液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量

廣東省珠海市斗門區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所 孟軒 梁可昌

硝基呋喃類藥物是通過(guò)影響細(xì)菌體內(nèi)的氧化還原酶體系，干擾細(xì)菌正常代謝的一類廣譜抗生素，曾普遍應(yīng)用于水產(chǎn)、畜牧業(yè)養(yǎng)殖等行業(yè)中疾病的預(yù)防和治療。后續(xù)學(xué)者陸續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，該類藥物對(duì)對(duì)人體具有致畸胎作用，可能誘發(fā)癌癥等重大疾病。為此，2019 年12 月農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的第250 號(hào)公告中將其歸類為食品動(dòng)物中禁止使用的藥物。

硝基呋喃類常用的有4種：呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林。硝基呋喃類藥物進(jìn)入魚(yú)體后的代謝產(chǎn)物分別為：3-氨基-2-惡唑烷基酮（AOZ）、5-嗎啉甲基-3-氨基-2-惡唑烷基酮（AMOZ）、1-氨基-2-內(nèi)酰脲（AHD）、氨基脲（SEM），由于這些代謝產(chǎn)物與蛋白質(zhì)結(jié)合而相當(dāng)穩(wěn)定，所以目前主要通過(guò)檢測(cè)代謝物的殘留量，反映硝基呋喃類藥物的殘留狀況。

目前檢測(cè)獸藥殘留常見(jiàn)的方法主要有：高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法、液相色譜法、常規(guī)理化檢測(cè)法、酶聯(lián)免疫法、毛細(xì)管電泳法等。本研究基于《國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB31656.13-2021 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物多殘留的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室設(shè)備及當(dāng)?shù)貦z測(cè)需求，建立了準(zhǔn)確、高效、快速的硝基呋喃代謝殘留量檢測(cè)方法。

一、材料與方法

1.主要儀器和試劑。

（1）主要儀器。Agilent1290/G6470B 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)安捷倫公司）；KQ-500DE型臺(tái)式數(shù)控超聲波清洗器（東莞市科橋超聲波設(shè)備有限公司）；ZZDCH-16 水浴氮吹儀（廣州瑞森生物科技有限公司）；THZ 臺(tái)式恒溫振蕩器（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；3-18K 冷凍離心機(jī)（SIGMA）；SQP型號(hào)電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；IKAVORTEX3s025 渦旋器。

（2）材料與試劑。

①試驗(yàn)樣品：皖魚(yú)（直接采樣于魚(yú)塘）。

②試劑：甲醇（色譜純、德國(guó)默克）；乙酸乙酯（色譜純、德國(guó)默克）；5 摩爾/升乙酸銨（switzerland）；甲酸（賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司）；二甲基亞砜（分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；2-硝基苯甲醛（上海麥克林）；無(wú)水磷酸氫二鉀（分析純，福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司）；鹽酸（優(yōu)級(jí)純，上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司）；4 種硝基呋喃代謝物標(biāo)準(zhǔn)品（AMOZ、AOZ、AHD.HCL、SEM.HCL）以及4 種硝基呋喃代謝物同位素內(nèi)標(biāo)：AHD-13C3、AMOZ-D5；SEM.HCL-13C,15N2、、AOZ-D4 均 購(gòu) 于德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 公司。

2.儀器條件。

（1）色譜條件。流動(dòng)相A 為甲醇，流動(dòng)相B為5 毫摩爾/升乙酸銨+0.1%甲酸水溶液，色譜柱為InfinityLabPoroshell120EC-C18(3.0×100mm2.7-Micron），柱溫：40℃；流速：0.4 毫升/分鐘；進(jìn)樣量：5 微升，梯度洗脫程序見(jiàn)表1，后運(yùn)行平衡1.5 分鐘。

表1 液相色譜梯度洗脫程序

（2）質(zhì)譜條件。離子源：AJSESI；正離子模式，MRM 掃描模式；干燥氣溫度325℃，流速6 升/分鐘，鞘氣溫度370℃，流速11 升/分鐘，霧化器壓力為45psi，毛細(xì)管電壓為4000 伏。質(zhì)譜采集參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）質(zhì)譜采集參數(shù)

3.標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制。

（1）分別準(zhǔn)確稱取4 種標(biāo)準(zhǔn)品和4 種同位素內(nèi)標(biāo)適量，甲醇溶解并定容至10 毫升棕色容量瓶中，分別配制成濃度為1.0 毫克/毫升標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18℃避光保存。

（2）分別準(zhǔn)確量取濃度為1.0 毫克/毫升的4 種標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液和4 種同位素內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液適量，用甲醇逐級(jí)稀釋，分別配制成濃度為1.0 微克/毫升的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液和同位素混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間液。

（3）準(zhǔn)確量取混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，甲醇逐級(jí)稀釋，配制成濃度為100 納克/毫升和10 納克/毫升的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。準(zhǔn)確量取同位素混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間液，甲醇逐級(jí)稀釋，配制成濃度為100 納克/毫升混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液。

工作人員正在檢測(cè)水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量

4.樣品前處理。

（1）樣品水解與衍生化處理。準(zhǔn)確稱取搗碎后的水產(chǎn)品（皖魚(yú)）樣品2 克(精確到0.01 克)于50 毫升聚丙烯離心管中,加入50 微升濃度為100 納克/毫升混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液，渦旋混合1 分鐘，加0.2 摩爾/升鹽酸溶液5 毫升、渦旋1 分鐘，加入濃度為0.05摩爾/升的2-硝基苯甲醛溶液0.15 毫升。渦旋震蕩1 分鐘,置于恒溫振蕩器中，60℃避光震蕩2 小時(shí)。

（2）樣品提取與凈化。取出離心管冷卻至室溫，加入1.0 摩爾/升磷酸氫二鉀溶液4.0 毫升調(diào)PH 至7.0～7.5，旋渦震蕩1 分鐘，加入乙酸乙酯8 毫升,渦旋振蕩1 分鐘，10000 轉(zhuǎn)/分鐘冷凍離心5 分鐘，取上清液至15 毫升離心管，45℃氮?dú)獯蹈?，加?%甲醇溶液1 毫升溶解殘留物，以10000 轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心5 分鐘，取上清液過(guò)濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。

5.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。稱取6 個(gè)空白基質(zhì)樣本，分別加入50、100、200 微升濃度為10 納克/毫升的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液以及50、100、200 微升濃度為100納克/毫升的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，配制成濃度為0.50、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 納克/毫升的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，再完全按照樣品前處理過(guò)程步驟進(jìn)行操作，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析測(cè)定。

二、結(jié)果與分析

1.檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。按照上述基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度進(jìn)行線性回歸，得到線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表3。硝基呋喃代謝物AMOZ、AHD、AOZ、SEM 在濃度0.5～20.0 納克/毫升呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.995。

表3 方法線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)

2.加標(biāo)回收率及精密度。在空白魚(yú)肉中添加0.5 微克/千克、1.0 微克/千克、5.0 微克/千克三個(gè)不同濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行回收率試驗(yàn)，各濃度水平平行測(cè)定6 次，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在0.5,1.0,5.0微克/千克添加水平下，目標(biāo)分析物的加標(biāo)回收率 為82.0% ～103%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏 差（RSD） 為0.996%～4.46%（n＝6），結(jié)果見(jiàn)表4，其回收率和精密度水平均符合方法標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定。

AOZ 0.5 96 1.33 1.0 102 2.43 5.0 99.2 0.996 0.5 82 4.37 2.5 100 3.72 5.0 102 3.22 SEM

表4 加標(biāo)回收率及精密度

3.方法檢出限和方法定量限。本方法中AMOZ、AHD、AOZ、SEM 的檢測(cè)限均為0.5 微克/千克，當(dāng)添加濃度為0.5 微克/千克時(shí)，AMOZ、AHD、AOZ、SEM 的 信 噪 比 分 別 為226.12、187.73、2168.43、42.01，RS/N 均大于3。該方法的定量限均為1.0 微克/千克。當(dāng)添加濃度為1.0 微克/千克時(shí)，AMOZ、AHD、AOZ、SEM 的信噪比分別為2086.16、270.18、2023.20、80.57，RS/N 均大于10，檢出限和定量限均滿足標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)要求。

三、結(jié)論

硝基呋喃類藥物是一類廣譜抗生素，具有5-硝基本結(jié)構(gòu)，通過(guò)影響細(xì)菌體內(nèi)的氧化還原酶體系，干擾細(xì)菌正常代謝，本方法參照GB31656.13—2021，建立了檢測(cè)水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物的方法。本方法以乙酸乙酯為提取劑，酸性條件提升了衍生溫度，縮短衍生時(shí)長(zhǎng)，在3 個(gè)不同添加濃度水平自由度為6 的條件下平均回收率、精密度以及各測(cè)定組分在0.5～20.0 納克/毫升范圍內(nèi)線性關(guān)系均滿足檢測(cè)要求，在針對(duì)日常抽檢樣品的多種魚(yú)類進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估檢測(cè)篩查時(shí)，用該方法同時(shí)檢測(cè)質(zhì)控樣品，回收率達(dá)到分析要求，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。本方法快速簡(jiǎn)便、靈敏度高，適合于水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留檢測(cè)。