達(dá)烏爾黃鼠(Spermophilus dauricus)褐色脂肪年周期變化

宋士一, 劉 語, 任 月, 彭 霞, 楊 明

(1. 沈陽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 沈陽 110034;2. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院, 太原 030031; 3. 沈陽師范大學(xué) 生物系統(tǒng)進(jìn)化與農(nóng)業(yè)生態(tài)重點(diǎn)實驗室, 沈陽 110034)

褐色脂肪組織(brown adipose tissue, BAT)廣泛存在于小型哺乳動物中[1],分布于頸部、肩胛骨和主動脈周圍,其可減少脂肪堆積,并通過非顫抖性產(chǎn)熱快速產(chǎn)生熱量,為寒冷環(huán)境的動物提供熱量,提高生存率[2-3]。副交感神經(jīng)末梢(parasympathetic nerves)釋放去甲腎上腺素,與其β3受體結(jié)合后,能夠激活解耦聯(lián)蛋白-1(uncoupling protein 1,UCP 1),促進(jìn)BAT產(chǎn)熱[4]。哺乳動物中,低溫是調(diào)節(jié)BAT活性的重要因素[5],研究發(fā)現(xiàn)冬季中緬樹鼩(Tupaiabelangerichinensis)BAT重量和UCP 1表達(dá)顯著高于夏季[6]。BAT最初在冬眠哺乳動物冬眠前準(zhǔn)備階段被發(fā)現(xiàn),稱為“冬眠腺”,BAT產(chǎn)熱對動物冬眠期間的體溫恢復(fù)有很重要的作用[1],動物覺醒過程中亦伴隨著BAT激活[7]。冬眠動物通過增加體內(nèi)非顫抖性產(chǎn)熱來終止冬眠狀態(tài)[8]。UCP 1活性在動物冬眠和休眠過程中受到調(diào)節(jié)。例如,黃鼠在冬眠前BAT質(zhì)量、線粒體豐度和UCP 1表達(dá)增加[9],使BAT的產(chǎn)熱能力增強(qiáng)[10]。研究發(fā)現(xiàn),北極黃鼠(Urocitellusparryii)[11]、多紋黃鼠(Ictidomystridecemlineatus)[9]和達(dá)烏爾黃鼠(Spermophilusdauricus)[12]冬眠期間BAT中的UCP 1顯著增加。

冬眠指活躍狀態(tài)時體溫恒定的一些動物在冬季(有時在晚秋或早春)伴隨體溫和代謝降低出現(xiàn)的一種昏睡狀態(tài)。現(xiàn)存哺乳動物很多類群,如針鼴、有袋動物、食蟲動物、蝙蝠、嚙齒動物和食肉動物中普遍存在冬眠的物種。冬眠是一種生理和行為上的適應(yīng),動物通過冬眠前的能量儲存與冬眠期間代謝抑制的結(jié)合,確保在食物短缺的季節(jié)生存下來[13-17]。哺乳動物在冬眠期間表現(xiàn)出體溫、代謝率、心率和呼吸頻率的顯著下降。 冬眠期,動物體溫接近環(huán)境溫度甚至可以降至0 ℃以下,如多紋黃鼠[18]、北極黃鼠[15]和刺猬(Erinaceuseuropaeus)在冬眠期體溫下降到環(huán)境溫度。冬眠期,動物平均代謝率可降低到基礎(chǔ)代謝率的5.1%[19],心率和呼吸頻率可降至3%[20]。研究表明,在深眠階段,黃鼠、倉鼠和旱獺的呼吸頻率可降到3～10次·min-1,有的動物甚至還會出現(xiàn)呼吸停歇現(xiàn)象。哺乳動物冬眠的最大收益是節(jié)約能量。深冬眠期間每日能量消耗可以降低至常溫狀態(tài)的1.2%[21]。研究表明,野外瑞士黃鼠(Spermophilusrichardsonii)在長達(dá)8 m的冬眠期會節(jié)約88%的能量消耗[22],哺乳動物冬眠期間消耗的能量來源于冬眠前貯存的食物或貯存于身體內(nèi)的脂肪,這2類動物分別稱為貯食類冬眠動物和貯脂類冬眠動物[23]。貯脂類冬眠動物生活史的年周期主要包括繁殖、生長、育肥和冬眠等過程[16],其顯著特征是在活躍季節(jié)尤其是冬眠前大量攝食并在體內(nèi)貯存脂肪,這個階段被稱為動物育肥期,冬眠動物在秋季冬眠前進(jìn)行體脂貯存可使體重增加1倍[24-26], 進(jìn)入冬眠期會停止攝食[27]。研究表明,育肥期的東北刺猬體重、肥滿度、消化器官和生殖器官重量顯著增加[28]。冬眠期,動物主要以脂質(zhì)代謝供能為主[14],動物體重呈下降趨勢。

達(dá)烏爾黃鼠是一種典型的貯脂類冬眠動物, 大約冬眠5～6 m,由于分布廣、數(shù)量多、好采集等特點(diǎn)而成為典型的研究冬眠的實驗動物[28]。該物種主要分布在中國北方、蒙古及俄羅斯等地。本組已有的研究結(jié)果表明,達(dá)烏爾黃鼠在冬眠前通過增加攝食量來增加體重,并且在冬眠期間體重緩慢降低[28-29]。其活動行為、代謝率、體溫、攝食量、血清中甲狀腺激素和BAT中UCP 1表達(dá)亦產(chǎn)生年周期性變化[28]。本研究在之前研究的基礎(chǔ)上,采集不同時期的達(dá)烏爾黃鼠,分別檢測其體重、攝食量、肩胛骨褐色脂肪重量和褐色脂肪中UCP 1的表達(dá),探究達(dá)烏爾黃鼠年周期褐色脂肪變化,來闡明冬眠動物褐色脂肪年周期的適應(yīng)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本研究使用的達(dá)烏爾黃鼠于2015年5月和2016年5月在內(nèi)蒙古通遼市(122.16°E,43.37°N)捕獲。帶回至沈陽師范大學(xué)動物房,單籠飼養(yǎng),飼養(yǎng)籠大小為48 cm×35 cm×20 cm,用碎刨花做巢材,喂飼以充足的標(biāo)準(zhǔn)鼠糧(沈陽前民飼料廠)及飲水。育肥期動物房溫度為(23±2) ℃,光照∶黑暗=12∶12,冬眠期動物房溫度為(5±2) ℃,全黑。每周測量動物體重一次,以確定其增肥狀況。

1.2 動物分組(animal grouping)

動物體重的變化被用來估計育肥期間的3個不同階段。 包括: 1)起始育肥期(early-fattening, EF,n=8), 此時動物的體重開始增加; 2)快速育肥期(mid-fattening, MF,n=8), 動物體重較EF期顯著增加; 3)育肥完成期(post-fattening, PF,n=7), 即冬眠前動物體重下降時期。 PF期結(jié)束后立即將實驗動物轉(zhuǎn)移到全黑暗、環(huán)境溫度為(5±2) ℃的寒冷房間, 水食自取。 使用冬眠時間的長度來估計冬眠期間的3個不同階段, 包括: 1)冬眠早期(early-hibernating, EH,n=8), 動物進(jìn)入冬眠后1 m; 2)冬眠晚期(late-hibernating, LH,n=8), 動物進(jìn)入冬眠后4 m; 3)出眠期(arousal, AR,n=8), 動物結(jié)束冬眠后1 w。

1.3 體重、攝食量、BAT重量測定

采用電子天平(上表電子儀器廠,SB10001)測量達(dá)烏爾黃鼠體重,1 w 1次,連續(xù)測量,并記錄。以第1 d稱食物重量為A(g),喂食3 d后,回收食物,稱重為B(g)。每天攝食量(g)=(A-B)/3。采用電子天平測量達(dá)烏爾黃鼠BAT重量,并記錄。

1.4 UCP1表達(dá)檢測

具體步驟如下:

1) 蛋白樣品制備; 2)安裝設(shè)備,測漏,配制分離膠和濃縮膠; 3)蛋白Marker和待測樣品上樣; 4)電泳,58 mV下電泳上樣樣品,3～5 h; 5)轉(zhuǎn)膜,150 mA下轉(zhuǎn)膜,2 h; 6)封閉液孵育4 ℃,3 h; 7)一抗孵育,4 ℃,過夜; 8)回收一抗,1×TBST緩沖液清洗3次,每次5～10 min; 9)二抗孵育,室溫,2 h; 10)回收二抗,1×TBST緩沖液清洗,4次,每次5～10 min; 11)曝光,顯影; 12)灰度檢測分析,用Image-J軟件對所得條帶灰度測量分析,并記錄。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用SPSS 20.0系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,各時期體重、攝食量、BAT重量和解耦聯(lián)蛋白1(UCP 1)量,均用單因素方差分析(one-way analysis of variance)的方法來分析,用Excel繪制圖表,數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)形式表示。p<0.05表示差異顯著,p<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 黃鼠的體重變化

對黃鼠體重測量發(fā)現(xiàn),黃鼠體重(圖1)呈年周期變化模式,黃鼠在起始育肥期體重開始增加,達(dá)到體重最高峰時,約增長了70%的重量,平均每天增長(1.92±0.21) g,入眠前期體重下降,冬眠階段黃鼠體重緩慢降低,平均每天降低(0.74±0.05) g。

圖1 黃鼠年周期體重變化圖Fig.1 The annual change of body weight

2.2 不同時期黃鼠BAT重量

黃鼠BAT重量結(jié)果如圖2所示,EL組黃鼠BAT重量顯著高于其他組,為(2.40±0.17) g,AR組黃鼠BAT重量較LH組顯著下降。育肥期,黃鼠BAT重量緩慢增加。

圖2 不同時期BAT重量變化Fig.2 The weight of BAT at different stages

2.3 不同時期BAT中UCP 1表達(dá)

不同時期黃鼠BAT中UCP1表達(dá)結(jié)果如圖3所示,EF組黃鼠BAT中UCP 1表達(dá)為(0.844±0.07), MF組BAT中UCP 1表達(dá)為(0.960±0.07),PF組BAT中UCP 1表達(dá)為(1.169±0.18),EH組BAT中UCP 1表達(dá)為(1.151±0.07),LH組BAT中UCP 1表達(dá)為(1.18±0.09),AR組黃鼠BAT中UCP 1表達(dá)為(0.881±0.08),PF組、EH組、LH組黃鼠UCP 1表達(dá)顯著高于其他3個組。

3 討 論

在冬眠前儲存大量脂肪、增加體重對動物冬眠有很重要作用[30],本研究表明,達(dá)烏爾黃鼠體重呈年周期變化,繁殖期后開始育肥,體重在冬眠前下降,冬眠階段緩慢下降。Yan等[31]檢測金背黃鼠(SpemtophilusLaterali)冬眠階段體重的變化,在育肥階段成年雌性金背黃鼠體重平均每天增加(1.22±0.15) g,冬眠階段金背黃鼠平均每天降低(0.54±0.05) g,與本實驗結(jié)果一致,提示達(dá)烏爾黃鼠作為一種典型的貯脂型冬眠哺乳動物,冬眠前育肥,為冬眠時儲存能量,并在冬眠期間消耗脂肪。

BAT產(chǎn)熱在動物冬眠和冬眠覺醒中起著重要作用[32-33]。研究發(fā)現(xiàn),金黃黃鼠(Mesocvicetusauratus)在冬眠階段中消耗約255 mg BAT[34],蝙蝠(Eptesicusvulturnus)出眠后BAT重量顯著減少[35]。孫金生和曾縉祥[36]發(fā)現(xiàn)東北刺猬入眠前BAT重量顯著增加,出眠期BAT重量顯著下降。本研究發(fā)現(xiàn)達(dá)烏爾黃鼠在冬眠階段BAT重量顯著高于育肥階段,且出眠期黃鼠BAT重量顯著降低,結(jié)果提示黃鼠在冬眠前儲存大量BAT,出眠期消耗BAT,將體溫恢復(fù)到活動狀態(tài)水平,進(jìn)而覺醒。UCP 1是BAT產(chǎn)熱蛋白,主要通過消耗質(zhì)子梯度來產(chǎn)生熱量[37]。研究發(fā)現(xiàn),冷馴化下大絨鼠BAT中UCP 1表達(dá)顯著增加[38],冬眠期多紋黃鼠BAT中UCP 1顯著增加。本研究發(fā)現(xiàn)黃鼠在完成育肥期UCP 1已顯著增加,并在冬眠期保持高水平,出眠期顯著下降,推測在完成育肥期黃鼠增加UCP 1蛋白為冬眠做準(zhǔn)備,并在出眠期通過UCP 1產(chǎn)熱,進(jìn)而覺醒。本研究組之前發(fā)現(xiàn)黃鼠冬眠期UCP 1蛋白的mRNA表達(dá)增加[28],與本實驗結(jié)果相符。

綜上所述,達(dá)烏爾黃鼠體重呈年周期變化,在冬眠前進(jìn)行育肥,冬眠階段體重緩慢下降,冬眠期黃鼠增加BAT重量和UCP 1表達(dá)量來維持體溫,出眠期通過UCP 1產(chǎn)熱,進(jìn)行覺醒。