿中加500 μL固定液，固定液的量充分蓋住樣品，室溫固定20 min，之后使用PBS溶液充分洗滌以去除殘留的多聚甲醛。④DAPI染色，加入200 μL的DAPI染色液（Beyotime），覆蓋住細(xì)胞，室溫放置10 min，吸除DAPI染色液，用PBS溶液洗滌2～3次后，放入適量純水，用激光掃描共聚焦顯微鏡（AX R，Nikon）進(jìn)行熒光觀測。

1.8 Western blot檢測Survivin蛋白表達(dá)

將對數(shù)生長期細(xì)胞A549接種于6孔板中，每孔3×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)基體積為2 mL；待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%進(jìn)行轉(zhuǎn)染，繼續(xù)培養(yǎng)過夜。各組細(xì)胞分別加入裂解緩沖液（Beyotime）提取總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量分析，用20 μg·孔-1上樣，15% SDS-PAGE凝膠電泳分離，通過電轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜后，在含5%脫脂奶粉的TBST中室溫于搖床上慢速封閉1 h。封閉后TBST漂洗3次，每次10 min。加入一抗（1∶1000兔抗人Survivin，1∶10000 GAPDH），4 ℃孵育過夜后TBST漂洗3次，每次10 min，加入二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG 1∶3000）室溫于搖床上慢速孵育1 h。TBST充分漂洗3次，每次10 min。在膜上滴加化學(xué)發(fā)光試劑，顯影儀進(jìn)行顯影，觀察條帶，用蛋白條帶的平均光強(qiáng)度值表示Survivin蛋白表達(dá)的相對強(qiáng)度。

1.9 GFeNMB-Survivin ASO轉(zhuǎn)染后腫瘤細(xì)胞凋亡情況

Annexin V-FITC/PI試劑（翌圣生物）雙染檢測細(xì)胞凋亡，以FITC標(biāo)記的Annexin V作為探針，實(shí)現(xiàn)對早期凋亡細(xì)胞的檢測。碘化丙啶（propidium iodide，PI）不能穿過活細(xì)胞的細(xì)胞膜，但可以把死細(xì)胞或晚期凋亡細(xì)胞的核染紅。將A549細(xì)胞接種在6孔板中，每孔鋪3×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)基體積2 mL，待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染過夜后用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞后，300g4 ℃離心5 min。消化時(shí)間不要過長，防止假陽性。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，300g4 ℃離心5 min，離心管收集細(xì)胞。吸去PBS溶液，加入100 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞。加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI 室溫保存，輕輕混勻離心管。避光反應(yīng)10～15 min。加入400 μL 1×Binding Buffer，混勻后放置于冰上，樣品在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.10 GFeNMB-Survivin ASO對腫瘤細(xì)胞內(nèi)活性氧水平影響

ROS在細(xì)胞中起著重要作用，它是許多大分子的潛在損傷源，ROS水平升高或者降低都會引起細(xì)胞的狀態(tài)發(fā)生改變，造成細(xì)胞損傷。沒有熒光的DCFH-DA可以穿過細(xì)胞膜，被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解成DCFH。而DCFH不能透過細(xì)胞膜，因此使探針被裝載到細(xì)胞內(nèi)。在活性氧存在時(shí)，DCFH會被氧化生成熒光物質(zhì)DCF，其熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)ROS水平成正比，因此DCF的熒光強(qiáng)度可以反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。ROS檢測采用Beyotime法：在96孔板中接種A549細(xì)胞，每孔1.5×104個(gè)細(xì)胞，載藥體轉(zhuǎn)染過夜后，用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗2遍，按1∶1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 μmol·L-1。去除培養(yǎng)基，加入稀釋好的DCFH-DA。37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFHDA。酶標(biāo)儀在488 nm激發(fā)波長、525 nm發(fā)射波長處檢測熒光強(qiáng)度。

1.11 CCK-8檢測GFeNMB-Survivin ASO對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

將狀態(tài)良好的A549細(xì)胞接種在96孔板中，每孔鋪1×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)基體積為100 μL，待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)組為4個(gè)針對靶基因不同位點(diǎn)的ASO（表1），細(xì)胞對照組不加ASO處理，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，另設(shè)空白孔（只加100 μL培養(yǎng)基），按照時(shí)間梯度（0、24、48、72 h）常規(guī)培養(yǎng)后，每孔加入10 μL CCK-8（Sigma公司），注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響OD值的讀數(shù)。培養(yǎng)箱中放置1.5 h后，觀察到明顯的顏色變化，溶液呈橙黃色，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀（波長450 nm）測定各孔吸光度，以評估細(xì)胞增殖能力的差異。

表1 反義寡核苷酸序列及其在Survivin mRNA上的靶位Table 1 Sequences of antisense oligonucletides and their target sites on the Survivin mRNA

1.12 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測A549細(xì)胞遷移能力

將處于對數(shù)生長期的A549細(xì)胞接種于6孔板中，調(diào)整細(xì)胞密度，使每孔的細(xì)胞密度為2×105個(gè)，待細(xì)胞分布均勻后放入培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將GFeNMB-Survivin ASO加入6孔板中，放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)，4 h后更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞匯合度達(dá)到90%左右，棄去舊的培養(yǎng)基，換成無血清培養(yǎng)基，用10 μL槍頭在6孔板底部劃線（2～3條）。用PBS將多余的細(xì)胞洗去后加入無血清的培養(yǎng)基，于37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別在轉(zhuǎn)染0、24 h后對同一位置進(jìn)行拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 GFeNMB-Survivin ASO載藥體的構(gòu)建

根據(jù)GFeNMB對單鏈核酸的吸附能力，單位質(zhì)量GFeNMB對ASO的吸附量及吸附的最佳時(shí)間，構(gòu)建GFeNMB-Survivin ASO載藥體。由圖4A可知，當(dāng)30 min孵育之后，自15 μg GFeNMB開始Survivin ASO被吸附后液體熒光強(qiáng)度不再變化，表明15 μg的GFeNMB對于Survivin ASO吸附達(dá)最大量。以此計(jì)算單位質(zhì)量GFeNMB的吸附量。Survivin ASO1的分子量（μg·μmol-1）為6598.88（堿基數(shù)相同的ASO相對分子質(zhì)量相差不大，這里使用ASO1進(jìn)行檢測）；0.1 μmol·L-1的Survivin ASO（10 μL，約為6.6×10-3μg）在30 min被15 μg的GFeNMB吸附，1 μg的GFeNMB吸附4.4×10-4μg的Survivin ASO1。由于孵育過程中，探針自身也會有一定程度的熒光淬滅，所以吸附時(shí)間不宜過長。

根據(jù)圖4B可知，最佳的吸附時(shí)間是20 min，在此之后隨著時(shí)間變化，熒光強(qiáng)度變化不大，表明ASO已被吸附完全。據(jù)此制備GFeNMB-Survivin ASO載藥體，按照1 μg的GFeNMB吸附4.4×10-4μg Survivin ASO的比例，將GFeNMB吸附Survivin ASO在37 ℃的培養(yǎng)箱中孵育20 min來構(gòu)建載藥體。

2.2 GFeNMB與GFeNMB-Survivin ASO的表征對比

檢測GFeNMB吸附ASO后得到GFeNMB-Survivin ASO與GFeNMB的透射電鏡結(jié)果（圖5）。GFeNMB有明顯的殼核結(jié)構(gòu)（圖5A），其中氮化鐵核芯粒徑范圍為20～80 nm，外殼由多層石墨烯包覆。對磁珠進(jìn)行超聲處理后，其平均粒徑是402.5 nm（圖6）。GFeNMB-Survivin ASO的殼核結(jié)構(gòu)完整（圖5B），外層仍然有多層的石墨烯包覆。GFeNMB-Survivin ASO水相的平均粒徑較GFeNMB有所下降，為337.2 nm（圖6）。GFeNMB由于石墨烯外殼具有易團(tuán)聚的特點(diǎn)，磁珠溶液中的實(shí)際顆粒是由大小和形狀不同的顆粒組成，出現(xiàn)磁珠相粘連的形態(tài)。烯殼鐵氮磁珠吸附反義寡核苷酸后平均粒徑有所下降，磁珠顆粒分布變窄，分散性變好，推測原因是單鏈核酸在溶液中帶有負(fù)電，溶液中的電荷作用使納米顆粒分布均勻。

2.3 GFeNMB作為轉(zhuǎn)染試劑的毒副作用評價(jià)

不同樣品轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后（圖7），與空白對照相比，GFeNMB組（只加GFeNMB溶液）和Liposome組（只加脂質(zhì)體）對細(xì)胞增殖有抑制作用，隨著時(shí)間變化，Liposome組抑制效果逐漸明顯。從0～72 h，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞活力有所下降，其中空脂質(zhì)體對細(xì)胞活力下降影響明顯，說明空脂質(zhì)體對細(xì)胞有較為明顯的毒性，能夠抑制細(xì)胞生長。有研究表明使用烯殼鐵氮磁珠進(jìn)行細(xì)胞分選，未產(chǎn)生明顯的細(xì)胞損傷，細(xì)胞可以繼續(xù)生長，說明磁珠的細(xì)胞毒副作用較小，不影響細(xì)胞生長［33］。GFeNMB的細(xì)胞毒性明顯低于脂質(zhì)體，因此使用GFeNMB進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，更具安全性、簡易性。

2.4 GFeNMB-Survivin ASO磁性轉(zhuǎn)染效果

細(xì)胞轉(zhuǎn)染過夜后，固定細(xì)胞進(jìn)行DAPI染色，共聚焦熒光顯微鏡下藍(lán)色是腫瘤細(xì)胞核區(qū)域，綠色是Survivin ASO示蹤區(qū)域。圖8中A組可以觀察到GFeNMB-Survivin ASO轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞后，綠色熒光集中重合在細(xì)胞核區(qū)域。B組可以觀察到Lip-Survivin ASO轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，綠色熒光集中于細(xì)胞核周圍，以此推斷GFeNMB-Survivin ASO轉(zhuǎn)染后大量ASO進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，GFeNMB在核轉(zhuǎn)染方面優(yōu)于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。C組是轉(zhuǎn)染后48 h經(jīng)過PI染色，觀察到細(xì)胞核區(qū)域呈紅色，綠色熒光消失，說明此時(shí)細(xì)胞出現(xiàn)死亡情況，GFeNMB-Survivin ASO可以誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，抑制細(xì)胞增殖。

2.5 GFeNMB-Survivin ASO轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中Survivin的蛋白表達(dá)

采用Western blot檢測各組A549細(xì)胞中Survivin蛋白表達(dá)，各組細(xì)胞中GAPDH蛋白條帶亮度相近，在16.5 kD蛋白條帶位置是Survivin蛋白條帶位置［6］，由圖9A可觀察到GFeNMB-Survivin ASO轉(zhuǎn)染組蛋白條帶表達(dá)量低于空白對照和脂質(zhì)體組；由圖9B可知GFeNMB-Survivin ASO轉(zhuǎn)染組蛋白條帶與脂質(zhì)體組和空白對照組差異顯著（P＜0.0001），Lip-Survivin ASO轉(zhuǎn)染組與空白對照組差異不顯著。說明GFeNMB-Survivin ASO明顯抑制Survivin的蛋白表達(dá)，轉(zhuǎn)染效果優(yōu)于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，基因下調(diào)能力更明顯。

2.6 GFeNMB-Survivin ASO轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡情況

流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，F(xiàn)ITC激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長525 nm，F(xiàn)ITC的綠色熒光在FL1通道；PI檢測的最大激發(fā)波長為535 nm，最大發(fā)射波長為615 nm，PI的紅色熒光在FL2通道。以FITC為橫坐標(biāo)，PI為縱坐標(biāo)檢測細(xì)胞分布。由圖10A可觀察到，GFeNMB-Survivin ASO轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后，與正常培養(yǎng)的細(xì)胞相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡率約為17%；轉(zhuǎn)染48 h后，實(shí)驗(yàn)組A549細(xì)胞的凋亡率約為26%，表明隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間增加，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡比例增加。由圖10B可知，GFeNMBSurvivin ASO轉(zhuǎn)染組與細(xì)胞組凋亡率有顯著差異（P＜0.001）。圖10C是GFeNMB-Survivin ASO磁轉(zhuǎn)染細(xì)胞測量細(xì)胞內(nèi)ROS水平，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)ROS水平上升，與正常細(xì)胞組相比有顯著性差異（P＜0.01）。說明GFeNMB-Survivin ASO轉(zhuǎn)染到腫瘤細(xì)胞后，下調(diào)Survivin基因的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，細(xì)胞代謝受到影響，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS水平上升。

圖1 37 ℃時(shí)Survivin mRNA的二級結(jié)構(gòu)及ASO靶位Fig. 1 Secondary structure of Survivin mRNA at 37 ℃ and the target sites of ASOs

圖2 GFeNMB運(yùn)載Survivin ASO磁轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞過程Fig. 2 Magnetofection of tumor cells with Survivin ASO carried by GFeNMB

圖5 GFeNMB與GFeNMB-Survivin ASO的TEM圖Fig. 5 TEM images of GFeNMB and GFeNMB-Survivin ASO

圖6 GFeNMB與GFeNMB-Survivin ASO的水相粒徑分布Fig. 6 Particle size distribution of GFeNMB and GFeNMB-Survivin ASO in water

圖7 GFeNMB和脂質(zhì)體對細(xì)胞的毒性作用Fig. 7 Cytotoxicity of GFeNMB and liposome

圖8 GFeNMB-Survivin ASO轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的共聚焦顯微鏡熒光結(jié)果Fig. 8 Fluorescence images of cells after GFeNMB-Survivin ASO transfection

圖9 GFeNMB-Survivin ASO和Lip-Survivin ASO轉(zhuǎn)染后Western blot檢測蛋白表達(dá)Fig. 9 Protein expression of GFeNMB-Survivin ASO and Lip-Survivin ASO transfected by Western blot

圖10 GFeNMB-Survivin ASO轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡情況Fig. 10 Apoptosis of cells after transfection with GFeNMB-Survivin ASO

2.7 GFeNMB-Survivin ASO磁性轉(zhuǎn)染對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用

不同序列的Survivin ASO分別轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后，觀察不同時(shí)間段各組細(xì)胞活力變化（圖11）。與對照組相比GFeNMB-Survivin ASO轉(zhuǎn)染后對細(xì)胞的增殖有一定的抑制作用，隨著時(shí)間變化，抑制效果增加，實(shí)驗(yàn)組A549細(xì)胞活性明顯低于正常對照組，實(shí)驗(yàn)組之間細(xì)胞活力差異不大。表明GFeNMB-Survivin ASO轉(zhuǎn)染細(xì)胞后可顯著抑制A549細(xì)胞的增殖。

2.8 GFeNMB-Survivin ASO對腫瘤細(xì)胞細(xì)胞遷移能力的影響

通過槍頭在細(xì)胞生長區(qū)域劃線模擬體外傷口愈合，在0、24 h觀察細(xì)胞傷口距離變化，以研究細(xì)胞的愈合能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖12所示，空白對照組細(xì)胞在24 h后，細(xì)胞之間的遷移距離出現(xiàn)明顯縮短，而磁性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞之間的遷移距離較空白對照有明顯差距。數(shù)據(jù)分析結(jié)果（圖12F）顯示GFeNMB-Survivin ASO轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞的遷移速度較對照組明顯下降，與空白對照相比有顯著性差異（P＜0.0001），這一結(jié)果顯示GFeNMB-Survivin ASO磁轉(zhuǎn)染后降低了肺腺癌A549細(xì)胞的遷移能力。

圖12 GFeNMB-Survivin ASO轉(zhuǎn)染后劃痕實(shí)驗(yàn)在0、24 h細(xì)胞遷移結(jié)果Fig. 12 Cell migration results after transfected by GFeNMB-Survivin ASO at 0 and 24 h

3 討論

目前研究較多的寡核苷酸藥物包括ASO、siRNA、miRNA、aptamer等，其中ASO是將特定序列精準(zhǔn)結(jié)合到靶RNA，進(jìn)而抑制疾病相關(guān)基因的翻譯，ASO正在被用于針對多種疾病的新型藥物開發(fā)，在腫瘤治療領(lǐng)域的應(yīng)用前景可期［34-35］。Survivin基因作為腫瘤治療的靶分子，通過Survivin基因序列設(shè)計(jì)合成ASO為癌癥治療提供了新的方向。有研究報(bào)道，Survivin ASO已經(jīng)嘗試用于調(diào)控非小細(xì)胞肺癌、急性髓系白血病、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)中，能夠觀察到抑制細(xì)胞增殖的情況［36-38］，基于本文研究結(jié)果推測以脂質(zhì)體作為ASO的轉(zhuǎn)染工具，調(diào)控基因表達(dá)效果不明顯，我們推測可能是其中有脂質(zhì)體本身的細(xì)胞毒性導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力受損，而非調(diào)控目的基因的表達(dá)。本研究中合成的靶向Survivin的ASO能夠有效下調(diào)Survivin基因和蛋白的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡，說明根據(jù)Survivin mRNA設(shè)計(jì)的ASO能發(fā)揮作用，為之后ASO的藥物研究提供了參考。

當(dāng)GFeNMB進(jìn)行藥物遞送時(shí)，不同于許多寡核苷酸通過共價(jià)偶聯(lián)脂質(zhì)、抗體、糖分子等來實(shí)現(xiàn)藥物遞送，使其更容易接近目標(biāo)細(xì)胞［39］。GFeNMB與單鏈寡核苷酸形成載藥體，單鏈核酸簡化藥物處理工序，不需要對寡核苷酸進(jìn)行其他修飾，一定程度上減少了對寡核苷酸的藥物前加工，將藥物制備工藝簡化，便于生產(chǎn)均一化產(chǎn)品，并且在運(yùn)載過程中GFeNMB的強(qiáng)吸附能力還能起到保護(hù)寡核苷酸的作用。脂質(zhì)體是常用的轉(zhuǎn)染試劑，本文毒性試驗(yàn)結(jié)果表明GFeNMB的細(xì)胞毒性遠(yuǎn)低于脂質(zhì)體，因此具有安全性優(yōu)勢；Western blot蛋白分析中以脂質(zhì)體為載體沒有明顯降低靶基因表達(dá)，以GFeNMB為載體時(shí)出現(xiàn)了明顯蛋白表達(dá)下降的情況，因此具有有效性。

憑借GFeNMB表面石墨烯層對單鏈核酸的吸附性和生物相容性，形成穩(wěn)定的GFeNMB-Survivin ASO復(fù)合體，通過磁場對載藥體的操縱將載藥體引入細(xì)胞內(nèi)后，單鏈核酸與互補(bǔ)鏈雜交脫離GFeNMB，ASO發(fā)揮作用抑制Survivin mRNA翻譯過程。以GFeNMB作為運(yùn)載工具，相比于轉(zhuǎn)染所用的脂質(zhì)體和轉(zhuǎn)染試劑，縮短了轉(zhuǎn)染時(shí)間，采用磁轉(zhuǎn)染方式，轉(zhuǎn)染工具簡易方便，只需要磁鐵磁吸處理，在磁場引導(dǎo)下就能完成轉(zhuǎn)染過程；就轉(zhuǎn)染效果來說，通過共聚焦顯微鏡觀察的磁轉(zhuǎn)染圖片可見GFeNMB具有核轉(zhuǎn)染的優(yōu)勢，我們推測這是GFeNMB運(yùn)載ASO調(diào)控靶基因作用優(yōu)于脂質(zhì)體的主要原因。GFeNMB制備簡單可控，它的磁靶向特性，磁轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的結(jié)果，為未來腫瘤疾病的磁靶向治療提供了基礎(chǔ)應(yīng)用價(jià)值，也提示GFeNMB未來有可能成為單鏈核酸轉(zhuǎn)染的通用工具。

總之，本研究根據(jù)Survivin mRNA設(shè)計(jì)的ASO是有效的，GFeNMB可安全有效性遞送ASO。GFeNMB-ASO復(fù)合材料的抗腫瘤作用有待后續(xù)體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)。