乙?；ㄉ虻鞍纵d酶顆粒的制備及表征

李薇 ， 石愛(ài)民 ， 焦博 ， 王強(qiáng)

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193

脂肪酶被廣泛用于催化脂類水解、酯交換、酯化等反應(yīng)，目前在燃料、制藥、化妝品和食品工業(yè)等領(lǐng)域備受青睞。脂肪酶具有高選擇性，可以替代傳統(tǒng)方法中的催化劑，在許多科學(xué)領(lǐng)域引起了研究人員的極大興趣。然而，由于游離脂肪酶存在穩(wěn)定性差、重復(fù)使用率低、對(duì)反應(yīng)介質(zhì)敏感等缺點(diǎn)，其應(yīng)用存在一定的局限性［1］。固定化脂肪酶可以提高脂肪酶的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性，增強(qiáng)脂肪酶的重復(fù)利用性、特異性和物理強(qiáng)度［2-3］，從而促進(jìn)脂肪酶活性位點(diǎn)與底物分子的接觸，在一定程度上減少擴(kuò)散阻力［4］，提高催化活性，促進(jìn)反應(yīng)進(jìn)行。近年來(lái)，脂肪酶固定化的研究受到了越來(lái)越多科研工作者的關(guān)注。適合的固定化方法是固定化酶制備過(guò)程中重要的一步［5］。固定化過(guò)程影響脂肪酶的催化效率和重復(fù)利用率等。通常，根據(jù)脂肪酶與固定化載體之間的相互作用將固定化方法分為物理法和化學(xué)法2類，其中物理法有吸附法［6］和包埋法［7］，化學(xué)法有交聯(lián)法［8］和共價(jià)結(jié)合法［9］等。

常用于脂肪酶固定化的材料有中空材料［10］、無(wú)機(jī)氧化物［11］以及碳材料［12］（石墨烯和碳納米管）等，這些固載材料一般都具有多孔性，能夠提供與脂肪酶結(jié)合的豐富位點(diǎn)，以提高脂肪酶的固載效率。但是這些材料多是非食品級(jí)，可能會(huì)存在污染產(chǎn)物、危害環(huán)境等問(wèn)題。隨著人們對(duì)食品安全和環(huán)境保護(hù)的意識(shí)越來(lái)越強(qiáng)，開(kāi)發(fā)食品級(jí)脂肪酶固載材料的需求越來(lái)越大。近年來(lái)，使用蛋白［13-14］、多糖［15］等天然大分子制備固體或軟顆粒作為穩(wěn)定乳液及固載材料等方面得到了廣泛應(yīng)用。前期研究發(fā)現(xiàn)，花生分離蛋白微凝膠顆粒（peanut-protein-isolate microgel particles，PPIMP）具有較高的乳化性和界面吸附性，可以作為良好的穩(wěn)定劑［16-17］。Guan等［18］發(fā)現(xiàn)α-乳清蛋白納米管（α-lac NTs）可以作為脂肪酶的固定化載體，提高脂肪酶的催化效率。此外，有研究發(fā)現(xiàn)乙酰基作為親電基團(tuán)與蛋白質(zhì)側(cè)鏈中的親核基團(tuán)發(fā)生取代反應(yīng)，會(huì)使蛋白正電荷下降，由此減弱蛋白在酸性條件下（pH 5.5）的聚集沉降?；诖?，本研究使用乙酰化花生球蛋白作為脂肪酶的固載材料制備蛋白載酶顆粒（lipase-AAPs），提高了游離脂肪酶的比活性，可以在酸性條件下（pH 5.5）發(fā)揮催化活性。

本文使用丁二酸酐對(duì)花生球蛋白進(jìn)行乙?；幚淼玫搅艘阴；ㄉ虻鞍祝名}熱法制備乙?；ㄉ虻鞍最w粒（acetylated arachin particles，AAPs），使用戊二醛（glutaraldehyde，GDA）對(duì)AAPs和脂肪酶進(jìn)行交聯(lián)固定，改變交聯(lián)固定過(guò)程中乙?；潭?、GDA濃度、交聯(lián)時(shí)間、脂肪酶濃度以及脂肪酶與顆粒比例，優(yōu)化了固定化脂肪酶的固載效率和比活性。對(duì)固載前后顆粒的微觀形態(tài)進(jìn)行了觀察，并通過(guò)傅里葉變換紅外光譜（fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）分析AAPs和脂肪酶的相互作用，以期為制備天然的脂肪酶固定化材料提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

花生脫脂粉購(gòu)自青島長(zhǎng)壽食品有限公司；丁二酸酐購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；游離脂肪酶購(gòu)自北京大宏利輝生物科技中心；無(wú)水乙醇、氯化鈉（NaCl）和碳酸鈉（Na2CO3）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Cy5熒光染色劑購(gòu)自泛博生物有限公司；透析袋（10 kD）GDA、棕櫚酸酯（nitrophenyl palmitate，p-NPP）購(gòu)自北京萃鋒試劑有限公司；對(duì)硝基苯酚（p-nitrophenol，p-NP）購(gòu)自上海薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.2 儀器

恒溫水浴鍋購(gòu)自常州金壇良友儀器有限公司；F-2500熒光分光光度計(jì)購(gòu)自日本日立公司；離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Thermo Scientific公司；pH計(jì)購(gòu)自瑞士Mettler Toledo公司；剪切機(jī)和磁力攪拌器購(gòu)自德國(guó)IKA公司；Spectra MAX 190酶標(biāo)儀購(gòu)自美谷分子公司；TENSOR 27傅里葉變換紅外光譜儀（fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）購(gòu)自德國(guó)布魯克公司；HITACHI掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM）購(gòu)自日本日立公司。

1.3 花生球蛋白提取

參考本團(tuán)隊(duì)前期方法［19］提取花生球蛋白。

1.4 花生球蛋白乙?；男?/h3>

參考Wang等［20］的方法，略有改動(dòng)。將干燥的花生球蛋白粉末分散于去離子水中（質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為10.0%），用6 mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至10.5，水浴加熱至30 ℃，邊攪拌邊添加含30%蛋白質(zhì)干基（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的丁二酸酐，同時(shí)要控制溶液保持pH在10.5。得到的?；ㄉ虻鞍兹芤河?0 kD透析袋透析24 h。

按照以下方法測(cè)定?；龋菏褂?.1 mol·L-1NaOH配制上述?；蠛臀歹；? mg·mL-1蛋白溶液，然后與等體積質(zhì)量百分?jǐn)?shù)0.1%的茚三酮混合，沸水浴15 min，后置于冰水浴中冷卻。冷卻后每根試管加入樣品溶液等體積的50%（體積分?jǐn)?shù)）的乙醇，用分光光度計(jì)在570 nm處測(cè)定吸光度。?；雀鶕?jù)公式（1）進(jìn)行計(jì)算：

其中，C0和C1分別是初始樣品和酰化改性樣品的吸光度。

1.5 AAPs制備

AAPs制備參考Liu等［21］的方法，略有改動(dòng)。將透析后的花生球蛋白90 ℃水浴加熱30 min，pH調(diào)節(jié)至5.5，迅速冷卻至室溫后濃度稀釋至6.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），并加入700 mmol·L-1NaCl顆粒制備乙?；ㄉ虻鞍最w粒。

1.6 固定化酶固載效率和比活性測(cè)定

固定化酶的固載效率和比活性測(cè)定參考Guan等［18］的方法進(jìn)行。按照脂肪酶∶AAPs為1∶4的比例加入濃度為10%的脂肪酶，邊攪拌（300 r·min-1）邊分5次加入共400 μL濃度為1.0%的GDA，室溫進(jìn)行交聯(lián)固定，固定期間一直攪拌，交聯(lián)固定時(shí)間為1 h，該過(guò)程注意避光操作。交聯(lián)完成后測(cè)定固載效率和比活性。

1.6.1 固定化酶固載效率測(cè)定 取10 mL 10%脂肪酶溶液與5 mL Cy5熒光染色劑避光攪拌混合染色15 min，轉(zhuǎn)移到透析袋中，放到大燒杯中加入去離子水，避光攪拌透析5.5 h。、透析完后取出大透析袋中的混合物并分別稀釋0、5、10、20、40、50倍測(cè)定熒光強(qiáng)度。熒光強(qiáng)度對(duì)脂肪酶濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。

圖1 蛋白濃度-熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of protein concentration and fluorescence intensity

固載效率測(cè)定參考Guan等［18］方法進(jìn)行。取10 mL 12.5%的脂肪酶加入6.25 mL的Cy5熒光染色劑，避光攪拌混合染色15 min，轉(zhuǎn)移到透析袋中。取一定體積和濃度的AAPs按照一定的脂肪酶與顆粒比例加入已染色的脂肪酶（AAPs和脂肪酶總體積保持10 mL），邊攪拌邊分5次加入共400 μL的GDA，于室溫下進(jìn)行交聯(lián)固定，固定期間持續(xù)攪拌且注意避光操作。固定化后的脂肪酶溶液10015 r·min-1離心15 min（標(biāo)記好離心前的體積或質(zhì)量），棄掉上清液，加入一定質(zhì)量的水，保證離心前后離心管的質(zhì)量相同，制備得到熒光染色的顆粒，使用6000 r·min-1剪切1 min破碎，測(cè)定熒光強(qiáng)度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定被固定的脂肪酶濃度，按照公式（2）計(jì)算固載效率。

1.6.2 游離脂肪酶和固定化酶比活性測(cè)定 將4 mL 50 mmol·L-1的脂肪酶分別與4、8、12、16、20 mg的p-NP和4 mL 0.5 mol·L-1Na2CO3混合，稀釋200倍后于波長(zhǎng)410 nm處測(cè)定吸光度，吸光度對(duì)P-NP濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。空白為不添加p-NP的酶液和Na2CO3的混合溶液。脂肪酶比活性測(cè)定具體為：4 mL礦物油溶解40 mg對(duì)硝基苯基棕櫚酸酯，加入4 mL待測(cè)游離脂肪酶和固定化酶，使用剪切機(jī)于13000 r·min-1條件剪切1 min。加入4 mL 0.5 mol·L-1Na2CO3終止反應(yīng)，然后6000 r·min-1條件離心5 min得到水相，于波長(zhǎng)410 nm處測(cè)定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定被固定的脂肪酶的酶活，見(jiàn)式（3）。

1.7 固載條件對(duì)固定化酶固載效率和比活性的影響

1.7.1 乙?；潭葘?duì)固載效率和比活性的影響按照1.4中方法對(duì)花生球蛋白進(jìn)行乙?；男裕《狒砑拥鞍缀浚ǖ鞍踪|(zhì)干基質(zhì)量）分別為0、15%、30%和45%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），分別對(duì)應(yīng)乙酰化程度為0、9.31%±0.01%、41.71%±0.01%和53.80%±0.30%。制備完AAPs后按照脂肪酶：AAPs為1∶4的比例加入濃度為10%的已染色的脂肪酶，邊攪拌（攪拌條件為300 r·min-1）邊分5次加入共400 μL濃度為1.0%的GDA，室溫下進(jìn)行交聯(lián)固定1 h，固定期間一直攪拌，此過(guò)程注意避光操作。交聯(lián)后測(cè)定固載效率和比活性。

1.7.2 GDA濃度 按照脂肪酶：AAPs為1∶4的比例加入已染色脂肪酶（質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為10%），邊攪拌（攪拌條件為300 r·min-1）邊分5次加入共400 μL濃度分別為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的GDA，室溫下交聯(lián)固定1 h，固定期間持續(xù)攪拌，此過(guò)程需避光操作。交聯(lián)后測(cè)定固載效率和比活性。

1.7.3 交聯(lián)時(shí)間對(duì)固載效率和比活性的影響 按照脂肪酶：AAPs為1∶4的比例加入濃度為10%已染色的脂肪酶，邊攪拌（攪拌條件為300 r·min-1）邊分5次加入共400 μL的濃度為1.0 %的GDA于室溫進(jìn)行交聯(lián)固定，固定期間一直攪拌，交聯(lián)固定時(shí)間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h。交聯(lián)完后確定固載效率和比活性。

1.7.4 脂肪酶濃度對(duì)固載效率和比活性的影響按照脂肪酶：AAPs為1∶4的比例分別加入濃度為5.0%、7.5%、10.0%、12.5%、15.0%已染色的脂肪酶，邊攪拌（攪拌條件為300 r·min-1）邊分5次加入共400 μL的濃度為1.0%的GDA，室溫下進(jìn)行交聯(lián)固定1 h，固定期間持續(xù)攪拌。交聯(lián)完后確定固載效率和比活性。

1.7.5 脂肪酶與AAPs比例對(duì)固載效率和比活性的影響 分別按照脂肪酶：AAPs為1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8的比例分別加入濃度為10.0%已染色的脂肪酶，邊攪拌（攪拌條件為300 r·min-1）邊分5次加入共400 μL的濃度為1.0%的GDA，室溫進(jìn)行交聯(lián)固定1 h，固定期間持續(xù)攪拌。交聯(lián)完后確定固載效率和比活性。

1.8 AAPs-lipase的微觀結(jié)構(gòu)

AAPs-lipase微觀結(jié)構(gòu)的觀察參考王強(qiáng)研究團(tuán)隊(duì)前期方法并略有改動(dòng)［14］。將凍干后的AAPs、交聯(lián)后的AAPs以及AAPs-lipase分別粘在銅帶上，噴金后使用SEM觀察微觀結(jié)構(gòu)。

1.9 AAPs-lipase傅里葉變換紅外光譜分析

傅里葉變換紅外光譜分析參考葛艷爭(zhēng)等［22］的方法進(jìn)行。固體粉末樣品的制備采用溴化鉀壓片法：取適量溴化鉀晶體（粉末）于瑪瑙研缽中充分研磨成細(xì)粉末，裝入模具內(nèi)，在液壓機(jī)上壓制成片，作為空白樣品測(cè)定；然后將溴化鉀粉末與少量?jī)龈晒腆w樣品（100∶1）混合制成片用于檢測(cè)。

1.1 0 數(shù)據(jù)分析

每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，取平均值，使用Origin Pro 2021作圖。采用SPSS Statistics 26進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和顯著性分析。實(shí)驗(yàn)中P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙?；潭葘?duì)固載效率和比活性的影響

丁二酸酐的乙酰基與蛋白發(fā)生乙?；磻?yīng)，會(huì)影響AAPs與脂肪酶的交聯(lián)，因此有必要探究乙?；潭葘?duì)固載效率和比活性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著乙?；潭仍龃?，lipase-AAPs的固載效率（圖2）呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，說(shuō)明適當(dāng)?shù)囊阴；潭扔欣谥久概cAAPs的交聯(lián)固定，但隨著乙?；潭壤^續(xù)增大，由于乙?；c蛋白質(zhì)側(cè)鏈氨基的酰胺反應(yīng)，減少了AAPs與脂肪酶以及GDA羥基之間的交聯(lián)位點(diǎn)，使得lipase-AAPs固載效率下降。比活性（圖2）隨著乙?；潭仍龃笾饾u減小，這可能是由于酰胺反應(yīng)掩蓋了脂肪酶部分活性位點(diǎn)。同時(shí)過(guò)多的丁二酸酐會(huì)破壞脂肪酶活性位點(diǎn)，進(jìn)而導(dǎo)致脂肪酶活性下降。因此，后續(xù)選擇乙?；潭葹?1.71%±0.1%的AAPs進(jìn)行脂肪酶的交聯(lián)固定。

圖2 乙酰化程度量對(duì)lipase-AAPs固載效率和比活性影響Fig. 2 Effect of the degree of acetylation on immobilization efficiency and specific activity of lipase-AAPs

2.2 GDA濃度對(duì)固載效率和比活性的影響

采用雙功能試劑GDA作為交聯(lián)劑，一方面GDA上的醛基可以與蛋白顆粒表面的羥基發(fā)生羥醛縮合反應(yīng)使得蛋白之間發(fā)生交聯(lián)；另一方面也可以與脂肪酶上的羥基或氨基發(fā)生羥醛縮合或席夫堿反應(yīng)，使得酶與蛋白顆粒之間的結(jié)合牢固［23］。如圖3所示，本研究探究了不同GDA濃度對(duì)lipase-AAPs比活性的影響，發(fā)現(xiàn)隨著GDA濃度增大，lipase-AAPs的比活性先上升，當(dāng)GDA濃度增大到1.0%時(shí)，比活性達(dá)到最大，為1.74±0.07 U·mg-1，這可能是因?yàn)殡S著GDA濃度的增大，更多的脂肪酶可以牢固的結(jié)合在蛋白顆粒表面，并且保持開(kāi)放的催化構(gòu)象，脂肪酶“蓋子”呈現(xiàn)打開(kāi)的狀態(tài)，脂肪酶催化有效性提高，脂肪酶活性增大［24］。GDA濃度在0.5%～3.0%之間時(shí)，隨著濃度的增加，固載效率增大。同時(shí)，隨著GDA濃度增大，更多的醛基與蛋白和脂肪酶發(fā)生交聯(lián)，使得更多的脂肪酶交聯(lián)固定在AAPs上。更多的脂肪酶固定在AAPs上，導(dǎo)致空間位阻增大，造成擁擠效應(yīng)［25］，這也是比活性下降的原因。當(dāng)GDA濃度過(guò)高時(shí)，過(guò)多的GDA會(huì)包裹住脂肪酶的活性位點(diǎn)，使得脂肪酶比活性下降［26］。因此，后續(xù)使用1.0%的GDA對(duì)顆粒和脂肪酶進(jìn)行交聯(lián)。

圖3 GDA濃度對(duì)lipase-AAPs固載效率和比活性影響Fig. 3 Effect of GDA concentration on immobilization efficiency and specific activity of lipase-AAPs

2.3 交聯(lián)時(shí)間對(duì)固載效率和比活性的影響

結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖4），隨著交聯(lián)時(shí)間的延長(zhǎng)固載效率先增加后減小，這可能是因?yàn)殡S著交聯(lián)時(shí)間的延長(zhǎng)，GDA和脂肪酶與AAPs之間充分反應(yīng)，促進(jìn)了脂肪酶在顆粒上的固定。當(dāng)交聯(lián)時(shí)間為1 h時(shí)固載效率達(dá)到最大。但隨著時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)，固載效率下降，這可能是因?yàn)殡S著交聯(lián)時(shí)間延長(zhǎng)，GDA發(fā)生自交聯(lián)并促使蛋白與蛋白之間的交聯(lián)，減弱了脂肪酶與AAPs的交聯(lián)。脂肪酶比活性隨著交聯(lián)時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)。這與陳強(qiáng)［26］使用陶瓷吸附乳糖酶輔助GDA交聯(lián)的研究結(jié)果一致。陳強(qiáng)［26］將乳糖酶與陶瓷交聯(lián)固定，需要GDA交聯(lián)4 h，本實(shí)驗(yàn)縮短了脂肪酶與蛋白顆粒交聯(lián)的時(shí)間。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，AAPs已完成與脂肪酶的交聯(lián)，綜合考慮1 h為最佳交聯(lián)時(shí)間。

圖4 交聯(lián)時(shí)間對(duì)lipase-AAPs固載效率和比活性影響Fig. 4 Effect of crosslinking time on the immobilization efficiency and specific activity of lipase-AAPs

2.4 脂肪酶濃度對(duì)固載效率和比活性的影響

結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖5），隨著脂肪酶濃度的增加固載效率呈下降趨勢(shì)，這可能是因?yàn)殡S著脂肪酶濃度升高，GDA會(huì)引起脂肪酶之間的交聯(lián)，減少了脂肪酶與顆粒之間的交聯(lián)，從而降低了固載效率。同時(shí)，隨著脂肪酶濃度升高脂肪酶比活性呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)榍捌谥久笣舛壬?，脂肪酶在顆粒上交聯(lián)，其比活性升高，脂肪酶濃度過(guò)大產(chǎn)生位阻效應(yīng)，降低了脂肪酶的比活性。這與前述增大GDA濃度提高脂肪酶的固載效率降低比活性的結(jié)果是一致的。在王琳［27］的研究中采用共價(jià)結(jié)合的方法對(duì)脂肪酶與磁性納米顆粒進(jìn)行結(jié)合固定也呈現(xiàn)出相似的結(jié)果。王琳［27］認(rèn)為隨著脂肪酶濃度增大脂肪酶易在蛋白顆粒的表面發(fā)生團(tuán)聚，掩蓋彼此的活性中心，影響脂肪酶與底物的結(jié)合，使比活性下降。因此，后續(xù)采用10%的脂肪酶制備固定化酶。

圖5 脂肪酶濃度對(duì)lipase-AAPs固載效率和比活性影響Fig. 5 Effect of lipase concentration on the immobolization efficiency and specific activity of lipase-AAPs

2.5 脂肪酶與AAPs比例對(duì)固載效率和比活性的影響

固載效率隨著AAPs占比的增大而減小，這是因?yàn)锳APs占比增大在GDA的作用下蛋白顆粒之間彼此交聯(lián)，降低了其與脂肪酶之間的交聯(lián)。這與上述改變脂肪酶濃度的結(jié)果是一致的。比活性隨著顆粒占比的增加呈先增加后減小的趨勢(shì)。當(dāng)脂肪酶與顆粒比例為1∶4時(shí)，固載效率為12.95%±0.03%（圖6）。前期比活性增加是因?yàn)樵谥久概c蛋白顆粒的交聯(lián)作用下脂肪酶移至油水界面，增大了催化活性。而隨著顆粒占比的增大，更多顆粒發(fā)生自身交聯(lián)的同時(shí)，會(huì)掩蓋脂肪酶的活性位點(diǎn)降低脂肪酶的比活性。綜合考慮，制備Lipase-AAPs的脂肪酶與AAPs的比例為1∶4。

圖6 脂肪酶與AAPs比例對(duì)lipase-AAPs固載效率和比活性影響Fig. 6 Effect of the ratio of lipase to AAPs on immobilization efficiency and specific activity of lipase-AAPs

圖7 AAPs、GDA交聯(lián)后的AAPs以及l(fā)ipase-AAPs的SEM圖像Fig. 7 SEM images of AAPs, AAPs after GDA crosslinking and lipase-AAPs

圖8 脂肪酶、AAPs和lipase-AAPs傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 8 FTIR of lipase, AAPs and lipase-AAPs

2.6 最佳條件下的固載效率和比活性

綜上所述，當(dāng)乙?；潭葹?1.71%±0.01%，GDA濃度為1.0%，交聯(lián)時(shí)間1 h，脂肪酶濃度為10.0%以及脂肪酶與AAPs比例為1∶4時(shí)，制備lipase-AAPs，此時(shí)lipase-AAPs的固載效率和比活性分別為12.95%±0.03%和1.74±0.07 U·mg-1，其中比活性為游離脂肪酶的120%。比活性上升的原因可能是在測(cè)定脂肪酶比活性時(shí)，脂肪酶被固定在蛋白顆粒上可以強(qiáng)烈地吸附在蛋白顆粒表面，而在油水界面上的脂肪酶構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚愿叩拈_(kāi)放形式［24］。蛋白載酶顆粒在催化底物（油相）時(shí)，由于剪切過(guò)程產(chǎn)生了無(wú)數(shù)個(gè)小液滴，增大了催化的界面面積，縮短了傳質(zhì)距離［21］，因此有利于催化活性的提高。同時(shí)，蛋白載酶顆粒在油水界面上吸附有利于與底物（油相）的接觸，脂肪酶可以在界面處發(fā)揮催化作用，增大了其催化的有效性。

2.7 AAPs、GDA交聯(lián)后的AAPs以及l(fā)ipase-AAPs微觀結(jié)構(gòu)

使用SEM分別觀察AAPs、GDA交聯(lián)后的AAPs以及l(fā)ipase-AAPs。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AAPs呈現(xiàn)出不規(guī)則球狀，Liu等［28］通過(guò)原子力顯微鏡觀察到使用鹽熱法制備的大豆球蛋白納米顆粒大多也呈現(xiàn)出橢球形和不規(guī)則球形，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似。經(jīng)過(guò)GDA交聯(lián)后的AAPs依然呈現(xiàn)出上述形狀，并且在GDA的交聯(lián)作用下顆粒彼此之間更加緊密。Lipase-AAPs仍為緊密橢球形或球形，在視野中出現(xiàn)較大的脂肪酶團(tuán)簇，這在Guan等［18］通過(guò)透射電鏡觀察利用GDA將脂肪酶固載到α-乳白蛋白納米管（α-lac-NTs）上的結(jié)果類似。

2.8 Lipase-AAPs傅里葉變換紅外光譜分析

脂肪酶在1060～1070 cm-1處有透射峰，這主要是由C—O拉伸引起的，而AAPs在該波長(zhǎng)處沒(méi)有出現(xiàn)此透射峰，交聯(lián)后形成的lipase-AAPs在該范圍內(nèi)出現(xiàn)透射峰。AAPs在1630～1690 cm-1處有C=O伸縮振動(dòng)［29］，脂肪酶在該波長(zhǎng)處沒(méi)有相應(yīng)的透射峰，而lipase-AAPs在此處也表現(xiàn)出相應(yīng)的透射峰。AAPs在3300～3500 cm-1處存在較寬的N—H伸縮振動(dòng)［30］，lipase-AAPs也出現(xiàn)此透射峰。綜上說(shuō)明，脂肪酶與AAPs發(fā)生了交聯(lián)。

3 討論

實(shí)驗(yàn)探究了lipase-AAPs固載效率和比活性的最適條件，當(dāng)丁二酸酐添加量為蛋白質(zhì)干基質(zhì)量的30%（乙酰化程度為41.71%±0.01%）、GDA濃度為1.0%、交聯(lián)時(shí)間1 h、脂肪酶濃度為10.0%以及脂肪酶和AAPs比例為1∶4時(shí)，最終得到lipase-AAPs的最佳固載效率和比活性分別為12.95%±0.03%和1.74±0.07 U·mg-1，比活性為游離脂肪酶的120%。由此制備具有良好固載效率和比活性的lipase-AAPs。用SEM觀察顆粒微觀形態(tài)，AAPs、GDA交聯(lián)后的AAPs以及l(fā)ipase-AAPs，均呈現(xiàn)出不規(guī)則的球形，脂肪酶與AAPs經(jīng)GDA交聯(lián)后，有脂肪酶簇覆蓋在AAPs上。FTIR結(jié)果顯示，lipase與AAPs交聯(lián)后存在同lipase相同的C—O拉伸透射峰，脂肪酶與AAPs已共價(jià)交聯(lián)。

綜上可知，研究初步將脂肪酶與蛋白顆粒進(jìn)行了交聯(lián)固定，并使用對(duì)固載前后顆粒的微觀形態(tài)進(jìn)行了觀察，并通過(guò)FTIR分析了AAPs和脂肪酶的相互作用，為制備天然的脂肪酶固定化材料提供了理論依據(jù)。但是，目前對(duì)于脂肪酶與蛋白顆粒之間的分子相互作用機(jī)制尚不清楚，有待于通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬蛋白和脂肪酶之間的相互作用和構(gòu)象關(guān)系，對(duì)更加精細(xì)的分子相互作用變化進(jìn)行深入研究，以構(gòu)建更高比活性和固載效率的固定化酶顆粒。固定化酶顆粒有著廣闊的應(yīng)用前景，例如應(yīng)用到油脂脫酸、制備功能性油脂等，將為食品產(chǎn)業(yè)多樣化需求提供綠色可持續(xù)的途徑。