巨噬細胞在局限性硬皮病和系統(tǒng)性硬化癥皮損中的極化狀態(tài)

王芳,李心欣,李曼,2,丁曉嵐,徐前喜,杜娟

局限性硬皮病(localized scleroderma,LS)和系統(tǒng)性硬化癥(systemic sclerosis,SSc)的患者皮損均出現(xiàn)不同程度纖維硬化,組織病理均表現(xiàn)為早期混合炎癥細胞浸潤,晚期真皮大量膠原沉積和附屬器減少［1-2］。近年來,巨噬細胞在組織纖維化和創(chuàng)傷愈合中的作用逐漸受到關注［3］。巨噬細胞是固有免疫中的重要調(diào)節(jié)者,激活后可極化為M1型或M2型,兩種細胞亞型在炎癥活動、創(chuàng)傷愈合以及組織纖維化的不同階段各司其職［4］。M1型細胞以促進炎癥、清除病原體和細胞,促進纖維溶解為主;M2型細胞則傾向抑制炎癥、促纖維化和血管增生等作用［3, 5］。目前,國內(nèi)尚無針對這一組硬化性皮膚疾病皮損中巨噬細胞極化狀態(tài)的相關研究,而其極化與皮損硬化程度、患者臨床病程和其他臨床指標的關聯(lián)性尚需探討。因此,本研究收集LS和SSc患者的皮損,觀察巨噬細胞的極化狀態(tài)及其與疾病的相關性,探討巨噬細胞極化在LS和SSc皮膚纖維化中的作用。

1 資料與方法

1.1研究對象 收集2018年1月—2020年9月就診于本科的局限性硬皮病和系統(tǒng)性硬化患者病例并進行回顧性研究,包括:局限性硬皮病24例和系統(tǒng)性硬化18例,同時收集健康人對照10例?；颊叩牟∈?、臨床表現(xiàn)及組織病理檢查均符合相應疾病診斷標準:LS參見2016年歐洲或2018年日本［6］局限性硬皮病診斷標準;SSc參見2013年美國風濕病學會(ACR)和歐洲抗風濕病聯(lián)盟(EULAR)聯(lián)合提出的診斷標準［7］;皮損活檢前4周內(nèi)未進行任何口服糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑或外用藥治療,取材部位為活動期邊緣,同時完整記錄患者病情、皮損部位和相關血清學檢查(ANA和Scl-70)結果。對照組選取整形或外傷手術需切取的健康皮膚,臨床中無自身免疫或其他疾病,無糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑或外用藥使用史。實驗組與對照組在性別、年齡等方面相符,具有可比性。本實驗經(jīng)過北京大學人民醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2主要試劑 免疫組化CD68抗體購于北京中杉金橋、iNOS抗體購于美國Abcam公司、CD163抗體購于美國徠卡公司,Masson三染色試劑盒購于瑞士Roche公司,自身抗體ANA和Scl-70均由北京大學人民醫(yī)院檢驗科提供檢測。

1.3實驗方法和步驟 取皮損/皮膚后經(jīng)4%甲醛溶液固定,石蠟包埋,連續(xù)切取4 μm切片,脫蠟和暴露抗原處理,嚴格按照免疫組織化學和Masson三染色試劑盒實驗步驟進行,設立相應陽性、陰性參照。總巨噬細胞、M1亞型和M2亞型分別用CD68、iNOS和CD163標記,用Masson三染色法行膠原染色并測定膠原容積分數(shù)(CVF)。

1.4圖像分析 將免疫組織化學和特殊染色切片用顯微鏡(美國Leica)高倍鏡頭下(400×)采集圖像,對每個標本目標區(qū)域隨機選取不重疊的3～5處視野,在Image J 1.53圖像系統(tǒng)輔助下分別測算LS組、SSc組和對照組標本組織真皮區(qū)域單位面積內(nèi)CD68、CD163、iNOS的單位面積內(nèi)細胞陽性數(shù)(cells/HP)和膠原容積百分比(%)。

2 結果

2.1患者臨床資料 LS組、SSc組和對照組患者的年齡、性別、病程、自身抗體譜ANA和Scl-70陽性率分別如表1所示,各組患者年齡具有可比性(F=1.09,P=0.35)。LS組中僅有1例患者表達ANA(1∶80斑點型),Scl-70均為陰性;而SSc組患者中ANA表達比例較高(83.33%,陽性患者滴度從1∶160至1∶1 280),Scl-70陽性率為(16.67%,陽性患者從+至3+),見表1。

表1 患者臨床資料及血清學指標

2.2M1/M2型巨噬細胞在兩種疾病皮損中的表達分布情況 LS組和SSc組皮損的真皮淺深層血管周圍及膠原束間可見CD68+總巨噬細胞表達均較對照組升高(圖1),分別為LS組(32.54±12.12)/HP、SSc組(21.83±7.28)/HP和對照組(6.70±2.83)/HP。LS、SSc組和對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(t=6.61、6.27,P<0.05),見圖2。其中,特異性表達iNOS的M1型巨噬細胞在LS組和SSc患者真皮淺層僅有較少淡棕色陽性著色(圖1),與對照組染色結果相似,分別為LS組(11.29±8.65)/HP、SSc組(13.08±7.41)/HP和對照組 (8.05±4.69)/HP,差異無統(tǒng)計學意義(t=1.11、1.93,P>0.05)。然而,特異性表達CD163的M2型巨噬細胞在真皮淺深層的血管周圍和膠原束間均有深棕色中等密度表達(圖1),分別為LS組(42.48±18.77)/HP、SSc組(38.63±17.71)/HP和對照組(10.42±3.55)/HP,疾病組和對照組之間差異有統(tǒng)計學意義(t=5.32、4.94,P<0.05),見圖2。

圖1 CD68、iNOS、CD163在LS組、SSc組和對照組皮損的免疫組織化學染色結果 (×400)

Note:**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1,ns P>0.05.

2.3M2型巨噬細胞浸潤與病程相關性 將LS組患者根據(jù)病程長短(起病至皮損取材的時間)分層為LS早期組(≤1年,12例)和LS晚期組(>1年,12例),真皮CD163+細胞浸潤數(shù)量分別為(45.43±18.34)/HP和(39.52±19.52)/HP,兩亞組間M2型巨噬細胞浸潤的數(shù)量相當,差異無統(tǒng)計學意義(t=0.77,P>0.05)。同樣,將SSc組患者按病程分為早期組(≤1年,8例)和晚期組(>1年,10例)得到一致趨勢,差異無統(tǒng)計學意義(t=0.45,P>0.05)。

2.4M2型巨噬細胞和真皮膠原容積的相關性 通過Masson三染色可顯示真皮膠原束形態(tài)和分布,LS組和SSc組中膠原束粗大增厚,膠原間隙變窄,而對照組真皮中可見纖細彎曲的膠原束錯落有致排列(圖3)。通過ImageJ分離顏色通道所得的灰度圖計算CVF發(fā)現(xiàn),LS組和SSc組的CVF均遠高于對照組,分別為LS組(75.81±5.43)%、SSc組(68.33±8.37)%和對照組(55.53±3.83)%(t=10.71、4.55,P<0.05)。Pearson相關性分析顯示,LS皮損和SSc皮損中M2型巨噬細胞表達均與CVF無明顯關聯(lián)(r=-0.06、-0.12,P>0.05)。

圖3 LS組、SSc組和對照組皮損真皮Masson染色 (×200)

3 討論

局限性硬皮病和系統(tǒng)性硬化癥是一組與T淋巴細胞、巨噬細胞失衡相關的自身免疫疾病,皮膚可表現(xiàn)為纖維硬化。血液中靜息狀態(tài)的單核/巨噬細胞M0在外傷、炎癥等刺激因素作用下募集至皮膚組織,轉化為經(jīng)典M1型或替代激活M2型細胞發(fā)揮作用,這個過程稱為極化［5］。經(jīng)典M1型巨噬細胞在組織創(chuàng)傷和炎癥早期發(fā)揮作用,通過釋放一氧化氮合酶(iNOS,本實驗標記蛋白)、白介素IL-1β、IL-6、IL-12和TNF等促進炎癥過程、吞噬凋亡細胞或病原體、抗原提呈和促纖維溶解等作用。而組織創(chuàng)傷和炎癥后期,替代激活M2型巨噬細胞升高,特異性標記為甘露糖受體-1(CD206)和巨噬細胞清除劑受體(CD204和CD163)。M2型細胞可釋放VEGF、EGF、IL-10、TGF-β1等,參與血管增生和組織纖維化等修復過程［5,8］。在不同的疾病、病程和組織器官中巨噬細胞的極化狀態(tài)和作用可能不同。

本研究發(fā)現(xiàn),LS和SSc患者皮損中的CD68+總巨噬細胞浸潤數(shù)量顯著升高,以CD163+M2型細胞占主導;iNOS+M1型細胞在兩組疾病中表達均很低。據(jù)文獻檢索,本研究首次收集了兩種以皮膚纖維化為特點的疾病,證實M2型巨噬細胞主導的炎癥在皮膚纖維化的早晚期主導作用,而促炎相關的M1型巨噬細胞可能僅參與在極早期的炎癥過程中。M2型巨噬細胞不僅在皮損中表達升高,有研究發(fā)現(xiàn)SSc患者外周血中單核/巨噬細胞數(shù)量增加且凋亡降低［9］,M2型細胞(CD163、CD206、CD204三標)的百分比顯著高于健康人［10］,并且與患者肺間質(zhì)纖維化程度等臨床表現(xiàn)正相關。多條細胞通路可參與M2型巨噬細胞的極化,IL-4/IL-13/STAT6、TGF-β1/smad2/3、PPARγ/SOCS1/STAT6等多條通路可以促進靜息狀態(tài)巨噬細胞M0或經(jīng)典激活M1型向M2型極化［11］。極化后的M2型巨噬細胞如何影響皮膚纖維化仍值得研究。以LS患者為例,Higashi-Kuwata等［12］發(fā)現(xiàn)M2型細胞直接分泌大量TGFβ-1,促進成纖維細胞分泌細胞外基質(zhì),同時通過增加組織金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)合成而抑制金屬蛋白酶類(MMPs)活性,減少膠原蛋白降解。M2型巨噬細胞也可通過分泌IL-10、IL-13、IL-33等Th2型細胞因子促進纖維化過程,同時趨化因子(CCL2、CCL17、CCL22和CCL18等)和金屬蛋白酶MMPs也參與到細胞外基質(zhì)的分泌和重塑中［13］。本實驗也證實在LS組和SSc組的早晚期皮損中M2型巨噬細胞浸潤數(shù)量均較多,M2型巨噬細胞數(shù)量并不隨病程延長而減少或凋亡,M2型巨噬細胞應該在皮膚纖維化早期即發(fā)揮作用。而真皮中M2型巨噬細胞是如何發(fā)揮作用的,是否與Th2型細胞及其相關因子互相協(xié)同作用也值得進一步研究［14］。本研究值得進一步思考:是否臨床中有皮膚纖維硬化的疾病(如:硬腫病、硬化性黏液水腫或硬皮病樣GVHD等)均有M2型巨噬細胞的參與?而調(diào)節(jié)相關炎癥細胞和細胞因子可成為皮膚纖維化疾病中的共同靶點。

Masson三染色后測量真皮層CVF可衡量皮損的纖維化程度［15］。本實驗中LS組和SSc組CVF較健康組均明顯升高。但通過Pearson相關性分析顯示,M2型巨噬細胞數(shù)量(cells/HP)與CVF無直接線性相關。分析認為,M2型巨噬細胞極化可能為皮損纖維化的早期改變,與相關的Th2型淋巴細胞共同分泌相關白介素、趨化因子和生長因子等,進而激活成纖維細胞活化,促進膠原纖維合成。因此這一復雜的炎癥過程中M2型細胞的數(shù)量和晚期的“結果”非直接線性相關。

綜上所述,LS和SSc患者皮損中均存在巨噬細胞向M2型極化,提示其在病程早晚期均發(fā)揮作用,但可能與皮膚纖維化程度無直接線性關聯(lián)。