HIV-1感染者抗病毒治療后耐藥突變與影響因素分析

張鑫愉,劉萌,唐湘云,李維民,馬峰,李巖,王瑩瑩,安寧,路新利,

Ⅰ型人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus type one,HIV-1)在復(fù)制過程中極易發(fā)生突變,產(chǎn)生耐藥毒株,并成為抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(antiretroviral therapy,ART)成功的主要障礙。目前我國標(biāo)準(zhǔn)化的一線和二線方案分別為替諾福韋/齊多夫定+拉米夫定+依非韋倫/奈韋拉平(TDF/AZT+3TC+EFV/NVP)和替諾福韋/齊多夫定+拉米夫定+克力芝(TDF/AZT+3TC+LPV/r)［1］,隨著“發(fā)現(xiàn)即治”等抗病毒治療策略的廣泛實(shí)施,HIV-1耐藥毒株不斷出現(xiàn),并可能在人群中傳播,為艾滋病防治工作帶來了新的挑戰(zhàn)［2］。如在治療前和治療不佳時進(jìn)行耐藥檢測,及早發(fā)現(xiàn)耐藥毒株、了解因治療引起的突變情況,就可及時調(diào)整治療方案,抑制耐藥毒株的傳播。本研究采用耐藥基因型檢測方法對河北省HIV-1感染者抗病毒治療后失敗人群進(jìn)行耐藥基因突變調(diào)查,以了解該地區(qū)HIV-1獲得性耐藥(acquired drug resistance, ADR)的突變情況和流行特征,為制定有效的高效抗病毒治療方案提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1研究對象 以2019年采集的136例河北省參加抗病毒治療后治療失敗(病毒載量≥1 000 CPs/mL)的HIV-1患者的全血為研究對象,測定CD4+T淋巴細(xì)胞(以下簡稱“CD4細(xì)胞”)計(jì)數(shù)。分離血漿后進(jìn)行病毒載量測定和耐藥基因型檢測。在患者知情同意情況下,通過面對面問卷調(diào)查獲得研究對象的基本人口學(xué)特征、感染途徑、抗病毒治療等基本信息。本研究已獲得河北省疾病預(yù)防控制中心倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1CD4細(xì)胞數(shù)和病毒載量測定 取50 μL抗凝全血,采用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)方法檢測CD4細(xì)胞數(shù);應(yīng)用Roche公司全自動病毒載量檢測儀(COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan)及配套試劑盒(COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test v2.0,Lot:10H27383)檢測,HIV-1 RNA病毒載量線性范圍:20～1.0×107CPs/mL。

1.2.2病毒核酸提取 用上海羅氏制藥有限公司生產(chǎn)的提取試劑盒(MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit,Lot:49167000)及全自動核酸提取儀(MagNA Pure 96)進(jìn)行HIV-1病毒核酸提取。

1.2.3病毒基因擴(kuò)增和測序 采用in-house法［3］針對病毒pol區(qū)蛋白酶和逆轉(zhuǎn)錄酶基因編碼區(qū)基因(1.3 kb,HXB2:2550-3870)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增試劑使用Takara的One step RNA PCR Kit,2×Taq PCR預(yù)混試劑。最終PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后,陽性樣本送北京博邁德基因測序有限公司進(jìn)行測序。

1.2.4序列分析 使用Sequencher5.4.5對返回的原始反應(yīng)序列進(jìn)行拼接,拼接后采用MEGA 6. 0. 6軟件(Clustal W)進(jìn)行序列的比對、剪切和清理。將獲得序列上傳至Stanford University的HIV Drug resistance database在線數(shù)據(jù)庫(https://hivdb.stanford.edu/),使用HIV db Program在線程序分析基因型耐藥突變和藥物敏感性。

1.2.5基因型判定 將獲得的序列與Los Alamos HIV 數(shù)據(jù)庫(https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HIV/mainpage.html)中的HIV-1亞型進(jìn)行比對,并使用HIV Blast在線軟件(https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/BASIC_BLAST/basic_blast.html)進(jìn)行校對確認(rèn)。

1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用Excel2019整理各種突變位點(diǎn)的突變頻數(shù)和耐藥強(qiáng)度;應(yīng)用SPSS23.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析。將基本流行特征中各變量和是否發(fā)生耐藥進(jìn)行單因素Logistics回歸分析,將P<0.1的特征納入多因素回歸分析。

2 結(jié)果

2.1基本流行特征 成功擴(kuò)增的136例HIV-1感染者中,以男性(83.82%,114/136)、25～49歲(67.65%,92/136)為主;感染者職業(yè)農(nóng)民占大多數(shù)(47.79%,65/136);感染途徑主要是同性傳播(75.00%,102/136),其次是異性傳播(13.97%,19/136);136例感染者多以一線藥物為首選治療方案(68.38%,93/136)。

2.2基因型分析 獲得136條有效pol區(qū)基因序列,樣本擴(kuò)增成功率為100%?；蛐头治鲲@示CRF01_AE亞型、B亞型、CRF07_BC亞型、CRF55_01B亞型和其他亞型(A亞型、C亞型、CRF08_BC亞型、CRF68_01B亞型)占比分別為40.44%(55/136)、23.53%(32/136)、22.79%(31/136)、4.41%(6/136)和8.82%(12/136)。

2.3靶基因耐藥情況 對獲得基因序列的136例已治療樣本進(jìn)行耐藥位點(diǎn)突變分析,結(jié)果表明共106例發(fā)生耐藥突變,其中2例雖然產(chǎn)生耐藥位點(diǎn)突變,但并未導(dǎo)致對靶基因藥物產(chǎn)生耐藥性,耐藥發(fā)生率為76.47%(104/136);產(chǎn)生耐藥的104例樣本中,94.23%(98/104)對NNRTIs耐藥,其中80例對奈韋拉平(NVP)高度耐藥,77例對依非韋倫(EFV)高度耐藥;68.27%(71/104)對NRTIs 耐藥,其中對拉米夫定(3TC)和恩曲他濱(FTC)高度耐藥最為嚴(yán)重,都為56例,其次是阿巴卡韋(ABC)為41例;對蛋白酶抑制劑(protease inhibitors,PIs)藥物耐藥情況為1例潛在耐藥。交叉耐藥情況為:交叉耐藥占全部耐藥者的68.38%(68/104),其中65例對NRTIs和NNRTIs類藥物同時耐藥,3例對NNRTIs,NRTIs和PIs同時耐藥。

2.4兩種藥物突變位點(diǎn)分析 結(jié)果顯示,在136例樣本中,106例樣本存在突變位點(diǎn),其中104例樣本產(chǎn)生耐藥,未產(chǎn)生耐藥的2例分別在PIs次要編碼區(qū)的Q58E和NRTIs編碼區(qū)的V75I,這兩個位點(diǎn)未導(dǎo)致對目前艾滋病抗病毒藥物中蛋白酶抑制劑和核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑的耐藥。NRTIs耐藥突變位點(diǎn)主要是M184V/I,突變率為71.83%(51/71),此位點(diǎn)對FTC和3TC高度耐藥,對ABC低度耐藥(增加對AZT和TDF的敏感度);其次是K65R,突變率為43.66%(31/71),此位點(diǎn)對ABC、FTC、3TC中度耐藥,對TDF高度耐藥;其他常見NRTI耐藥突變位點(diǎn)情況為:Y115F突變率19.72%(14/71)、D67N突變率14.08%(10/71)、A62V突變率12.68%(9/71)。NNRTIs耐藥突變位點(diǎn)主要是K103N,突變率28.57%(28/98)和V106M,突變率27.55%(27/98),K103N對EFV和NVP高度耐藥,V106M對EVF和NVP高度耐藥,對DOR中度耐藥;其他常見NNRTI耐藥突變位點(diǎn)情況為:Y181C突變率21.43%(21/98)、V179D突變率19.39%(19/98)、G190S突變率16.33%(16/98)、F227L突變率10.20%(10/98)。具體耐藥突變發(fā)生情況和耐藥程度見表1～2。

表1 NRTIs類耐藥突變類型的各位點(diǎn)突變頻數(shù)和耐藥情況

表2 NNRTIs類耐藥突變的各位點(diǎn)突變頻數(shù)和耐藥情況

此外,對經(jīng)過抗病毒治療的136例患者進(jìn)行亞型分析,其中55例CRF01_AE患者中46例發(fā)生耐藥,占所有耐藥亞型的44.23%(46/104),其次為B亞型24.04%(25/104)。分析不同亞型上幾種常見突變位點(diǎn)的發(fā)生頻率,使用χ2檢驗(yàn)(H0:3種亞型不同位點(diǎn)分布有關(guān)聯(lián);H1:3種亞型不同位點(diǎn)分布無關(guān)聯(lián)),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),詳情見表3。

表3 耐藥位點(diǎn)突變頻率在主要亞型間的情況分析 例(%)

2.5不同治療藥物耐藥差異 NNRTIs類突變和NRTIs類突變的情況比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.391,P=0.001)。

2.6發(fā)生HIV-1獲得性耐藥的影響因素 對各項(xiàng)人口流行病學(xué)分布特征和是否產(chǎn)生耐藥進(jìn)行單因素Logistic回歸分析方法篩選危險(xiǎn)因素,P<0.2(α=0.2)的變量納入多因素Logistics回歸分析,結(jié)果顯示民族和傳播途徑是影響獲得性耐藥發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。與漢族相比,少數(shù)民族是影響ADR發(fā)生的保護(hù)因素;與血液傳播相比,同性傳播,異性傳播和母嬰傳播是ADR的危險(xiǎn)因素。將民族和傳播途徑納入多因素Logistics回歸分析,P>0.05(α=0.05),最終無危險(xiǎn)因素進(jìn)入模型,見表4。

表4 基本流行特征和研究對象耐藥影響因素分析

3 討論

截至2019年12月底,河北省累計(jì)報(bào)告現(xiàn)存活HIV/AIDS患者 13 620例,報(bào)告死亡2 374例,全省人群感染率17.94/10萬,屬于低流行省份。但近年來傳播途徑發(fā)生變化,傳播人群呈多樣化,以及耐藥基因突變給河北省AIDS防治帶來新的挑戰(zhàn)［4］。在本次研究納入的136例有效樣本中,同性傳播為主要的傳播途徑,所占比例為75.00%(102/136)。男男性行為者(men who have sex with men, MSM)由于對自我保護(hù)的意識不強(qiáng),高危性行為普遍,是AIDS感染的高危人群［5］。年齡分布多以青壯年為主(67.65%,92/136)。職業(yè)多以農(nóng)民為主(47.79%,65/136),該群體文化程度有限,在艾滋病的防治工作中,應(yīng)對該人群重點(diǎn)進(jìn)行宣傳教育［6］。HIV-1是一種RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒,每天約復(fù)制107～108輪［7］,其功能酶編碼基因上藥物作用靶點(diǎn)發(fā)生基因突變,則產(chǎn)生耐藥性,耐藥突變給抗病毒治療帶來巨大障礙。本研究中ADR耐藥率為76.47%(104/136),相較于往年(2017年,51.92%)明顯升高［8］,這可能與近些年抗病毒藥物的廣泛使用密切相關(guān)［9］。ADR耐藥構(gòu)成比與亞洲國家類似,低于歐美發(fā)達(dá)國家［10］。耐藥基因型檢測耐藥率表明了本省抗病毒治療失敗的人群中有23.53%(32/136)病毒學(xué)抑制失敗的個案與基因型耐藥無關(guān),提示了本省艾滋病抗病毒治療工作中應(yīng)加強(qiáng)服藥監(jiān)督和依從性教育［11］。

本研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生耐藥突變的104例樣本中,NRTIs類耐藥位點(diǎn)中M184V/I突變頻率最高(71.83%,51/71),其次為K65R(43.66%,31/71)。本次研究發(fā)現(xiàn)有部分研究對象具有潛在HIV耐藥突變位點(diǎn)(PIs次要編碼區(qū)Q58E,NRTIs編碼區(qū)的V751),這些位點(diǎn)雖然并不在WHO推薦的耐藥位點(diǎn)列表中,但這些耐藥突變位點(diǎn)如與其他位點(diǎn)聯(lián)合作用的話,可能會造成HIV感染者對抗病毒治療藥物的潛在耐藥。

通過對三種常見亞型(CRF01_AE,B,CRF07_BC)上8種突變頻率較高的位點(diǎn)進(jìn)行χ2檢驗(yàn),差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但可通過每一位點(diǎn)在不同亞型上的突變率發(fā)現(xiàn)顯著差異,如NNRTIs類位點(diǎn)V106M在CRF07_BC亞型和B亞型上的突變頻率為42.11%和16.00%,該結(jié)果雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但仍值得注意,造成此結(jié)果的原因有可能是樣本量過小,接下來的研究可適當(dāng)增加樣本量。

隨著發(fā)現(xiàn)即治療政策的實(shí)施,ART范圍進(jìn)一步擴(kuò)大,HIV-1耐藥基因突變已成為治療效果下降的主要原因［12］。通過單因素Logistics回歸對耐藥發(fā)生率和治療方案進(jìn)行分析,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對NNRTIs類耐藥突變和NRTIs類耐藥突變的頻率進(jìn)行χ2檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這是由于一線藥物的治療方案多為兩種非核苷類逆轉(zhuǎn)酶抑制劑+一種核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑［13］,而目前由TDF、3TC和EFV組成的聯(lián)合治療方案是我國最常用的免費(fèi)一線治療方案［14］(此次研究中占比67.2%),造成了研究對象的NNRTIs類的藥物突變率更高。

對影響獲得性耐藥發(fā)生的危險(xiǎn)因素進(jìn)行Logistics回歸分析,性別、年齡、職業(yè)、CD4細(xì)胞水平、治療方案和亞型各組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,民族和傳播途徑是影響耐藥發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究的傳播途徑中,同性傳播較異性傳播、血液傳播和母嬰傳播發(fā)生獲得性耐藥風(fēng)險(xiǎn)高,這可能與同性傳播患者治療依從性差相關(guān)［15］,而血液傳播大多為吸毒人群,因正在治療的吸毒人群主要在門診定期拿藥,依從性強(qiáng),長期穩(wěn)定治療有保障。最終無危險(xiǎn)因素進(jìn)入多因素Logistics回歸模型。

綜上所述,為了減少抗病毒治療中耐藥的發(fā)生,必須加強(qiáng)對患者的耐藥監(jiān)測,以及時發(fā)現(xiàn)耐藥從而及時調(diào)整用藥方案,尤其應(yīng)謹(jǐn)慎使用耐藥率較高的3TC、NVP和EFV,提高治療效果［16］。此外,應(yīng)對艾滋病患者特別是MSM艾滋病患者加強(qiáng)抗病毒治療依從性教育［17］,并隨著治療時間的延長反復(fù)強(qiáng)調(diào)服藥依從性,以盡可能獲得良好的治療效果。