甲基化酶DNMT3B、叉頭框蛋白C1與宮頸癌超聲特征的相關(guān)性分析

陳 然,肖 彬,管 鑫,喬金瑩

(湖北省十堰市人民醫(yī)院,湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院超聲科,湖北 十堰 442000)

宮頸癌是低收入和中低收入國(guó)家婦女中最常見的癌癥之一[1]。2020年超過50%的宮頸癌發(fā)生在生活在低收入和中等收入國(guó)家,對(duì)婦女健康造成嚴(yán)重?fù)p害[2-3]。盡管細(xì)胞學(xué)篩查無(wú)疑使宮頸癌負(fù)擔(dān)大幅下降,但因其檢測(cè)成本較高,導(dǎo)致該技術(shù)在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)中的應(yīng)用受限,近幾年經(jīng)陰道和直腸超聲成為臨床評(píng)估子宮頸癌局部擴(kuò)散的可行方案,對(duì)后續(xù)的精準(zhǔn)治療至關(guān)重要[4]。近年來(lái),通過基因組和蛋白質(zhì)組學(xué)手段開發(fā)的分子標(biāo)志物為疾病診斷和治療帶來(lái)了新的維度,DNA 甲基化已成為臨床重點(diǎn)的表觀遺傳學(xué)研究方向, DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyl transferase,DNMTs)是DNA 甲基化修飾的關(guān)鍵酶,DNA 甲基化修飾可以抑制惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中抑癌基因、促凋亡分子表達(dá),同時(shí)可以促進(jìn)癌細(xì)胞增殖,DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3B(DNA methyltransferase 3 beta,DNMT3B)可以催化DNA 從頭甲基化過程,進(jìn)而調(diào)控DNA 轉(zhuǎn)錄過程[5-6]。另外叉頭框蛋白C1(forkhead box protein C1,FOXC1)是叉頭框轉(zhuǎn)錄因子家族的成員,基因位于6p25染色體上,具有獨(dú)特的DNA結(jié)合叉頭結(jié)構(gòu)域,FOXC1異常表達(dá)與細(xì)胞有絲分裂過程有關(guān),進(jìn)而對(duì)癌細(xì)胞增殖過程產(chǎn)生影響,敲除FOXC 1基因能通抑制癌細(xì)胞的體外增殖、遷移和侵襲[7]。DNMT3B、FOXC1在多種惡性腫瘤疾病中異常表達(dá),但對(duì)宮頸癌的診斷價(jià)值鮮有報(bào)道。因此本次研究通過分析DNMT3B、FOXC1與宮頸癌超聲特征的相關(guān)性,以期為臨床提供更多的證據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2013年5月—2016年4月于我院經(jīng)病理診斷為宮頸癌的患者117例(研究組)與同期健康體檢女性50例(對(duì)照組)為對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn):未接受任何特殊治療,包括子宮切除術(shù)、放療或化療;擁有完整病歷資料,排除標(biāo)準(zhǔn):擁有其他惡性腫瘤史或放化療史;先天性子宮畸形患者;凝血病患者;嚴(yán)重心、肝、腎功能障礙患者。 比較兩組基線資料發(fā)現(xiàn),2組受試者年齡、更年期比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t/χ2值=1.787、0.627,P>0.05),具有可比性。

所有患者均已簽署知情同意書。本研究已通過醫(yī)院倫理委員會(huì)審核準(zhǔn)許。

1.2彩色多普勒超聲 選擇配備DC5-8D超聲探頭的飛利浦彩色多普勒超聲系統(tǒng)進(jìn)行超聲檢測(cè)。檢測(cè)前排空直腸和膀胱。檢查時(shí)首先通過陰道超聲檢查子宮及雙側(cè)附屬區(qū)域,確定宮頸病變區(qū)域的位置、數(shù)量、大小、形狀、邊界、回聲及與周圍組織的關(guān)系。其次,選擇了彩色多普勒血流成像模式,觀察宮頸區(qū)內(nèi)部及周圍的血流情況,計(jì)算并采集相關(guān)參數(shù)如血流、腫瘤大小等。

1.3Adler分級(jí) 根據(jù)檢測(cè)到的血流進(jìn)行Adler分級(jí)[8],0級(jí):宮頸形態(tài)正常,無(wú)明顯血流信號(hào)。Ⅰ級(jí):1或2條直徑為<1 mm的小血管,宮頸形態(tài)稍增厚。Ⅱ級(jí):不均勻或增厚的宮頸回聲分布,可檢測(cè)到3～4條小血管。Ⅲ級(jí):子宮旁和子宮外浸潤(rùn)和血轉(zhuǎn)移,并檢測(cè)到4條以上的血管,或者是交織成網(wǎng)絡(luò)的血管。

1.4腫瘤標(biāo)志物檢測(cè) 抽取患者清晨空腹靜脈血液5 mL,離心后取血清,由我院檢驗(yàn)科采用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清糖類抗原125(carbohydrate antigen 125,CA125)、糖類抗原199(carbohydrate antigen 199,CA199)水平。

1.5蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot,WB) 裂解液緩沖液(1×RIPA, cell Signaling Technology,USA)提血清中總蛋白,Bradford Assay(Bio-Rad,美國(guó))測(cè)定蛋白濃度,將30 μg蛋白進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(Millipore,美國(guó))。用含0.1% Tween 20的5%脫脂牛奶在室溫下封閉2 h后,用一抗在4 ℃下孵育過夜。DNMT3B與FOXC1的一抗(1∶1 000)來(lái)自Novus bioicals (Littleton,CO,美國(guó),科羅拉多州)。在與辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗(1∶5 000)孵育后,使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑(Thermo Pierce,USA)將蛋白顯影,使用Quantity Ones 4.4.1(Bio-Rad Laboratories,Berkeley,CA)密度法測(cè)定靶蛋白條帶水平。以β-actin為內(nèi)參對(duì)照。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料采用單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。Spearman相關(guān)系數(shù)、Pearson相關(guān)系數(shù)分析相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1宮頸癌患者彩色多普勒超聲特征 我們采用Adler分級(jí)來(lái)描述宮頸癌患者的彩色多普勒超聲特征,隨著宮頸癌患者國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics,FIGO)臨床分期的增加,宮頸癌患者的Adler分級(jí)也逐漸升高。50例對(duì)照組健康女性的Adler分級(jí)均為0級(jí),宮頸癌FIGO臨床分期Ⅲ～Ⅳ級(jí)患者的Adler分級(jí)均為Ⅲ級(jí)。見表1。

表1 宮頸癌患者彩色多普勒超聲特征

2.2DNMT3B、FOXC1在宮頸癌中的表達(dá) WB檢測(cè)結(jié)果顯示,研究組DNMT3B、FOXC1蛋白表達(dá)水平均高于對(duì)照組(P<0.05)。人工受試者曲線分析(ROC)結(jié)果顯示,DNMT3B、FOXC1診斷宮頸癌的AUC分別為0.889、0.925。見圖1,2,表2。

圖1 DNMT3B、FOXC1在宮頸癌中的表達(dá)

圖2 DNMT3B、FOXC1在宮頸癌中的蛋白表達(dá)圖

2.3DNMT3B、FOXC1與彩色多普勒超聲的相關(guān)性分析 隨著Adler分級(jí)的增加,宮頸癌患者DNMT3B、FOXC1的表達(dá)水平也越來(lái)越高(P<0.05),表明宮頸癌中DNMT3B、FOXC1的表達(dá)水平與Adler分級(jí)呈正相關(guān)。見圖3。

表2 DNMT3B、FOXC1鑒別診斷宮頸癌的ROC分析

圖3 DNMT3B、FOXC1與彩色多普勒超聲的相關(guān)性分析

2.4DNMT3B、FOXC1與CA125、CA199表達(dá)的相關(guān)性分析 CA125、CA199是兩個(gè)與宮頸癌密切相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物,因此分析了DNMT3B、FOXC1與CA125、CA199表達(dá)的相關(guān)性,Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示,DNMT3B、FOXC1與CA125、CA199的表達(dá)均呈正相關(guān)。見圖4。

2.5DNMT3B、FOXC1與宮頸癌患者臨床特征的關(guān)系 將DNMT3B、FOXC1與117例宮頸癌患者的臨床特征進(jìn)行分類比較,結(jié)果顯示,不同腫瘤大小、高危型HPV(-/+)、淋巴結(jié)是否發(fā)生轉(zhuǎn)移、FIGO分期不同的患者癌中DNMT3B的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),另外FOXC1在不同分化程度以及FIGO分期的患者癌中表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

圖4 DNMT3B、FOXC1與CA125、CA199表達(dá)的相關(guān)性分析

表3 DNMT3B、FOXC1與宮頸癌患者臨床特征的關(guān)系

3 討 論

動(dòng)態(tài)超聲是目前婦產(chǎn)科診斷和治療中應(yīng)用最廣泛、最成熟的影像學(xué)方法之一[9]。在本次研究選擇了彩色多普勒超聲中反映宮頸癌血流豐富程度的Adler分級(jí),分析DNMT3B、FOXC1與宮頸癌超聲特征的相關(guān)性,以期為不發(fā)達(dá)地區(qū)或基層醫(yī)院提供更多的診斷宮頸癌的手段。

DNMT3B可能是宮頸癌治療的新靶點(diǎn)。在Sun等[8]的研究結(jié)果中顯示,就病毒易感性而言,DNMT3B可以影響病毒與宿主間的相互作用,維持病毒持續(xù)存在,促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生病理改變。本次研究結(jié)果顯示,宮頸癌中DNMT3B、FOXC1的表達(dá)水平與Adler分級(jí)呈顯著正相關(guān)。這提示,檢測(cè)DNMT3B、FOXC1表達(dá)可以作為Adler分級(jí)的參考。由于腫瘤組織中血管的異常增生,宮頸癌細(xì)胞往往增殖、分裂迅速[10]。利用彩色多普勒超聲可以檢測(cè)腫瘤組織中各種類型的血流信號(hào),反映腫瘤組織中的血管特殊結(jié)構(gòu)和血流特征[11]。Adler分級(jí)主要集中在血流信號(hào)上,在一定程度上可以反映宮頸癌周圍血管的增殖和微血管密度。既往的研究[12]已報(bào)道血液信號(hào)在一定程度上可以預(yù)測(cè)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。DNMT3B與FOXC1同樣被報(bào)道與肝癌的侵襲與轉(zhuǎn)移有關(guān)。Lai等[13]的研究結(jié)果顯示DNMT3B通過調(diào)節(jié)IL-6/STAT3的表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞的下垂和抑制細(xì)胞的增殖。但是DNMT3B與宮頸癌的研究還鮮有報(bào)道,因此本研究可能將未來(lái)宮頸癌的診治提供新得研究方向。而FOXC1則被miR-374c-5p調(diào)節(jié)參與宮頸癌的轉(zhuǎn)移,并且FOXC1在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌中表達(dá)上調(diào)[14]。我們也分析了DNMT3B與FOXC1宮頸癌患者臨床特征的關(guān)系,結(jié)果顯示DNMT3B與腫瘤大小、高危型HPV(-/+)、淋巴結(jié)是否發(fā)生轉(zhuǎn)移、FIGO分期有關(guān),FOXC1與腫瘤分化程度以及FIGO分期有關(guān)。但目前關(guān)于這方面的相關(guān)報(bào)道較少,這個(gè)結(jié)論還需要更多的數(shù)據(jù)驗(yàn)證。但總的來(lái)說,DNMT3B與FOXC1有望成為預(yù)測(cè)宮頸癌患者預(yù)后的可靠指標(biāo)。

隨著腫瘤標(biāo)志物研究的不斷深入,腫瘤相關(guān)標(biāo)志物在癌癥診斷和治療中的作用日益重要[15]。有研究表明,宮頸癌與CA125和CA199標(biāo)記物存在密切關(guān)系,也是宮頸癌的有效診斷標(biāo)志物[16]。在本次研究中,CA125和CA199在宮頸癌中的表達(dá)均明顯升高,并且與DNMT3B、FOXC1的表達(dá)存在明顯正相關(guān)。本研究進(jìn)一步分析了DNMT3B與FOXC1在宮頸癌中的診斷價(jià)值,ROC結(jié)果顯示DNMT3B與FOXC1對(duì)宮頸癌均具有較好的診斷價(jià)值。

不過需要注意的是,本次研究的樣本量不夠大,臨床分期相對(duì)粗糙,只進(jìn)行了FIGO分期。其次本研究沒有借鑒宮頸癌特異性標(biāo)志物如鱗狀細(xì)胞癌的腫瘤標(biāo)志物,應(yīng)在今后的研究中進(jìn)一步闡明。而且Adler分級(jí)存在一定的主管因素,需要經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)師進(jìn)行評(píng)價(jià)分級(jí)。

綜上所述,宮頸癌中DNMT3B、FOXC1表達(dá)與宮頸癌動(dòng)態(tài)超聲結(jié)果有關(guān),對(duì)宮頸癌的診斷有一定價(jià)值。