改良1,9-二甲基亞甲基藍(lán)法定量檢測巖藻多糖

趙薇萍 ， 齊藝惠 ， 李晶晶，2 ， 宋爽 ， 翟睿 ， 杜茜茜

1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.北京市計量檢測科學(xué)研究院，北京 100029；3.中國計量科學(xué)研究院國家市場監(jiān)管技術(shù)創(chuàng)新中心（質(zhì)譜）前沿計量科學(xué)中心，北京 100029

巖藻多糖（fucoidan）又名巖藻聚糖硫酸酯、褐藻糖膠，主要來源于海參體壁和褐藻細(xì)胞壁等，是一類主要由L-巖藻糖和硫酸基團(tuán)組成，并含有其他多種單糖（如半乳糖、甘露糖、木糖、葡萄糖醛酸和阿拉伯糖）的水溶性雜多糖［1］。研究表明，巖藻多糖具有多種生物活性，如抗炎［2］、抗腫瘤［3］、增加腸道益生菌豐度［4］、抗氧化［5］、免疫調(diào)節(jié)［6］、抗凝血［7］和抗病毒［8］等，其開發(fā)和利用備受關(guān)注，已被應(yīng)用于醫(yī)藥和食品行業(yè)，并顯示出了廣闊的應(yīng)用前景。

1，9-二甲基亞甲基藍(lán)（DMMB）比色法常用于檢測酸性多糖含量，也是巖藻多糖定量檢測的方法之一，具有方便快速、操作簡單等優(yōu)勢［9］。DMMB是一種醌亞胺類陽離子染色劑，在酸性介質(zhì)中，亞甲基藍(lán)的雜環(huán)氮原子因質(zhì)子化而帶正電，以陽離子狀態(tài)存在，因此能夠與帶負(fù)電荷的巖藻多糖形成可溶于水的異染變色配合物，導(dǎo)致溶液的顏色發(fā)生變化［10-11］。目前，常用的DMMB檢測方法是將4 mL濃度為10.7 mg·mL-1、pH 3.3的DMMB顯色液與0.18 mL巖藻多糖待測溶液混勻后測定［12］。但是，該方法在巖藻多糖的實際檢測中，存在巖藻多糖樣品和顯色液用量較大、可檢測濃度范圍窄、靈敏度差、易受雜質(zhì)干擾等問題，影響了該方法的推廣應(yīng)用，亟需進(jìn)一步改良。

本研究對DMMB法的檢測條件進(jìn)行了優(yōu)化，在保證檢測靈敏度和精密度的前提下，簡化了操作步驟，縮小了反應(yīng)體系，節(jié)省了檢測時間，拓寬了線性范圍，以期為巖藻多糖產(chǎn)品的質(zhì)量控制和研究開發(fā)提供快捷可靠的定量分析檢測手段。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 實驗材料 巖藻多糖購自山東日照潔晶集團(tuán)股份有限公司；DMMB購自Sigma公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）購自上海生工生物工程有限公司；巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)品購自Fluka公司。

1.1.2 實驗設(shè)備 多功能酶標(biāo)儀購自Tican公司；紫外可見分光光度計購自上海舜宇恒平科學(xué)儀器公司；0111DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器購自鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；AIR troller通風(fēng)櫥購自深圳朗飛氣流控制系統(tǒng)公司；Lambda 35紫外可見光譜儀購自PerkinElmer公司；XW-80A漩渦混合器購自上海精科有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紫外光譜測定 配制巖藻多糖-DMMB溶液，在室溫避光和不避光條件下放置0、10、20、30 min。以0.2 mL的去離子水為對照溶液。使用Lambda 35紫外-可見光譜儀在波長范圍為450～700 nm下進(jìn)行掃描，測定樣品的紫外光譜變化。

1.2.2 DMMB溶液濃度的優(yōu)化 DMMB染色液濃度分別設(shè)置為10.7、21.4、32.1、42.8、53.5 mg·L-1。分別加入0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mg·L-1巖藻多糖溶液10 μL于96孔酶標(biāo)板中，再分別加入上述濃度的DMMB溶液200 μL，振蕩，于525 nm處測吸光度值。

1.2.3 DMMB溶液pH的優(yōu)化 確定DMMB染色液濃度，將pH分別設(shè)置為2.3、2.8、3.3、3.8、4.3。分別加入1.2.2中不同濃度的巖藻多糖溶液10 μL于96孔酶標(biāo)板中，再分別加入上述不同pH的DMMB溶液200 μL，振蕩，于525 nm處測吸光度值。

1.2.4 其他物質(zhì)的影響 在巖藻多糖溶液中分別加入不同質(zhì)量的NaCl、乳清蛋白、魚膠原蛋白、海藻酸鈉，將其配成0、0.10、0.15、0.20、0.30 mg·mL-1雜質(zhì)-巖藻多糖溶液，混勻，取混合后溶液10 μL于96孔酶標(biāo)板中，加入DMMB溶液，于525 nm處測吸光度值。

1.2.5 線性范圍的確定 分別加入0、0.0125、0.0250、0.0500、0.0625、0.0750、0.1000、0.1500、0.2000、0.2500、0.3000、0.3500、0.4000、0.5000 mg·mL-1巖藻多糖溶液10 μL于96孔酶標(biāo)板中，加入42.8 mg·L-1、pH 3.3的DMMB溶液200 μL，振蕩，于525 nm處測吸光度值。標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)大于0.99，表示具有良好的線性關(guān)系。

1.2.6 加標(biāo)回收率實驗 取2種不同濃度的巖藻多糖樣品（樣品1、2中巖藻多糖濃度分別為0.033 mg·mL-1、0.018 mg·mL-1），加入2種不同水平的巖藻多糖標(biāo)準(zhǔn)品，按公式（1）測定其加標(biāo)回收率（3個重復(fù)）。加標(biāo)前后濃度均應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)。

式中，P表示加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的回收率（%）；X1表示加標(biāo)樣品測定值（g），X0表示原樣品測出的含被測成分量（g），m表示加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量（g）。

1.2.7 精密度實驗 精確稱取6份巖藻多糖樣品，測定平行樣品間的巖藻多糖含量，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation， RSD）。組內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不超過10%。

1.2.8 定量限和檢出限實驗 當(dāng)信噪比達(dá)到S/N=10時，此時測出的樣品的最小濃度值為定量限。當(dāng)信噪比達(dá)到S/N=3時，此時測出的樣品的最小濃度值為檢出限。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析 實驗結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，并采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析和獨(dú)立樣本t檢驗。P＜0.05認(rèn)為組間存在統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 DMMB溶液濃度的優(yōu)化

為了確定DMMB顯色法中顯色液的最佳濃度，本實驗對不同濃度DMMB-巖藻多糖顯色液的吸光度值和線性范圍進(jìn)行了檢測。實驗結(jié)果如圖1所示，當(dāng)巖藻多糖樣品濃度在0～0.3 mg·mL-1范圍內(nèi)，DMMB顯色液的濃度增大至42.8 mg·mL-1和53.5 mg·mL-1時，該方法顯示出了良好的線性關(guān)系（R2≥0.99）。根據(jù)中國藥典相關(guān)規(guī)定［13］，使用紫外分光光度計測定樣品吸光度時，要求測得的吸光度在0.2～0.8之間，以保證定量檢測的靈敏度，縮小檢測誤差。因此，DMMB顯色液的最佳濃度為42.8 mg·mL-1。

圖1 DMMB顯色液濃度對標(biāo)準(zhǔn)曲線的影響Fig. 1 The effect of DMMB concentration on standard curve

2.2 DMMB溶液pH的優(yōu)化

本實驗使用2.1優(yōu)化出的最佳DMMB濃度（42.8 mg·mL-1）進(jìn)一步確定DMMB顯色法中顯色液的最佳pH。通過改變DMMB顯色液的pH，觀察DMMB-巖藻多糖顯色液的吸光度和線性范圍，以確定最佳的顯色條件［14］。實驗結(jié)果如圖2所示，當(dāng)巖藻多糖樣品濃度在0～0.3 mg·mL-1范圍內(nèi)，DMMB溶液pH為3.3、3.8和4.3時，DMMB-巖藻多糖顯色液的吸光度值顯示出了良好的線性關(guān)系（R2≥0.99）。由于DMMB溶液的pH為3.8和4.3，巖藻多糖樣品濃度大于0.25 mg·mL-1時，DMMB-巖藻多糖顯色液的吸光度值大于0.8，不能保證檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性。因此，最終選定DMMB顯色液的最佳pH為3.3。

圖2 DMMB溶液pH對標(biāo)準(zhǔn)曲線的影響Fig. 2 The effect of DMMB pH on standard curve

2.3 最佳測量波長的確定

為了確定檢測方法的最佳測量波長，研究光照對DMMB-巖藻多糖顯色液吸光度值的影響，本實驗使用不含巖藻多糖的DMMB溶液作為空白對照，在0～30 min時間范圍內(nèi)對避光和不避光的DMMB-巖藻多糖顯色液的紫外光譜進(jìn)行檢測。實驗結(jié)果如圖3所示，DMMB-巖藻多糖顯色液與空白對照組在波長為525 nm處的紫外吸收差值最大，因此選定525 nm為DMMB-巖藻多糖顯色液的最佳測量波長，與劉紅英等［15］的結(jié)果一致。由實驗結(jié)果還可看出，在相同時間下，避光放置的顯色液的吸光度在525 nm處的降低程度明顯高于未避光的顯色液，因此，應(yīng)在避光條件下完成DMMB-巖藻多糖顯色液的檢測。

2.4 最佳檢測時間的選擇

由于DMMB溶液和聚陰離子間的相互作用是可逆的，在實際的檢測過程中，隨著放置時間的延長，DMMB-巖藻多糖顯色液的吸光度值會逐漸降低［16-17］。為了確定最佳的檢測時間，本實驗在DMMB與巖藻多糖混合后的30 min內(nèi)，對顯色液的吸光度在525 nm處進(jìn)行監(jiān)測。如圖4所示，隨著放置時間延長，DMMB-巖藻多糖顯色液的吸光度值呈明顯的降低趨勢。為了保證檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性，應(yīng)盡快完成檢測。此外，為了將誤差控制在1%以內(nèi)，建議在巖藻多糖溶液與DMMB溶液混合后10～15 min完成吸光度檢測。

圖4 顯色液的吸光度變化Fig. 4 Absorbance change of chromogenic solution

2.5 方法學(xué)結(jié)果考察

本實驗采用改良后的DMMB法對不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品中巖藻多糖含量進(jìn)行了線性范圍檢測，并選取2種樣品進(jìn)行回收率和精密度考察。結(jié)果表明，在0.0125～0.3000 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線為y=1.3275x+0.443，R2=0.9913，其相關(guān)系數(shù)大于0.99，即顯示出了良好的線性關(guān)系。由表1可知，改良后的檢測方法加標(biāo)回收率均符合2015年頒布的中國藥典［13］相關(guān)規(guī)定，即回收率在90%～108%以內(nèi)。2種樣品的組內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均不超過10%。因此可證明改良后的檢測方法具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。改良后DMMB法的反應(yīng)體系減小，可在節(jié)約巖藻多糖樣品的同時簡化實驗操作，節(jié)約檢測時間；其線性范圍較原方法的0～0.1 mg·mL-1相比，擴(kuò)寬了3倍。

表1 回收率和精密度考察結(jié)果Table 1 The results of recovery and precision

2.6 雜質(zhì)對DMMB法檢測巖藻多糖的影響

在實際檢測過程中，巖藻多糖樣品中可能存在可溶性鹽、蛋白質(zhì)以及海藻酸鈉的干擾［18］。因此，本實驗考察了氯化鈉、海藻酸鈉、乳清蛋白和膠原蛋白這些巖藻多糖中常見雜質(zhì)對檢測結(jié)果的影響。如圖5A所示，氯化鈉濃度≤0.3 mg·mL-1時，不影響檢測結(jié)果。圖5B中，在海藻酸鈉濃度≤0.01 mg·mL-1時，其吸光度值沒有顯著性差異；而當(dāng)樣品中海藻酸鈉濃度大于0.01 mg·mL-1時，其吸光度值明顯升高。這種現(xiàn)象是由于海藻酸鈉也是一種酸性多糖，在溶液中可以與DMMB發(fā)生特異性異染現(xiàn)象從而導(dǎo)致溶液的顏色變化，這與Richardson等［19］研究結(jié)果一致。因此，改進(jìn)后的檢測方法幾乎不能排除海藻酸鈉雜質(zhì)的干擾，只可對低海藻酸鈉雜質(zhì)含量的樣品進(jìn)行測定。如圖5C～D所示，向巖藻多糖樣品中分別添加不同含量的乳清蛋白和膠原蛋白后進(jìn)行顯色反應(yīng)，當(dāng)樣品中膠原蛋白含量是巖藻多糖含量的2倍時，其最終測定的吸光度值沒有顯著性差異。由上述實驗結(jié)果可以看出，改良后的檢測方法可在樣品中的蛋白質(zhì)雜質(zhì)含量低于或等于巖藻多糖含量時，完成待測樣品中巖藻多糖含量的精確測量。超出該范圍可能會導(dǎo)致測量結(jié)果低于該樣品中巖藻多糖的實際含量。因此，改良后的檢測方法不會受樣品中氯化鈉雜質(zhì)的影響，而當(dāng)樣品中乳清蛋白雜質(zhì)的添加量超過溶液中巖藻多糖含量的1倍（＞0.2 mg·mL-1）時，其吸光度值會有一定的降低。因此在采用DMMB法檢測巖藻多糖時，應(yīng)預(yù)先除去海藻酸鈉，以免對實驗結(jié)果產(chǎn)生誤差。

圖5 雜質(zhì)對DMMB法檢測巖藻多糖的影響Fig. 5 The effects of impurities on DMMB method for determination of fucoidan

3 討論

巖藻多糖是一種具有多種生物活性的海洋活性多糖［20］。由于巖藻多糖來源廣泛，具有多種生物活性且易提取，有望被開發(fā)成為21世紀(jì)的新藥原料［21］。巖藻多糖含量是評價巖藻多糖產(chǎn)品質(zhì)量的重要指標(biāo)，現(xiàn)今常用的巖藻多糖定量檢測方法是DMMB顯色法和HPLC法。DMMB比色法是一種常用的檢測酸性多糖含量的方法，相比于HPLC法具有方便快速，操作簡單等優(yōu)勢，已被廣泛應(yīng)用于酸性多糖的檢測中［22］。目前常用的DMMB檢測方法操作步驟復(fù)雜、線性范圍較窄（0～0.1 mg·mL-1）、精密度差、反應(yīng)體系大，容易造成樣品的浪費(fèi)，存在一定的局限性，不能實現(xiàn)巖藻多糖的快速定量檢測。因此，對現(xiàn)有定量檢測方法進(jìn)行改良是十分必要的。本研究對DMMB法檢測巖藻多糖含量的方法條件進(jìn)行了改良。與原方法相比，DMMB溶液濃度提升至42.8 mg·mL-1，在保持pH 3.3的同時，反應(yīng)體系明顯減??；避光反應(yīng)在10～15 min內(nèi)進(jìn)行檢測，可在節(jié)約巖藻多糖樣品的同時，簡化實驗操作，節(jié)約檢測時間。該方法還將檢測的線性范圍擴(kuò)寬至0.0125～0.3000 mg·mL-1，是原方法的3倍。除此之外，還對改良后的方法進(jìn)行了方法學(xué)分析，結(jié)果表明改良后檢測方法的加標(biāo)回收率在90%～108%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均在10%以下，符合中國藥典的相關(guān)規(guī)定，滿足檢測要求。

綜上，本研究建立了一種簡便、快捷，可實現(xiàn)巖藻多糖含量快速檢測的方法。改良后的檢測方法能夠更好地滿足巖藻多糖高效定量的需求，助力巖藻多糖的產(chǎn)品質(zhì)量控制和研究開發(fā)，為巖藻多糖的進(jìn)一步研究和開發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。本研究雖然對巖藻多糖的定量檢測方法進(jìn)行了改良，具有較好的線性關(guān)系。然而，巖藻多糖提取過程中是否有其他雜質(zhì)會對后序測定產(chǎn)生干擾，仍需要進(jìn)一步深入研究。