藻藍(lán)蛋白粗提工藝研究

盛晶夢(mèng), 張祥霖, 尹 程

(安徽水利水電職業(yè)技術(shù)學(xué)院,安徽 合肥 231603)

藍(lán)藻含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),其中藻藍(lán)蛋白具有顯著的資源化利用潛力。純度越高價(jià)值也越高,通常可分為食品級(jí)(純度≥0.7)、反應(yīng)級(jí)(純度≥3.9)和分析級(jí)(純度≥4.0)三類[1]。藻藍(lán)蛋白屬于胞內(nèi)蛋白質(zhì),藻細(xì)胞破碎后的溶液中除了藻藍(lán)蛋白外還含有大量其他的蛋白質(zhì)、多糖和脂質(zhì)等物質(zhì)[2],其提純通常包括細(xì)胞破碎、粗提和純化3個(gè)步驟,傳統(tǒng)的方法有超濾法、鹽析法、柱層析法等[3,4]。同時(shí),一些新型的提純方法如雙水相萃取法、利凡諾沉淀法、活性炭吸附法等也為藻藍(lán)蛋白的提純拓寬了思路。藻藍(lán)蛋白提純技術(shù)的關(guān)鍵是在兼顧純度和回收率的基礎(chǔ)上探索多種方法的組合使用,以實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)化操作、縮減成本和縮短周期等目的。利凡諾是一種有機(jī)陽(yáng)離子絮凝劑,在特定條件下通過(guò)控制其含量、pH等條件可以選擇性的沉淀某些蛋白質(zhì)[5]。而活性炭作為一種常見(jiàn)的吸附劑,在水處理中的使用也較多。2種方法所需要用到的儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、操作性強(qiáng)且成本可控。因此,本文選擇通過(guò)設(shè)置單因素及正交實(shí)驗(yàn),探究這2種粗提方法的最佳工藝條件,為簡(jiǎn)化藻藍(lán)蛋白提純操作、實(shí)現(xiàn)藍(lán)藻規(guī)?；幚砗透纳坪锤粻I(yíng)養(yǎng)化情況提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

藍(lán)藻:采用野外新鮮藍(lán)藻藻泥(取自巢湖水域),藻體用清水洗凈,然后密封放置于-4 ℃冰箱冷凍保存。

常用試劑:活性炭、HCl、NaOH、PBS緩沖液(濃度為0.002 5 mol/L)、利凡諾等。

1.2 分析方法

(1)藻藍(lán)蛋白純度(P)。用紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)定藍(lán)藻蛋白溶液吸光度(A)可發(fā)現(xiàn),藻藍(lán)蛋白在620 nm處有最大特征吸收峰,總蛋白則在280 nm處有最大吸收峰。由此可以參考Herrera等推薦的公式來(lái)計(jì)算藻藍(lán)蛋白純度。

(1)

其中,A280、A620分別為波長(zhǎng)280 nm、620 nm處的吸光度。

(2)藻藍(lán)蛋白回收率(Y)。先根據(jù)Soni等推薦的公式,計(jì)算出藻藍(lán)蛋白的質(zhì)量濃度(C),然后就可以得出藻藍(lán)蛋白的回收率。

C=(A620-0.7×A280)/7.38

(2)

Y=(CV/C0V0)×100%

(3)

其中,C為樣品中的藻藍(lán)蛋白質(zhì)量濃度;C0為粗提液中的藻藍(lán)蛋白質(zhì)量濃度;V為樣品溶液的體積;V0為粗提液的體積。

1.3 藍(lán)藻細(xì)胞破碎與初步處理

1.3.1 藍(lán)藻細(xì)胞破碎

先將-4 ℃冷凍保存的藍(lán)藻藻泥置于室溫(25 ℃)下融解,再置于-4 ℃環(huán)境下冷凍,重復(fù)2次,完成藍(lán)藻細(xì)胞凍融破壁操作。最后,用4層普通紗布濾去藻渣,即獲得藍(lán)藻細(xì)胞破壁液。

1.3.2 利凡諾與活性炭處理效果初步驗(yàn)證

將上一步所得藍(lán)藻細(xì)胞破壁液取40 ml分成2組,分別進(jìn)行如下操作,然后測(cè)量所得粗提液的吸光度,初步驗(yàn)證利凡諾與活性炭的處理效果:

第1組:向細(xì)胞破壁液中加入1 ml質(zhì)量濃度為4 g/L的利凡諾溶液,攪拌均勻,于4 ℃條件下靜置過(guò)夜,濾去沉淀后測(cè)量吸光度;然后,再加入1 g粉末活性炭,攪拌均勻,靜置5 min后濾去沉淀,取上清液測(cè)量吸光度。

第2組:向細(xì)胞破壁液中先加入1 g粉末活性炭,攪拌均勻,靜置5 min后濾去沉淀,取上清液測(cè)量吸光度;然后,再加入1 ml質(zhì)量濃度為4 g/L的利凡諾溶液,攪拌均勻,于4 ℃條件下靜置過(guò)夜,濾去沉淀后測(cè)量吸光度。

1.4 利凡諾處理單因素實(shí)驗(yàn)

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),分別考察不同利凡諾添加量和處理次數(shù)對(duì)于藻藍(lán)蛋白粗提效果的影響。

1.4.1 利凡諾添加量對(duì)藻藍(lán)蛋白提純效果的影響

取步驟1.3.1所得藍(lán)藻細(xì)胞破壁液120 ml,分成6組,向每組中分別加入質(zhì)量濃度為4 g/L的利凡諾溶液0.5 ml、1 ml、1.5 ml、2 ml、2.5 ml、3 ml,攪拌均勻,于4 ℃條件下靜置過(guò)夜,濾去沉淀后測(cè)量吸光度。

1.4.2 利凡諾處理次數(shù)對(duì)藻藍(lán)蛋白提純效果的影響

取步驟1.3.1所得藍(lán)藻細(xì)胞破壁液100 ml,分成5組,分別進(jìn)行如下操作:第1組向溶液中加入質(zhì)量濃度為4 g/L的利凡諾溶液2 ml(步驟1.4.1中得出),攪拌均勻,于4 ℃條件下靜置過(guò)夜,濾去沉淀后測(cè)量吸光度;第2組重復(fù)第1組的操作2次;后面各組以此類推…第5組重復(fù)第1組的操作5次。

1.5 活性炭處理單因素實(shí)驗(yàn)

取適量步驟1.3.1所得藍(lán)藻細(xì)胞破壁液,按照步驟1.4所得利凡諾沉淀?xiàng)l件4 g/L的利凡諾溶液2 ml,處理2次)處理之后,通過(guò)活性炭單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),分別考察不同粉末活性炭粒徑、添加量對(duì)于藻藍(lán)蛋白粗提效果的影響。

1.5.1 活性炭粒徑對(duì)藻藍(lán)蛋白提純效果的影響

取上一步驟所得藻藍(lán)蛋白粗提液100 ml,分成5組,向每組中分別加入粒徑為Ⅰ(150 μm～75 μm),Ⅱ(75 μm～50 μm),Ⅲ(50 μm～38 μm),Ⅳ(38 μm～31 μm),Ⅴ(<31 μm)的粉末活性炭1.2 g,攪拌均勻,靜置5 min后濾去沉淀測(cè)量吸光度。

1.5.2 活性炭添加量對(duì)藻藍(lán)蛋白提純效果的影響

取藻藍(lán)蛋白粗提液120 ml,分成6組,向每組中分別加入粒徑為75 μm～50 μm(步驟1.5.1中得出)的粉末活性炭,0.4 g、0.8 g、1.2 g、1.6 g、2.0 g、2.4 g,攪拌均勻,靜置5 min后濾去沉淀測(cè)量吸光度。

1.6 藻藍(lán)蛋白粗提處理正交實(shí)驗(yàn)

取步驟1.3.1制備的藍(lán)藻細(xì)胞破壁液適量,根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取利凡諾添加量、利凡諾處理次數(shù)和活性炭添加量3個(gè)因素設(shè)計(jì)L9(34)的正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究,確定最佳粗提工藝參數(shù)。實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)置如表1所列。

表1 藻藍(lán)蛋白粗提處理正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

2 結(jié)果與討論

2.1 藍(lán)藻細(xì)胞破碎與初步處理

如圖1所示,根據(jù)第一步操作結(jié)果可知,利凡諾和活性炭對(duì)于去除藍(lán)藻細(xì)胞破壁液中的雜質(zhì)、提升藻藍(lán)蛋白純度均有一定的效果,且粉末活性炭處理效果好于利凡諾。這可能是由于利凡諾作為絮凝劑,可以絮凝破壁液中的雜蛋白,降低總蛋白含量的同時(shí)使得藻藍(lán)蛋白的比重增加;同時(shí),活性炭的多孔結(jié)構(gòu)對(duì)破壁液中的小分子有機(jī)物、雜質(zhì)蛋白等都具有較好的吸附效果,而對(duì)于大分子的藻藍(lán)蛋白則表現(xiàn)出一定的選擇性,使得藻藍(lán)蛋白的純度大幅提升。根據(jù)第二步操作結(jié)果可知,利凡諾和粉末活性炭共同處理藍(lán)藻細(xì)胞破壁液,藻藍(lán)蛋白純度可以進(jìn)一步提升,而利凡諾沉淀處理與活性炭吸附處理操作的順序先后對(duì)于最終提純效果影響不大,考慮到利凡諾可以通過(guò)活性炭吸附去除,減少雜質(zhì)的引入,所以選擇先用利凡諾沉淀,然后用粉末活性炭吸附處理藍(lán)藻細(xì)胞破壁液。

圖1 利凡諾和活性炭對(duì)藻藍(lán)蛋白提純效果

2.2 利凡諾處理單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 利凡諾添加量對(duì)藻藍(lán)蛋白提純效果的影響

如圖2所示,利凡諾添加量對(duì)于藻藍(lán)蛋白提純效果的影響表現(xiàn)為,隨著利凡諾添加量的增加,藻藍(lán)蛋白的純度總體呈上升趨勢(shì),而回收率則呈下降趨勢(shì)。藻藍(lán)蛋白的純度在利凡諾添加量為0.5 ml～2.5 ml時(shí)明顯增加,2.5 ml時(shí)達(dá)到峰值,2.5 ml～3 ml時(shí)開(kāi)始有所下降。而藻藍(lán)蛋白的回收率則在利凡諾添加量為0.5 ml～2 ml時(shí)緩慢下降,2 ml～3 ml時(shí)下降趨勢(shì)明顯變快。綜合藻藍(lán)蛋白的純度和回收率兩個(gè)因素,確定質(zhì)量濃度為4 g/L的利凡諾溶液添加量為2 ml。

圖2 利凡諾添加量對(duì)藻藍(lán)蛋白提純效果的影響

2.2.2 利凡諾處理次數(shù)對(duì)藻藍(lán)蛋白提純效果的影響

利凡諾處理次數(shù)對(duì)于藻藍(lán)蛋白提純效果的影響如圖3所示,隨著利凡諾沉淀操作次數(shù)的增加,總體上藻藍(lán)蛋白的純度呈緩慢上升的趨勢(shì),而回收率則緩慢下降。利凡諾沉淀次數(shù)在3次以內(nèi)時(shí),藻藍(lán)蛋白的純度增加趨勢(shì)明顯,而在第4次和第5次操作后,純度增加不明顯且有所下降。利凡諾沉淀次數(shù)在4次以內(nèi)時(shí),藻藍(lán)蛋白的回收率下降趨勢(shì)明顯,之后則下降變緩。這可能是由于隨著處理次數(shù)的增加,利凡諾在絮凝雜蛋白、提升藻藍(lán)蛋白純度的同時(shí),也絮凝了部分藻藍(lán)蛋白,使得總蛋白減少的同時(shí)藻藍(lán)蛋白也有所減少?？紤]到需要降低粗提操作的復(fù)雜性,并兼顧藻藍(lán)蛋白回收率以保障后續(xù)提純的效果,確定利凡諾處理次數(shù)為2次。

圖3 利凡諾處理次數(shù)對(duì)藻藍(lán)蛋白提純效果的影響

2.3 活性炭處理單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 活性炭粒徑對(duì)藻藍(lán)蛋白提純效果的影響

活性炭粒徑對(duì)于藻藍(lán)蛋白提純效果的影響,如圖4所示,隨著活性炭粒徑的減小,藻藍(lán)蛋白的純度明顯增加,回收率下降趨勢(shì)則明顯變陡?？紤]到保障藻藍(lán)蛋白回收率以滿足后續(xù)提純操作要求,確定活性炭粒徑為75 μm～50 μm。

圖4 活性炭粒徑對(duì)藻藍(lán)蛋白提純效果的影響

2.3.2 活性炭添加量對(duì)藻藍(lán)蛋白提純效果的影響

活性炭添加量對(duì)于藻藍(lán)蛋白提純效果的影響,如圖5所示,隨著粉末活性炭添加量的增加,藻藍(lán)蛋白純度總體呈先增加后降低的趨勢(shì),而回收率則先緩慢降低然后迅速減少。在粉末活性炭添加量為0.4 g～1.2 g時(shí),藻藍(lán)蛋白純度快速升高;1.2 g～20 g時(shí),純度增速變緩;2.0 g～2.4 g時(shí),純度開(kāi)始降低。藻藍(lán)蛋白的回收率在粉末活性炭添加量為0.4 g～1.2 g時(shí)緩慢降低,在1.2 g～2.4 g時(shí)迅速減少。這可能是由于,隨著添加量的增加,活性炭吸附的小分子雜質(zhì)逐漸增多,藻藍(lán)蛋白大幅提升;同時(shí),其孔隙中中孔和大孔的比重也在增大,對(duì)藻藍(lán)蛋白的不可逆吸附逐漸增強(qiáng),所以藻藍(lán)蛋白的損失量也逐漸增多。綜合藻藍(lán)蛋白的純度和回收率兩個(gè)因素,確定粉末活性炭添加量為1.6 g。

圖5 活性炭添加量對(duì)藻藍(lán)蛋白提純效果的影響

2.4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取利凡諾添加量、利凡諾處理次數(shù)和活性炭添加量3個(gè)因素設(shè)計(jì)L9(34)的正交實(shí)驗(yàn),對(duì)結(jié)果用SPSS平臺(tái)進(jìn)行直觀分析和方差分析,確定利凡諾與活性炭粗提藍(lán)藻破壁液的最佳工藝條件。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2～4所列。

表2 藻藍(lán)蛋白粗提處理正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表3、表4的藍(lán)藻破壁液粗提處理極差分析結(jié)果可知:

表3 藻藍(lán)蛋白粗提處理純度極差分析

表4 藻藍(lán)蛋白粗提處理回收率極差分析

由于兩個(gè)指標(biāo)的最佳水平組合有所區(qū)別,所以需要對(duì)試驗(yàn)結(jié)果綜合分析。對(duì)于粗提操作來(lái)說(shuō),無(wú)論是利凡諾處理還是活性炭處理,隨著處理次數(shù)或試劑添加量的增加,藻藍(lán)蛋白的純度只能在一定程度內(nèi)有所提高,回收率則會(huì)持續(xù)下降。粗提操作的目標(biāo)主要是初步去除雜質(zhì),為后續(xù)的提純操作打好基礎(chǔ),所以在追求提高純度的同時(shí)更應(yīng)注重藻藍(lán)蛋白的回收率,避免藻藍(lán)蛋白的總體產(chǎn)量不高。同時(shí),粗提操作的次數(shù)、藥劑添加的量也應(yīng)優(yōu)選更少的工藝。所以,本實(shí)驗(yàn)最終選定以藻藍(lán)蛋白的回收率為優(yōu)先考慮指標(biāo),在簡(jiǎn)化操作、縮短周期、降低成本的考慮下,確定最優(yōu)工藝參數(shù)為:利凡諾添加量2 ml,處理次數(shù)為2次,活性炭添加量為1.2 g。

在上述藍(lán)藻破壁液粗提操作最優(yōu)工藝條件(利凡諾添加量為2 ml,處理次數(shù)為2次;活性炭粒徑為75 μm～50 μm,添加量為1.2 g)下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),結(jié)果表明:粗提處理后,藻藍(lán)蛋白的純度提升至1.67,回收率是61%。

3 結(jié) 論

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,利凡諾和活性炭對(duì)于藻藍(lán)蛋白的提純均有一定效果。且對(duì)單因素和正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析可以得出,藍(lán)藻破壁液粗提操作的最優(yōu)工藝條件是利凡諾添加量為2 ml,處理次數(shù)為2次;活性炭粒徑75 μm～50 μm,添加量為1.2 g。相比鹽析、雙水相、柱層析等提純方法,本研究工藝所需設(shè)備簡(jiǎn)單、試劑較少、操作性強(qiáng),易于規(guī)?；瘮U(kuò)大,這為治理水體富營(yíng)養(yǎng)化、進(jìn)行藍(lán)藻規(guī)模化處理開(kāi)闊了思路。