基于全基因組測(cè)序的丁酸梭菌安全性評(píng)價(jià)

高應(yīng)瑞 ， 康福忠 ， 孟鐵健 ， 劉珂飛 ， 王調(diào)調(diào) ， 陳金艷 ， 孫彤

1.天津生機(jī)集團(tuán)股份有限公司，天津 300384；2.天津市農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)中心，天津 300193

丁酸梭菌（Clostridium butyricum），又名酪酸菌、酪酸梭菌和丁酸梭狀芽孢桿菌［1］，在自然界中主要存在于動(dòng)物和人類(lèi)消化道、糞便以及環(huán)境土壤中［2］。丁酸梭菌是人體及動(dòng)物腸道的重要益生菌，能夠調(diào)節(jié)腸道微生物菌群，提高機(jī)體免疫力等，從而改善畜禽健康［3］。隨著丁酸梭菌潛在應(yīng)用價(jià)值的發(fā)現(xiàn)及逐漸增長(zhǎng)的需求，對(duì)丁酸梭菌菌株相關(guān)制品的安全性進(jìn)行評(píng)估已迫在眉睫，也亟需建立益生性丁酸梭菌的鑒定標(biāo)準(zhǔn)。

近年來(lái)，菌種的安全性日益受到相關(guān)行業(yè)人員和研究者的關(guān)注，而其對(duì)抗生素的耐藥性、及產(chǎn)毒能力和致病因子的存在成為其安全性判斷的重要依據(jù)。隨著基因測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，人們對(duì)微生物菌株安全性的認(rèn)識(shí)也在不斷深入。《益生菌的科學(xué)共識(shí)（2019年版）》中曾提出，對(duì)于新發(fā)現(xiàn)的菌株，應(yīng)該通過(guò)全基因組測(cè)序?qū)ζ渖镄畔⑦M(jìn)行分析與闡述，以此評(píng)估其耐藥性、致病性等特征［4］。因此，本研究從分子生物學(xué)、基因組學(xué)對(duì)丁酸梭菌的安全性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)研究，基于基因測(cè)序技術(shù)的生物信息學(xué)分析以篩查菌種中與抗生素耐藥、毒力和致病性基因，以期探究菌種潛在的安全性風(fēng)險(xiǎn)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌種及培養(yǎng)基 本研究所用的丁酸梭菌分離自健康雞腸道，并由生機(jī)集團(tuán)實(shí)驗(yàn)室保存。所用的培養(yǎng)基為硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基。

1.1.2 儀器與設(shè)備 AW200SG厭氧培養(yǎng)箱購(gòu)自ELECTROTEK依萊泰科公司；GI80TW立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器購(gòu)自致微（廈門(mén)）儀器有限公司；Qubit熒光定量?jī)x購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；Covaris超聲破碎儀購(gòu)自蘇州貝斯派生物科技有限公司；Agilent 2100 Bioanalyzer生物分析儀購(gòu)自安捷倫公司；Qubit dsDNA HS Assay Kit 500 assays試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher公司，Agencourt AMPure XP-Medium kit試劑盒購(gòu)自Bechman Coulter公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 蛋白胨15.0 g，酵母浸出粉5.0 g，葡萄糖5.0 g，硫乙醇酸鈉0.5 g，L-胱氨酸鹽酸鹽0.5 g，氯化鈉2.5 g，加入去離子水溶解、定容至1000 mL，并調(diào)整pH為7.4（固體培養(yǎng)基另需加入瓊脂20 g），121 ℃下高壓蒸汽滅菌培養(yǎng)基20 min。L-胱氨酸鹽酸鹽用無(wú)菌0.22 μm膜過(guò)濾后，無(wú)菌加入到滅菌后的培養(yǎng)基中。

1.2.2 菌株活化與培養(yǎng) 將實(shí)驗(yàn)室保存的丁酸梭菌甘油管用接種針穿刺于固體試管培養(yǎng)基上，37 ℃下培養(yǎng)18～20 h。待長(zhǎng)出明顯菌落后接種于試管液體培養(yǎng)液中，裝液量10 mL，然后于37 ℃靜止厭氧培養(yǎng)18 h。

1.2.3 菌株DNA提取 取少量待檢菌體于無(wú)菌研磨器中，研磨成粉末狀，后將其快速刮至10 mL離心管中，加入3.5 mL裂解液緩沖液1和100 μL蛋白酶K，并加入30 μL RNaseA，反復(fù)混勻數(shù)次，37 °C水浴30 min后，再加入1.2 mL裂解緩沖液2，反復(fù)混勻，55 °C水浴反應(yīng)120 min。

1.2.4 基因組DNA過(guò)柱純化 平衡Genomic-tip柱子，加入4 mL緩沖液QBT，待完全流出使用。將組織裂解好的樣本管，室溫離心10 min。將裂解后的上清液轉(zhuǎn)移至無(wú)菌5 mL離心管中，室溫離心5 min。將得到的上清溶液過(guò)Genomic-tip柱，使DNA被吸附在Genomic-tip柱吸附膜上，自然load流出柱子。加入QC wash buffer洗脫2次。用5 mL QF緩沖液洗脫吸附于膜上的DNA。用異丙醇沉淀洗脫下來(lái)的液體，反復(fù)混勻，-20 °C冰箱沉淀2 h以上。將用于沉淀的管從-20 °C拿出，離心10 min。用750 μL 75%酒精洗滌沉淀后轉(zhuǎn)移至2.0 mL離心管。繼續(xù)離心10 min，棄上清，室溫速甩30 s，晾干備用。根據(jù)DNA沉淀的大小加入適量的EB溶液于樣品管中，37 °C孵育30～60 min，直至樣品完全溶解，后放入4 °C冰箱進(jìn)入核酸質(zhì)檢環(huán)節(jié)。

1.2.5 DNA測(cè)序、質(zhì)控與組裝 基于PromethION測(cè)序儀全基因組DNA文庫(kù)構(gòu)建的基本操作。取一定量基因組DNA樣品，用Pippin HT進(jìn)行片段分選，篩選目的范圍內(nèi)的片段。配制反應(yīng)體系，適溫反應(yīng)進(jìn)行DNA末端修復(fù)和缺口（nick）修復(fù)。配制接頭連接反應(yīng)體系，適溫反應(yīng)使DNA與接頭連接，然后對(duì)文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)檢。激活處理芯片，選擇合適孔數(shù)芯片進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。去除質(zhì)量值不合格以及含N堿基數(shù)目總和超過(guò)10%的reads；去除adapter和duplication污染，得到Clean reads。測(cè)序得到原始數(shù)據(jù)為Polymerase reads，過(guò)濾掉測(cè)序接頭及低質(zhì)量等數(shù)據(jù)最終得到可用Subreads，并以.bam格式保存（proovread）。后對(duì)Subread進(jìn)行自糾正或混合糾正，得到Corrected reads?；贑orrected reads采用多種軟件分別組裝，最后選擇出最優(yōu)組裝結(jié)果。采用第二代小片段數(shù)據(jù)對(duì)其進(jìn)行單堿基糾正，以得到最優(yōu)序列。對(duì)組裝結(jié)果進(jìn)行序列成環(huán)判斷、基因組序列及質(zhì)粒序列區(qū)分［5-10］。

1.2.6 基因預(yù)測(cè)與注釋 采用Glimmer軟件進(jìn)行組裝結(jié)果的基因預(yù)測(cè)［10-12］。將預(yù)測(cè)得到基因的氨基酸序列與相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)：Gene Ontology（GO）［13-14］、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）［15］、Cluster of Orthologous Groups of proteins（COG）［16］、Virulence Factor Database（VFDB）進(jìn)行比對(duì)，以獲取相關(guān)功能注釋數(shù)據(jù)。所有的注釋均使用Diamond軟件以及各數(shù)據(jù)庫(kù)協(xié)調(diào)判定完成。

1.2.7 耐藥基因注釋 通過(guò)與CARD和ARDB數(shù)據(jù)庫(kù)相比較，發(fā)現(xiàn)了可能導(dǎo)致菌株耐藥的基因。參照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的《直接飼喂微生物和發(fā)酵制品生產(chǎn)菌株鑒定及其安全性評(píng)價(jià)指南》要求，在序列比對(duì)時(shí)，設(shè)置序列相似性≥80%，序列覆蓋度≥70%。

1.2.8 細(xì)菌致病菌毒力因子注釋 通過(guò)與VFDB數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析，對(duì)菌株基因組中可能存在的毒力基因進(jìn)行檢測(cè)。參照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的《直接飼喂微生物和發(fā)酵制品生產(chǎn)菌株鑒定及其安全性評(píng)價(jià)指南》要求，在序列比對(duì)時(shí)，設(shè)置序列相似性≥80%，序列覆蓋度≥70%。

1.2.9 比較基因組學(xué) 對(duì)測(cè)序菌株基因組序列、參考菌株基因組序列和基因集序列數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比分析，得出測(cè)序菌株與參考菌株之間的結(jié)構(gòu)差異、突變和菌株間親緣進(jìn)化關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁酸梭菌全基因組概況

如圖1所示，獲得來(lái)自測(cè)序平臺(tái)的有效數(shù)據(jù)CleanData后進(jìn)行組裝，得到最佳組裝結(jié)果，然后通過(guò)單堿基糾正、序列環(huán)狀、質(zhì)粒庫(kù)比對(duì)分析，結(jié)果顯示丁酸梭菌基因組DNA總長(zhǎng)度4709 567 bp，其中包含1條環(huán)狀染色體DNA、1條環(huán)狀質(zhì)粒和2條線(xiàn)性質(zhì)粒。環(huán)狀染色體DNA大小3873 131 bp，G+C摩爾百分含量為28.86%，環(huán)狀質(zhì)粒DNA大小769297 bp，G+C含量為28.33%，線(xiàn)性質(zhì)粒1 DNA大小49922 bp，G+C含量為28.26%，線(xiàn)性質(zhì)粒2 DNA大小17217 bp，G+C含量為27.89%?；蚪M中預(yù)測(cè)到4285個(gè)基因、87個(gè)tRNA基因、44個(gè)rRNA基因和3個(gè)sRNA基因。

圖1 丁酸梭菌的基因組完成圖與預(yù)測(cè)基因COG功能分類(lèi)圖Fig. 1 Genome completion map and predicted gene COG functional classification map of Clostridium butyricum

通過(guò)COG對(duì)丁酸梭菌基因進(jìn)行注釋與功能分類(lèi)，共得到2894個(gè)（67.54%）注釋基因，分23個(gè)不同功能組（圖1C），預(yù)測(cè)分組最多的為一般功能基因。丁酸梭菌基因組中注釋基因數(shù)相對(duì)較多的為氨基酸代謝與轉(zhuǎn)運(yùn)、核糖體的生物合成、輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)、脂代謝與轉(zhuǎn)運(yùn)、能量傳遞等。它們包含合成、運(yùn)輸和分解次級(jí)代謝產(chǎn)物的能力，且碳水化合物代謝相關(guān)基因占比最大。

2.2 耐藥性分析

通過(guò)注釋得到有關(guān)耐藥基因的名稱(chēng)及其所耐受不同抗生素的種類(lèi)信息。Antibiotic Resistance Genes Database數(shù)據(jù)庫(kù)包含13293個(gè)基因，共377種類(lèi)型、257種抗生素，124個(gè)門(mén)，3369個(gè)物種。The Comprehensive Antibiotic Resistance Database數(shù)據(jù)庫(kù)包含細(xì)菌耐藥性分子基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，包括基因、蛋白質(zhì)以及突變。通過(guò)將丁酸梭菌基因組序列與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，均未檢測(cè)到耐藥基因存在。丁酸梭菌為益生菌類(lèi)菌株，常運(yùn)用于動(dòng)物飼養(yǎng)以及調(diào)節(jié)人類(lèi)胃腸道功能，但無(wú)已知耐藥基因存在，這為今后在動(dòng)物飼料添加劑的耐藥性安全開(kāi)發(fā)方面有重要的指導(dǎo)價(jià)值。

2.3 毒力基因分析

VFDB數(shù)據(jù)庫(kù)主要對(duì)致病菌、衣原體和支原體致病因子進(jìn)行注釋分析。通過(guò)將丁酸梭菌的基因組序列與VFDB數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果未檢測(cè)到有毒力相關(guān)基因的存在，說(shuō)明該株丁酸梭菌不含已知毒力基因，有助于今后在動(dòng)物用飼料添加劑的毒力安全性評(píng)價(jià)方面提供指導(dǎo)。

2.4 比較基因組學(xué)分析

2.4.1 ANI分析 基于全基因組的相似性指標(biāo)，例如平均核苷酸同一性（average nucleotide identity，ANI），有助于解決有關(guān)遺傳不連續(xù)性或明確物種邊界的問(wèn)題。有文獻(xiàn)分析的80億個(gè)基因組對(duì)中有99.8%符合＞95%的種內(nèi)ANI值和＜83%的種間ANI值。

ANI能夠反映出不同的兩個(gè)基因組之間共享的所有直系同源基因的平均核苷酸同一性，并且能夠分辨出相同或進(jìn)化關(guān)系密切的物種菌株。由于直系同源基因在比較基因組對(duì)之間可能有很大差異，雖然ANI并不嚴(yán)格地衡量核心基因組的進(jìn)化相關(guān)性，但它能夠密切反映在傳統(tǒng)微生物學(xué)概念中用于定義物種的DNA-DNA雜交相關(guān)性，同時(shí)它考慮了細(xì)菌基因庫(kù)的流動(dòng)性或者細(xì)菌之間功能的共享。對(duì)菌株進(jìn)行ANI分析，分析方案結(jié)果如圖2所示，被測(cè)丁酸梭菌株與來(lái)源為健康雞腸道中的丁酸梭菌株種間進(jìn)化關(guān)系最為密切，ANI值為99.995361%，這一結(jié)果為今后丁酸梭菌應(yīng)用于禽類(lèi)飼料添加劑的開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

圖2 ANI熱圖Fig. 2 ANI heat map

2.4.2 物種進(jìn)化 通過(guò)表型或基因型相似性和差異性繪制不同物種或菌株之間的分支圖，同時(shí)可以顯示不同物種之間的進(jìn)化關(guān)系。樹(shù)中的節(jié)點(diǎn)表示其分支最近的共同祖先，節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間線(xiàn)段的長(zhǎng)度對(duì)應(yīng)于進(jìn)化的時(shí)間。使用TreeBeST構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，從圖3中可見(jiàn)，C. butyricum菌株與C. butyricum1菌株種間進(jìn)化關(guān)系較近，這對(duì)后續(xù)禽類(lèi)靶動(dòng)物飼料開(kāi)發(fā)具有重要的指導(dǎo)價(jià)值。

圖3 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 3 System evolution tree

3 討論

目前，國(guó)際上對(duì)益生菌的評(píng)價(jià)暫無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，各國(guó)的安全性評(píng)價(jià)仍處于不斷研究與規(guī)范中。近年來(lái)，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展，基因組測(cè)序技術(shù)已成為微生物鑒定分類(lèi)、追溯和功能預(yù)測(cè)的常用方法，因此，從遺傳水平上評(píng)價(jià)菌株的安全性和危險(xiǎn)因素成為可能。ARDB、CARD耐藥基因數(shù)據(jù)庫(kù)以及VFDB毒力因子數(shù)據(jù)庫(kù)等為菌株從全基因組測(cè)序中篩查耐藥、毒力與致病性等基因提供了重要的數(shù)據(jù)保障。本研究對(duì)丁酸梭菌的全基因組進(jìn)行測(cè)序組裝，通過(guò)與耐藥性數(shù)據(jù)庫(kù)ARDB和CARD進(jìn)行數(shù)據(jù)注釋?zhuān)娴卣莆樟司甑哪退幥闆r，檢測(cè)比對(duì)結(jié)果中未檢出有任何耐藥基因的存在，同時(shí)，通過(guò)測(cè)序結(jié)果與毒力因子數(shù)據(jù)庫(kù)VFDB比對(duì)，未檢測(cè)到相關(guān)毒力因子基因的存在，以目前已經(jīng)收錄的數(shù)據(jù)庫(kù)為基礎(chǔ)，在基因組水平上證實(shí)了該菌株的安全性。對(duì)丁酸梭菌的耐藥性、毒力和致病性方面的安全性研究，為該菌株在畜牧業(yè)中的實(shí)際應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。

隨著畜牧業(yè)減抗、禁抗時(shí)代的來(lái)臨，丁酸梭菌的問(wèn)世填補(bǔ)了我國(guó)“后抗生素時(shí)代”的空白，對(duì)于今后在動(dòng)物醫(yī)學(xué)臨床上治療多種動(dòng)物腸道疾病、增加生產(chǎn)者收益、改善飼養(yǎng)環(huán)境、提高禽畜動(dòng)物的產(chǎn)品安全品質(zhì)，具有極其重要的意義。因此，菌株的安全性評(píng)價(jià)也受到越來(lái)越多的重視，這不僅要求在菌株分子水平上尋求突破口，今后在產(chǎn)品開(kāi)發(fā)及應(yīng)用中，還應(yīng)增加臨床耐藥性及臨床致病性等安全性評(píng)價(jià)內(nèi)容，從而綜合評(píng)價(jià)并指導(dǎo)其應(yīng)用于產(chǎn)品開(kāi)發(fā)。