利用重測序技術(shù)開發(fā)高粱InDel分子標記

蒲偉軍 ， 譚冰蘭 ， 賀丹晨，2 ， 張盼 ， 李玉斌，3 ， 朱莉*

1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081；2.南京師范大學(xué)食品與制藥工程學(xué)院，南京 210023；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東 青島 266109

高粱（Sorghum bicolorL.Moench）為禾本科高粱屬一年生植物，是一種集糧食、飼用、釀酒、糖料、生物質(zhì)能源等多用途的典型C4植物，在強光和高溫條件下具有較高的光合速率，對大多數(shù)類型的非生物脅迫具有出色的耐受性［1］。高粱具有遺傳多樣性豐富、雜種優(yōu)勢強等特點，其基因組較小，單倍體基因組大小約為750 Mb［2］。高粱作為一種新的研究禾谷類作物基因組結(jié)構(gòu)和功能的模式作物，對于通過研究高粱功能基因組學(xué)、分子生物學(xué)來挖掘和揭示高粱重要的功能基因及其分子進化機理具有重要意義［3］。

InDel分子標記是基于插入/缺失位點兩側(cè)的序列設(shè)計特異性引物，通過PCR擴增體現(xiàn)序列長度多態(tài)性的一種分子標記，InDel標記開發(fā)基于序列差異，在開發(fā)過程中變異穩(wěn)定、準確性高，避免了由于特異性和復(fù)雜性導(dǎo)致的后續(xù)分析模糊等問題［4］。近年來，基因組測序技術(shù)的快速發(fā)展使高通量測序技術(shù)為InDel標記的開發(fā)提供了可能［5］。InDel標記作為高通量分子標記，在植物基因組中有較高的分布頻率，具有遺傳穩(wěn)定性高、分布廣、多態(tài)性強、通用性強等優(yōu)點，目前已在水稻、玉米、棉花等主要作物中得到了廣泛應(yīng)用［6-8］。

隨著分子標記技術(shù)的日益成熟和完善，其在高粱上的理論研究和實際應(yīng)用得到了長足的進展。其中高粱分子標記因其優(yōu)點眾多而得到了廣泛的關(guān)注，在過去的十幾年里，關(guān)于高粱分子標記的開發(fā)和應(yīng)用研究不斷有文章報道［9-14］。然而，分子標記技術(shù)在高粱研究中的應(yīng)用遠遠落后于水稻、玉米等作物［7-8，15］。我國在有關(guān)高粱分子標記開發(fā)利用方面的研究相對薄弱，有關(guān)高粱InDel標記的開發(fā)與應(yīng)用目前國內(nèi)相關(guān)報道較少。

本研究利用高通量Illumina測序技術(shù)對甜高粱品種JIUTIAN1基因組進行重測序，通過與測序品種BTx623的參考基因組序列進行同源比對，獲得了豐富的插入/缺失位點。根據(jù)這些InDel位點在兩個基因池間的序列差異（＞10 bp）及在高粱10條染色體上的分布情況，開發(fā)了一套較為精細的高粱InDel分子標記系統(tǒng)，并設(shè)計篩選出共87個分子標記。該套分子標記在高粱重要農(nóng)藝性狀相關(guān)基因的定位中發(fā)揮重要作用，同時在高粱遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析、雜交種純度鑒定和分子標記輔助選擇育種中具有應(yīng)用價值，本研究希望為高粱功能基因精準鑒定、高粱品種選育及分子鑒定和品種權(quán)保護提供有利的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究中所用到的甜高粱重測序品種JIUTIAN1、測序品種BTx623、多態(tài)性測試品種白蛇眼、Wheatland、河北糯雜、麗歐、T32、SEM-E32、SEM-42、ZIH08894、E-Tian，以及YM1、YM2分別與BTx623雜交獲得的17個雜交后代均來自于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所。

1.2 方法

1.2.1 分子標記開發(fā)過程 利用TruSeq DNA PCR-Free LT Library Preparation Kit （Illumina公司）構(gòu)建DNA文庫，利用Illumina HiSeq XTMTen測序平臺對甜高粱品種JIUTIAN1進行重測序；利用Trimmomatic軟件［16］對序列進行質(zhì)控，利用BWA（Burrows-Wheeler Aligner）［17］比對軟件將有效數(shù)據(jù)與高粱測序品種BTx623參考基因組序列進行比對。通過大規(guī)模同源序列比對篩選目標區(qū)域中序列差異≥10 bp的InDel位點，利用Primer Premier 5.0軟件［18］設(shè)計InDel標記引物。

1.2.2 植物基因組DNA提取 在三葉期提取相應(yīng)供試驗材料基因組DNA進行分子標記篩選，高粱基因組DNA提取均使用改良植物CTAB提取法［19］。利用紫外/可見光光度計進行DNA純度分析和定量檢測。取適量溶解之后的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳（0.8%濃度），以檢測基因組DNA的提取質(zhì)量。

1.2.3 InDel引物的設(shè)計與合成 本研究所用到的所有引物均利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計。引物設(shè)計的基本要求為：退火溫度（Tm）在50～62 ℃之間，以56 ℃為最佳；GC含量在40%～60%之間，以50%為最佳；引物長度在18～25 bp，以20 bp為最佳。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物見表1。

表 1 分布于 10 條染色體上的 87 對 InDel 引物信息Table 1 Information of 87 pairs of InDel primers distributed on 10 chromosomes

續(xù)表

續(xù)表

續(xù)表

續(xù)表

1.2.4 InDel引物的PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳檢測 合成的InDel引物先通過2個基因池間（高粱JIUTIAN1和BTx623）的PCR擴增進行多態(tài)性篩選。PCR擴增反應(yīng)體系（20 μL）為：1.0 μL基因組DNA（200 ng·μL-1），17 μL 1 × Golden Star T6 Super PCR Mix（購自北京擎科生物科技有限公司），1.0 μL正向引物（10 μmol·L-1），1.0 μL反向引物（10 μmol·L-1）。PCR擴增程序為：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，Tm退火（50～62 ℃）10 s，72 ℃延伸10 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。在杭州博日科技有限公司（BIOER）LifeECO基因擴增儀（TC-96/G/H（b）C）上進行PCR擴增。

配制4%瓊脂糖凝膠，待膠冷卻凝結(jié)后，在電泳槽內(nèi)倒入1×TAE電泳緩沖液。取5 μL PCR擴增產(chǎn)物加入1 μL 6×DNA Loading Buffer，混勻后用移液器加樣。使用電泳儀（DYY-6C型，北京六一生物科技有限公司）連接電極在60 V恒壓條件進行電泳，電泳時間為1.0～1.5 h，以擴增的DNA條帶充分展開為止。

1.2.5 引物多態(tài)性篩選與數(shù)據(jù)采集分析 提取高粱幼苗組織的總DNA，利用InDel引物進行PCR擴增。不同長度的PCR擴增片段通過瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)核酸染料標記檢測區(qū)分開來。不同高粱品種由于遺傳組成不同，在基因組DNA 的多個InDel位點中，一些位點的缺失或插入序列有差異，這種差異可通過瓊脂糖凝膠電泳區(qū)分，從而對不同品種進行區(qū)分鑒定。將待測樣品擴增片段的帶型和遷移位置與對應(yīng)的參照品種進行比較，與待測樣品相同的參照品種的片段大小即為待測樣品該引物位點的等位變異大小。

根據(jù)PCR擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果，對父、母本及雜交子代進行帶型對比分析，若雜交子代擴增出條帶大小與父母本完全一致/表現(xiàn)父母本條帶的完全互補型（雙帶）即為真雜交種，而擴增只呈現(xiàn)出類似父本或母本的單一條帶或其他片段大小的后代均為假雜交種。

1.2.6 利用Mapchat軟件繪制高粱的物理圖譜 MapChart［20］是用于Windows平臺的計算機程序包，可生成包含QTL信息的遺傳連鎖圖譜。下載安裝MapChart軟件后，按軟件格式要求整理In-Del分子標記名稱及其在染色體上的遺傳位置信息，每條染色體需要有對應(yīng)的名稱，然后將整理好的數(shù)據(jù)信息直接導(dǎo)入JoinMap生成的map文件即可生成物理圖譜。參數(shù)設(shè)置可通過Locus name and text按鈕設(shè)置字體和大小，Locus name position按鈕設(shè)置Locus名稱位置。

2 結(jié)果與分析

2.1 重測序材料多態(tài)性InDel標記篩選

利用高通量Illumina測序技術(shù)對甜高粱品種JIUTIAN1基因組進行重測序，測序深度為50 x，測序結(jié)果共獲得271633 523個Reads（讀長），其中映射讀取（Mapped Reads）數(shù)為266832 495個，Reads與基因組比對率高達98.23%。通過與測序品種BTx623參考基因組序列進行同源比對，獲得了豐富的插入/缺失位點，在重測序品種基因組中共檢測到Insertion位點152256個、Deletion位點139773個，合計292029個變異位點。通過大規(guī)模同源序列比對篩選2個基因組中目標區(qū)域中序列差異≥10bp的InDel位點，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計InDel標記引物，共設(shè)計了205對均勻分布在高粱10條染色體上的InDel引物。通過對這205對InDel引物PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測，對InDel引物在甜高粱品種JIUTIAN1和測序品種BTx623基因池中的多態(tài)性進行篩選，最終篩選出87對引物擴增效果良好并表現(xiàn)出多態(tài)性的InDel標記，多態(tài)性為42.44%。如圖1所示，這些標記在JIUTIAN1和BTx6232個材料之間分離條帶清晰，具有較好的區(qū)分度。

2.2 InDel分子標記在高粱遺傳連鎖圖譜構(gòu)建中的應(yīng)用

InDel標記作為一種重要的遺傳標記，已經(jīng)廣泛用于作物連鎖圖譜的構(gòu)建。本研究利用Mapchat軟件繪制這87個InDel分子標記在高粱染色體上的物理圖譜（圖2），結(jié)果表明，這87個分子標記分布在高粱10條染色體上，其中在第2、4、5、8、9這5條染色體上分布的分子標記較多，在每條染色體上下游區(qū)域分布的InDel標記居多，表明在染色體這些區(qū)域的序列多樣性更為豐富。該圖譜的構(gòu)建可為基因的準確定位和克隆與分子標記輔助育種的應(yīng)用提供詳細的信息。

圖2 基于開發(fā)的87個InDel分子標記所構(gòu)建的高粱物理圖譜Fig. 2 Physical map of sorghum based on 87 developed InDel molecular markers

2.3 InDel分子標記在高粱種質(zhì)資源遺傳多樣性研究中的應(yīng)用

多態(tài)性InDel引物可以在高粱種質(zhì)資源遺傳多樣性研究中發(fā)揮作用。本研究從開發(fā)的87個InDel標記中隨機選取2對多態(tài)性引物（InDel 20、InDel 38），結(jié)合高粱幼苗基因組DNA快速提取方法，對白蛇眼、Wheatland、河北糯雜等11份高粱品種進行鑒別，PCR擴增結(jié)果顯示，不同品種在不同引物的檢測下PCR產(chǎn)物大小在250 bp位置表現(xiàn)出明顯區(qū)別，在一定程度上呈現(xiàn)出品種特異性（圖3）。若選擇多個可鑒定特定高粱材料的特異性InDel引物并將其結(jié)合，可為高粱種質(zhì)資源鑒定工作提供有效工具。結(jié)果表明，InDel技術(shù)作為一種快速、準確、高效方法，可用于大規(guī)模DNA指紋分析，在高粱種質(zhì)資源鑒別中發(fā)揮重要的作用。

圖3 利用高粱InDel分子標記進行高粱品種遺傳多樣性分析的電泳圖譜Fig. 3 Electrophoretic map of genetic diversity analysis of sorghum varieties using InDel markers

2.4 高粱InDel分子標記在高粱雜交種/純度鑒定中的應(yīng)用

利用開發(fā)的InDel分子標記，可在高粱雜交種/純度鑒定中發(fā)揮作用。在實驗中隨機選取3個經(jīng)PCR驗證具有多態(tài)性的InDel標記（InDel02、InDel24、InDel42），結(jié)合高粱苗期葉片基因組DNA快速提取方法，對配制2個高粱品種雜交群體的17個雜交后代進行了雜交種真實度和純度評價。根據(jù) PCR擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果，如圖4A中，使用InDel 02引物進行鑒定，可以明顯觀察到4、5是真雜交種，而3、6、7則是假雜交種。圖4B中，使用InDel 24引物進行鑒定，可以明顯觀察到13是真雜交種，10、11、12是假雜交種。同樣，使用InDel 24引物對YM1與BTx623雜交子代16～19進行了鑒定，其中18、19是真雜交種，16、17是假雜交種（圖4C）。使用InDel 42引物對YM2與BTx623雜交子代22～25進行了鑒定，其中23、24是真雜交種，22、25是假雜交種（圖4D）。以上試驗結(jié)果表明，本研究開發(fā)的InDel標記可被用于快速、準確和經(jīng)濟地早期鑒定高粱雜交種的真實性及純度。

圖4 利用InDel標記進行高粱雜交種鑒定的電泳圖譜Fig. 4 Electrophoretic map of sorghum hybrid identification using InDel markers

3 討論

高粱的基因組較?。?50 Mb），普遍被認為是研究二倍體的模式化植物，同時也被作為能源植物如多倍體甘蔗和高生物量植物芒草類的參考植物。高粱在糧食安全、人類健康和生物能源的開發(fā)上具有非常重要的作用。開發(fā)高粱多態(tài)性分子標記對促進分子遺傳學(xué)發(fā)展及高粱分子標記輔助育種意義重大［10］。高粱品種BTx623于2009年已完成基因組測序，為高粱的基因組分析、遺傳研究及基因的發(fā)掘利用等奠定了基礎(chǔ)。研究者利用BTx623測序基因組序列開發(fā)了5599個非冗余簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）標記［9］。由于來源于美國的BTx623品種基因組遺傳范圍狹窄，與目前國內(nèi)高粱育種研究人員者使用的親本材料遺傳背景差異較大，導(dǎo)致SSR標記的開發(fā)在基因組一些區(qū)域的多態(tài)性標記開發(fā)效率低下，極大限制了高粱SSR分子標記的應(yīng)用［10］。高粱多態(tài)性分子標記的開發(fā)是圖譜建立、數(shù)量性狀和質(zhì)量性狀研究的基礎(chǔ)，也是分子輔助育種和基因克隆的關(guān)鍵［21-22］。由于高粱公共數(shù)據(jù)庫中釋放的標記數(shù)據(jù)相對較少，目前關(guān)于高粱InDel標記開發(fā)的研究非常有限。因此高粱基因組InDel標記的開發(fā)將對開展高粱種質(zhì)資源遺傳多樣性研究、高粱重要基因定位、克隆及分子育種等工作具有重要的理論與應(yīng)用價值。

InDel在植物基因組中分布廣泛、密度大、數(shù)目眾多。InDel作為高通量分子標記，兼具各類遺傳標記的優(yōu)點。傳統(tǒng)分子標記開發(fā)一般只基于一份序列，而InDel多態(tài)性分子標記開發(fā)完全基于插入/缺失位點兩側(cè)的序列差異設(shè)計特異引物進行PCR擴增的標記，可利用便捷的電泳平臺進行分型。與SSR標記相比，InDel標記多態(tài)性豐富、準確性高、穩(wěn)定性好，PCR擴增非特異性條帶少，避免了由于特異性和復(fù)雜性導(dǎo)致的后續(xù)分析模糊等問題。此外，InDel標記對DNA的質(zhì)量要求不高，樣品量要求也比較小，能擴增混合DNA樣品和高度降解微量DNA樣品，InDel標記的擴增產(chǎn)物帶型清晰，易于記錄，并可進行有效分型。InDel標記法優(yōu)勢在于：①與目標基因功能關(guān)聯(lián)，更利于分子輔助篩選和鑒定；②可篩選片段差異大于50 bp，便于分離和精準鑒定；③分離方式可使用最常見的瓊脂糖凝膠電泳，簡捷、方便，分析周期短，運行成本低。當然InDel標記也有其客觀局限性，比如對于未知基因組信息的物種來說，InDel標記的開發(fā)只能根據(jù)已知基因的序列開發(fā)，與SNP標記相比，InDel數(shù)量有限且覆蓋面窄。

目前，InDel標記已經(jīng)在包括水稻、番茄、棉花、豇豆等作物中得到廣泛研究和應(yīng)用［6，23-25］。隨著高粱功能基因組學(xué)研究的不斷深入，高粱InDel標記的開發(fā)與應(yīng)用也取得了一定的進展，如高粱屬種質(zhì)泛基因組分析顯示，高粱屬種間（擬高粱、蘇丹草和甜高粱）基因結(jié)構(gòu)變異已超過64%，大量重要農(nóng)藝性狀變異與主效基因的InDel特征關(guān)聯(lián)［26］。Li等［27］在高粱和蘇丹草2個基因組之間鑒定出16928個InDel位點，共設(shè)計5344個InDel標記，選取15個InDel標記構(gòu)建了Tx623A與Sa雜交的遺傳圖譜。結(jié)果表明，這些InDel標記在高粱和蘇丹草之間具有廣泛的用途和通用性。除了基因組測序外，Choe等［15］開發(fā)了基于葉綠體基因組序列變異的InDel標記來準確鑒定物種的細胞質(zhì)。最新研究報道，可利用基于貝葉斯回歸法的基因組-表型全關(guān)聯(lián)研究高粱中InDel標記的功能基因組效應(yīng)［28］。相比水稻、棉花等作物，高粱InDel標記的開發(fā)和應(yīng)用研究還非常有限，在國內(nèi)相關(guān)報道較少。

本研究利用高通量Illumina測序技術(shù)對甜高粱品種JIUTIAN1基因組進行重測序，通過與測序品種BTx623參考基因組序列進行同源比對，獲得了豐富的插入/缺失位點。根據(jù)這些InDel位點在2個基因池間的序列差異（＞10 bp）及在高粱10條染色體上的分布情況，分別設(shè)計分子標記（約205對引物），經(jīng)PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳檢測，篩選到87個多態(tài)性高、分辨率高的InDel分子標記，這些標記分布在高粱10條染色體上，多態(tài)性達42.44%。本研究開發(fā)的分子標記可采用4%瓊脂糖凝膠電泳平臺進行檢測，擴增條帶清晰，多態(tài)性高、分辨率高，且簡便易行、可操作性強、經(jīng)濟實用。進一步的分析驗證該套分子標記可在高粱遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建、遺傳多樣性分析、高粱雜交種純度鑒定等方面具有較好的應(yīng)用效果，同時可為高粱重要功能基因的定位和分子標記輔助選擇育種等提供可靠的參考數(shù)據(jù)。

本研究開發(fā)的分子標記在高粱屬種質(zhì)資源的實際多態(tài)性還需要進一步探究，目前還缺少片段＞50 bp的高分辨率InDel分子標記。隨著位于功能基因上InDel標記的不斷開發(fā)，結(jié)合圖位克隆法、基因精細定位，可將這些標記應(yīng)用于高粱重要農(nóng)藝性狀的功能基因的篩選，有利于目標性狀優(yōu)良基因的進一步開發(fā)和利用。