不同亞型CHO宿主細胞對抗體表達的影響

曹輝 ， 董靜 ， 賈宇 ， 江一帆

華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責任公司，抗體藥物河北省工程研究中心，抗體藥物研究國家重點實驗室，石家莊 050015

生物藥物在國際醫(yī)藥市場中占據(jù)主導地位，截至2023年，全球范圍內(nèi)已有100多個抗體藥物被批準上市，近1200個抗體藥物處于不同臨床試驗階段［1］。2021年全球暢銷藥品Top10中，生物藥品占了7個，其中單克隆抗體藥物4個，這些單抗藥物均由重組中國倉鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）細胞表達［2］。

CHO細胞在單抗工業(yè)生產(chǎn)中具有明顯的優(yōu)勢，如表達產(chǎn)品具有和人類抗體類似的翻譯后修飾；重組蛋白可胞外表達，便于目的蛋白分離純化；CHO細胞由于非人源，可以減少人類病毒交叉污染的風險；同時CHO細胞具有較長的培養(yǎng)周期，可以進行無血清、高密度、懸浮大規(guī)模培養(yǎng)，從而獲得高純度目的蛋白［3-4］。隨著CHO細胞的廣泛應用，圍繞CHO細胞開發(fā)的培養(yǎng)基、培養(yǎng)用設備、耗材種類日益豐富［5-7］，越來越多的開發(fā)項目也使得CHO細胞表達產(chǎn)品質(zhì)量研究相對透徹，CHO細胞也成為目前市場上超過84%蛋白藥物的首選宿主細胞［7］。

1957年，Puck通過中國倉鼠卵巢組織分離獲得CHO細胞，1970年野生型CHO-K1保存于ATCC，1985年分離得到的CHO-K1亞克隆保存于ECACC［8-9］。此后多家藥企使用懸浮培養(yǎng)基將野生型CHO-K1細胞懸浮馴化并作為宿主細胞使用，比如Merck、Lonza等公司。1973年Thompson從原始細胞中分離了1株可用于懸浮培養(yǎng)的CHO細胞，1980年Gibco公司將此細胞馴化至CD CHO培養(yǎng)基中，建立了CHO-S細胞和GMP細胞庫。1983年，Urlaub等［9-10］通過突變一個基因，篩選出雙等位DHFR基因敲除的CHO宿主細胞，并命名為CHO-DG44。圖1展示了CHO細胞譜系。然而，由于培養(yǎng)條件、篩選方式等不同，不同CHO細胞在基因組、新陳代謝乃至細胞形態(tài)、生長方式、蛋白表達等方面具有較大的差異。

圖1 CHO細胞譜系圖Fig. 1 CHO cell lineage

1 CHO細胞不同亞型染色體差異

研究表明，ATCC保存的野生型CHO-K1細胞和中國倉鼠基因組相比，已經(jīng)產(chǎn)生了25711個染色體結(jié)構多樣性，包含13735個插入和11976個缺失［11］。在隨后的細胞系建立及培養(yǎng)過程中，突變?nèi)匀辉诓粩喈a(chǎn)生。CHO細胞可能的突變貫穿于長期傳代過程中的每次細胞分裂，包括插入、缺失、點突變等序列變異以及染色體結(jié)構變異，足夠量突變的積累可能產(chǎn)生染色體結(jié)構變異，導致染色體不平衡重排，致使CHO細胞染色體重排成為一種常見現(xiàn)象［12-13］。由于整個染色體的丟失或獲得，這些染色體結(jié)構的變異還會被非整倍體補充，進而表現(xiàn)為染色體非整倍性和結(jié)構改變，因此成為永生細胞的特征性標志［14-15］。

由于上述原因，CHO細胞沒有明確的染色體數(shù)目［16］。大量文獻顯示，CHO-S細胞具有和原始中國倉鼠細胞相似的染色體數(shù)目（22條），長期傳代時染色體數(shù)目沒有變化；CHO-DG44有20條染色體（19～21條染色體）；CHO-K1細胞在傳代過程中染色體數(shù)目明顯減少（18～20條染色體），CHOK1在有谷氨酰胺培養(yǎng)基長期傳代情況下，染色體數(shù)目下降到19條，而在無谷氨酰胺的培養(yǎng)基中長期傳代，染色體數(shù)下降到18條［17-20］。但隨著培養(yǎng)時間的推移，細胞株染色體數(shù)目沒有再發(fā)生明顯變化。因此，雖然每個細胞株都有其特征性的染色體數(shù)，但細胞群體內(nèi)染色體數(shù)的變化是隨機發(fā)生且不可預測的，發(fā)生機制還未徹底揭示［21］。其原因可能是，細胞在體外人工高氧、富營養(yǎng)的培養(yǎng)條件下，快速分裂、增殖，積累大量突變造成染色體變異。另外，CHO細胞有較多的端粒序列重復，序列相似性增加了染色體易位發(fā)生的可能性。隨著培養(yǎng)時間的增加，這些變異會隨機積累，從而產(chǎn)生較大的染色體突變［22-25］。

CHO細胞在染色體突變過程中，有些染色體相對保守，圍繞這些相對保守染色體的研究對于細胞轉(zhuǎn)染及獲得穩(wěn)定克隆具有重要意義［26］。不同的培養(yǎng)基和傳代過程會導致觀察到的未變異染色體不完全相同。CHO-DG44細胞所有染色體中有5條或者7條是正常染色體，包括Chr1的2個拷貝，以及Chr2、Chr4、Chr5、Chr8和Chr9的1個拷貝，且Chr4存在染色體缺失或延長情況。在CHO-K1細胞的所有染色體中，有8條左右是正常的，包括Chr1和Chr5的2個拷貝，Chr2、Chr3、Chr8和Chr9的1個拷貝，其他染色體均發(fā)生重排。綜上所述，CHO-K1和CHO DG44相對保守的染色體，包括Chr1、Chr2、Chr8和Chr9［26-27］。這些保守的染色體可以作為定點整合或隨機整合的理想靶點［28-30］。

2 CHO細胞不同亞型生長狀態(tài)和表達差異性

CHO細胞常見的幾種亞型中，CHO-S被公認為是比生長速度（specific growth rate）最高的細胞，具有最短的倍增時間［31］。有研究發(fā)現(xiàn)，CHOK1、CHO-DG44和CHO-S 3種宿主細胞的倍增時間分別為24±2、27±2和18±2 h［32］。本團隊培養(yǎng)的宿主細胞CHO-K1、CHO-DG44（使用CD CHO培養(yǎng)基）倍增時間分別為19.49±0.38和17.80±0.97 h，與Xu等［31］報道的培養(yǎng)倍增時間不同，這可能是相同亞型宿主細胞在不同實驗室長期傳代積累發(fā)生突變造成的差異，也可能是培養(yǎng)條件引起的。

有研究發(fā)現(xiàn)，CHO-S細胞中糖酵解及三羧酸循環(huán)中重要的酶類蛋白、與細胞生長相關蛋白（如肌球蛋白）和細胞周期依賴性激酶表達水平較高。其中，肌球蛋白可能和細胞分裂、細胞運動、細胞形態(tài)維持等有關，細胞周期依賴性激酶與細胞周期、轉(zhuǎn)錄、mRNA加工有關，同時CHO-S細胞具有最高的葡萄糖消耗速率，以上結(jié)果可能是CHO-S細胞生長速度快的原因［32-33］。而CHO-DG44細胞中與細胞生長相關蛋白表達水平及葡萄糖消耗速率相對較低可能導致了CHO-DG44的生長速度最慢。在長期培養(yǎng)過程中，持續(xù)的培養(yǎng)一般會使細胞生長速率增加，但是細胞生長速率增加現(xiàn)象是隨機出現(xiàn)的，說明染色體突變是隨機的。

轉(zhuǎn)入目的基因后，比生長速率最快的依然是CHO-S細胞。CHO-K1、CHO-DG44和CHO-S 3種宿主細胞轉(zhuǎn)染攜帶相同目的基因的相同質(zhì)粒，單克隆通過不同的方式培養(yǎng)，無論是批式培養(yǎng)（batch culture）、批式補料培養(yǎng)（fed-batch culture），還是灌注培養(yǎng)（perfusion cultuer），CHO-S細胞都有最快的比生長速率，并能最快到達最高密度。而所有培養(yǎng)方式中，CHO-K1細胞比生長速率最慢；在最高密度方面，批式培養(yǎng)獲得的CHO-S細胞和CHO-DG44細胞比CHO-K1細胞有更高的密度；批式補料培養(yǎng)和灌注培養(yǎng)中，CHO-DG44細胞密度最高，CHO-K1最高密度相對最低［10，34］?；蚪M學研究表明，CHO細胞為了適應無血清條件下的高密度生長，其促細胞凋亡基因的表達比中國倉鼠細胞明顯下降，抗凋亡基因表達明顯上升［11］。除基因表達水平外，凋亡相關基因拷貝數(shù)的改變也可以影響細胞生長，CHO細胞亦不例外［11，35］。

CHO-K1、CHO-DG44和CHO-S 3種宿主細胞在抗體表達和密度方面的表現(xiàn)是相反的，與宿主細胞相比，不同培養(yǎng)基對于抗體比生長速率的影響較小。在批式補料培養(yǎng)中，抗體比生產(chǎn)率由高到低依次是：CHO-K1細胞、CHO-DG44細胞、CHO-S細胞，其中CHO-K1細胞的抗體比生產(chǎn)速率是DG44細胞的2～3倍，是CHO-S細胞的6～8倍，且補料并沒有給CHO-S細胞帶來很大的表達提升［34］。因此，CHO-K1細胞作為工程細胞表達抗體，具有低密度、高表達的特點。

研究表明，CHO-DG44細胞在轉(zhuǎn)錄速率方面可能存在瓶頸，其與轉(zhuǎn)錄及糖酵解過程相關的蛋白表達水平均次于CHO-K1。蛋白質(zhì)組學研究發(fā)現(xiàn)，CHO-K1細胞中與轉(zhuǎn)錄相關的幾種蛋白表達水平較高，如核糖核苷二磷酸還原酶、核仁素蛋白、核仁素相關蛋白NRP等［32］。同時，CHO-K1細胞有更大的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，更豐富的線粒體基因組變異和異質(zhì)性以及與之對應的高細胞特異性抗體表達量［36］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對于分泌蛋白的折疊組裝非常關鍵，如果內(nèi)質(zhì)網(wǎng)里不可逆地錯誤折疊蛋白超過一定限度，細胞將啟動未折疊蛋白響應機制，最終發(fā)生細胞凋亡。因此，大內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有利于分泌蛋白的高產(chǎn)率，也有利于高產(chǎn)細胞的存活和蛋白加工。豐富的線粒體基質(zhì)有利于細胞自我供能，便于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工處理未折疊的蛋白［37-39］。由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體占據(jù)了細胞內(nèi)大量的空間，因此抗體表達量也反映在細胞體積上。研究發(fā)現(xiàn)，灌流培養(yǎng)時高產(chǎn)的CHO-K1細胞直徑15.7±0.7 μm，CHO-DG44細胞直徑14.2±0.5 μm，CHO-S細胞直徑13.7±1.1 μm［34，40］。

熱穩(wěn)定性的增加可提高抗體表達水平，而熱穩(wěn)定性與宿主細胞有關［41-42］。研究表明，CHODG44和CHO-K1表達抗體熱穩(wěn)定性接近，均明顯高于CHO-S表達抗體熱穩(wěn)定性［34］。然而，熱穩(wěn)定性差異影響蛋白質(zhì)表達的機制尚未明確，IgG1鏈間二硫鍵附近LC端絲氨酸的有無可能是影響抗體穩(wěn)定性的原因之一［43］。

3 CHO細胞不同亞型的糖型差異

抗體糖基化位點的組成主要是G0F、G1F、G2F，偶爾會有1個或2個唾液酸殘基，甘露糖基化、巖藻糖基化和無糖基化，這些受培養(yǎng)基影響較小，主要受細胞株影響［44］。CHO-DG44細胞表達單克隆抗體，相對于CHO-K1細胞和CHO-S細胞表達的抗體甘露糖基化程度高（CHO-S：2%～3%；CHO-K1：5%～9%；CHO-DG44：11%～13%）；抗體產(chǎn)物巖藻糖基化在CHO-S細胞中最高（94%～96%），其次是CHO-K1細胞（82%～84%）和CHODG44細胞（71%～83%）；抗體無糖基化修飾在CHO-K1細胞（2%～5%）和CHO-S細胞（1%）中含量較低，且在CHO-DG44培養(yǎng)物中未檢測到［34-45］。

半乳糖基化很大程度上受培養(yǎng)基影響，比如培養(yǎng)基里的尿苷、氯化錳和半乳糖等成分，但同時細胞株對其也有一定程度影響［46-47］。CHO-K1細胞相對于CHO-DG44細胞和CHO-S細胞可以達到較高的抗體半乳糖基化水平，而CHO-S細胞半乳糖基化水平最低。唾液酸化水平較高的是CHOK1細胞（21%～36%），其次是CHO-DG44（15%～19%）和CHO-S細胞（6%～15%），原因可能是唾液酸形成相關酶類在CHO-K1中表達水平較高，如ST3GAL1、ST3GAL 2、ST3GAL 5、ST3GAL 6等［34，48］。

不同宿主細胞存在糖基化之間的差異［49］。CHO-K1細胞雖然僅有3個糖型相關酶且與人類沒有同源性，糖型修飾與人類仍具有一定的差別，如CHO基因組中N-乙酰葡萄糖胺相關酶類基因不會全部表達，因此CHO細胞不會生產(chǎn)含有二等分N-乙酰葡萄糖胺殘基的糖型蛋白；另一方面，CHO細胞基因組相對簡單，因此容易進行基因修飾，如僅通過敲除巖藻糖轉(zhuǎn)移酶8（fucosyltransferase 8，F(xiàn)UT8）基因即可去除蛋白的N-糖巖藻糖修飾，從而增加抗體ADCC效應，原因在于CHO-K1細胞巖藻糖轉(zhuǎn)移酶中僅有該基因表達［11，50-52］。CHODG44和CHO-S細胞來源于CHO-K1，在此基礎上，糖型結(jié)構又發(fā)生了一些變化。

有研究發(fā)現(xiàn)，中國倉鼠有256種酶，CHO-K1細胞、CHO-DG44細胞和CHO-S細胞分別至少突變13%、2%、25%，雖然不是所有的突變都影響酶活或者存在底物偏好，但在漫長的糖型演化過程中，這些突變增加了最終糖型變化的可能性［11，34］。這就是不同的CHO表達系統(tǒng)會產(chǎn)生不同糖型的原因。

4 展望

在構建不同CHO細胞系的過程中，基因乃至染色體已經(jīng)發(fā)生了明顯變化，這些改變進一步影響了不同細胞系的代謝和生長方式。CHO-S細胞染色體數(shù)目和原始中國倉鼠細胞相似，但是CHOS細胞中糖酵解和三羧酸循環(huán)中重要酶類的高水平表達表現(xiàn)為CHO-S產(chǎn)生最高的葡萄糖消耗速率，從而使得CHO-S細胞表現(xiàn)出較快的生長速率；Dhfr基因的敲除可能導致該細胞系細胞周期相關蛋白表達量下降，從而導致CHO-DG44生長較慢；CHO-K1數(shù)目可能較少，但含有豐富的能量代謝關鍵物質(zhì)，因此生長較快［27，31，48］。

除細胞系的建立過程外，長期傳代和培養(yǎng)過程中，CHO細胞也會持續(xù)積累變異，甚至造成染色體結(jié)構變異，并且這些變異具有隨機性，是不可預測和不可控的［12］。內(nèi)在遺傳不穩(wěn)定性是CHO的蛋白表達可能出現(xiàn)不穩(wěn)定性的因素之一，持續(xù)變異是否影響產(chǎn)品質(zhì)量，需持續(xù)關注并展開相關研究。除保證細胞系的單克隆源性及穩(wěn)健的控制策略外，CHO細胞中存在的相對保守的DNA序列使得目的基因定點整合到保守基因序列成為一個較好的選擇［12，53-55］。但是目前大部分項目都是使用相對成熟的隨機整合方式，整合位點所在區(qū)域如果不是保守區(qū)域，則需要評估基因突變以及染色體變異與重組蛋白表達的穩(wěn)定性之間有無直接的相關性。無論定點整合還是隨機整合，均需進行細胞株穩(wěn)定性實驗以證明重組細胞不同代次表達產(chǎn)品質(zhì)量的一致性。

除不同培養(yǎng)基和培養(yǎng)方式外，細胞系本身也可以影響抗體表達量及質(zhì)量。CHO-K1細胞有利于抗體表達，CHO-S有利于細胞量積累，而CHODG44表達能力和細胞生長表現(xiàn)居中［34］。高培養(yǎng)密度會帶來高耗氧，高消耗營養(yǎng)物質(zhì)，從而給培養(yǎng)過程帶來壓力，因此從便于培養(yǎng)和提高目的產(chǎn)物積累效率角度來看，CHO-K1細胞的表現(xiàn)最優(yōu)秀，具有高抗體比生產(chǎn)率、高表達和低細胞密度的特點［34，56-57］。同時，CHO-K1的低密度特點給工藝和培養(yǎng)基開發(fā)留出了更大的可操作空間，比如在CHO-K1細胞低密度基礎上進行培養(yǎng)基和培養(yǎng)工藝開發(fā)，以便于帶來更大的抗體收獲量。

不同宿主細胞由于遺傳背景不同會影響抗體產(chǎn)量和質(zhì)量，因此宿主細胞選型需要結(jié)合目的蛋白預期的質(zhì)量屬性。糖型也可能影響生物藥物的藥效，因此需要將生物藥的安全性、有效性和糖型結(jié)果關聯(lián)，進而指導宿主細胞選擇［58］。糖型本身也可能影響抗體電荷異質(zhì)性，CHO細胞系建立過程中產(chǎn)生了大量基因變異，這些變異可能影響目的蛋白翻譯后修飾，因此宿主細胞可能通過多種方式對抗體電荷異質(zhì)性產(chǎn)生影響，但具體機制仍需要進一步研究［59］。