基于16S rRNA基因測序探討加味交泰丸對腹瀉型腸易激綜合征患者腸道菌群的影響

許琰杰,沈 文,臧海洋,徐 逸,劉麗娜,楊 芳

(南京中醫(yī)藥大學(xué)南通附屬醫(yī)院脾胃病科,江蘇 南通 226000)

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome,IBS)是由于中樞神經(jīng)功能以及自主神經(jīng)功能紊亂而引起腸道的運(yùn)動和分泌功能失調(diào)的一種疾病,以慢性、反復(fù)發(fā)作的腹部不適和疼痛為特征[1],病情反復(fù)遷延不愈,還可出現(xiàn)睡眠障礙、精神抑郁或煩躁性慢性疲勞綜合征等胃腸道外癥狀。近年來,IBS全球發(fā)病率逐年上升,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。腹瀉型腸易激綜合征(diarrhea-predominant IBS, IBS-D)作為IBS的常見類型[2],其發(fā)病率高且好發(fā)于中青年。因此,有必要尋找高效安全的治療方法。IBS的具體原因還未明確,目前已有文獻(xiàn)報道該病與腸道菌群具有相關(guān)性,腸道微生態(tài)失衡在IBS發(fā)病機(jī)制中起到關(guān)鍵作用[3]。內(nèi)臟高敏感被認(rèn)為是IBS-D的重要體現(xiàn)[4],也可能是腦—腸軸功能異常的表現(xiàn)[5]。因而,IBS-D易出現(xiàn)抑郁、煩躁等情緒障礙,即中醫(yī)理論的“心腎不交”。

交泰丸源自明代《韓氏醫(yī)通》,由黃連、肉桂組成,是治療“心腎不交”的經(jīng)典方劑。交泰丸及其加味方主要用于失眠、心律失常及遺精等自主神經(jīng)功能失調(diào)疾病,對IBS亦有較好的治療效果。研究[6]顯示,加味交泰丸能夠改善IBS-D患者的臨床癥狀,降低血清白細(xì)胞介素(interleukin, IL)-6,IL-8、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α, TNF-α)水平且安全性較高。但對加味交泰丸治療IBS-D的機(jī)制研究尚少,尤其對腸道菌群的影響尚未有報道。因此,本研究擬基于16S rRNA基因高通量測序技術(shù),探究加味交泰丸對IBS-D患者腸道菌群的影響。

1 臨床資料

1.1 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.1.1 IBS診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照羅馬Ⅳ診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。在過去的3個月中,平均每周至少1 d反復(fù)出現(xiàn)腹痛,診斷前癥狀出現(xiàn)至少6個月,近3個月符合以下兩項或多項標(biāo)準(zhǔn):①與排便有關(guān);②與大便頻率的變化有關(guān);③與糞便形式(外觀)的變化有關(guān)。

1.1.2 情緒障礙診斷標(biāo)準(zhǔn) 焦慮的評估采用焦慮自測量表(self-rating anxiety scale, SAS),SAS含有20個反映焦慮主觀感受的項目,每個項目按癥狀出現(xiàn)的頻度分為4級評分,其中15個為正向評分,5個為反向評分。50～59分為輕度焦慮,60～69分為中度焦慮,69分以上為重度焦慮。抑郁的評估采用抑郁自測量表(self-rating depression scale,SDS),SDS含有20個反映抑郁主觀感受的項目,每個項目按癥狀出現(xiàn)的頻度分為4級評分,其中10個為正向評分,10個為反向評分。63～72分為中度抑郁,72分以上為重度抑郁。

1.1.3 中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) IBS-D的中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中醫(yī)內(nèi)科學(xué)》[8]以及《腸易激綜合征中醫(yī)診療專家共識意見(2017)》[9]中IBS-D的辨證分型,證型為心腎失交兼肝郁脾虛證,由兩位副主任醫(yī)師對證候進(jìn)行辨證,以保證其統(tǒng)一性和權(quán)威性。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) ①年齡為18～65周歲;②符合IBS-D的西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn),且中醫(yī)辨證屬于心腎失交兼肝郁脾虛證;③未合并嚴(yán)重心腦血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、神經(jīng)精神系統(tǒng)等疾病或腫瘤;④患者知情同意并簽署知情同意書。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) ①已知對試驗所用藥物過敏或有不良反應(yīng)的患者;②有精神疾病史,不能完全配合完成該臨床試驗的患者;③有高血壓病、糖尿病、甲狀腺功能亢進(jìn)或甲狀腺功能減退、消化道器質(zhì)性病變的患者;④近3個月內(nèi)服用過影響胃腸功能的藥物。

1.4 一般資料 選取2020年10月至2021年10月南通市中醫(yī)院門診部招募的IBS-D合并情緒障礙(抑郁或焦慮)患者60例作為研究對象,經(jīng)中醫(yī)辨證均為心腎失交兼肝郁脾虛證。按照隨機(jī)數(shù)字表法將其隨機(jī)分為中藥組與西藥組,每組30例。西藥組男16例,女14例,年齡18～65歲,平均年齡(42.77±12.44)歲;中藥組男13例,女17例,年齡18～65歲,平均年齡(38.70±12.74)歲。兩組患者的一般資料比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。另外選擇在南通市中醫(yī)院接受體檢的健康者共10例作為健康對照組,男5例,女5例,年齡18～65歲,平均年齡(40.40±2.70)歲。本研究經(jīng)南通市中醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),倫理批號: 通中院〔2020〕字006。

2 方法

2.1 干預(yù)方法 中藥組采用加味交泰丸治療。藥物組成:炒白芍、炒山藥各20 g,茯苓15 g,白術(shù)、陳皮、防風(fēng)、五味子各10 g,炒柴胡、木香各6 g,肉豆蔻、炮姜、炙甘草各5 g,黃連、肉桂各3 g。中藥劑型選用顆粒劑,由南通市中醫(yī)院中藥房提供,每日1劑,早晚分服150 mL,共治療4周。

西藥組患者服用地衣芽孢桿菌活菌膠囊(規(guī)格:每粒0.25 g;東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司生產(chǎn),國藥準(zhǔn)字號S10950019),每日3次,每次2粒,共治療4周。

2.2 觀察指標(biāo)及方法

2.2.1 16S rRNA基因測序技術(shù)檢測腸道菌群 依照標(biāo)準(zhǔn)糞便采樣流程,嚴(yán)格遵循無菌化操作原則,收集3組受檢者糞便樣本于無菌管中。使用PowerSoil DNA分離試劑盒按照說明書對糞便樣本進(jìn)行DNA提取。采用0.8%的瓊脂糖凝膠檢查基因組DNA的純度和質(zhì)量。采用引物338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因V3-V4高變區(qū)。對每個樣品,正向引物和反向引物的5′端分別添加10位條形碼序列。PCR使用5 μL DNA(總模板量為30 ng)在Mastercycler Gradient上進(jìn)行。擴(kuò)增條件為95 °C變性、55 °C退火、72 °C延伸各45 s。測序平臺系統(tǒng)為Illumina 2.6系統(tǒng)。序列分析利用微生物生態(tài)學(xué)定量研究技術(shù)對原始序列進(jìn)行修飾,通過歸類操作,將序列按照彼此的相似性分歸一個操作分類單元(operational taxonomic units, OTUs)?？筛鶕?jù)相似度水平,對所有序列進(jìn)行OTUs劃分,通常對97%相似水平下的OTUs進(jìn)行生物信息學(xué)的統(tǒng)計分析。根據(jù)OTUs聚類結(jié)果,使用Mothur進(jìn)行分析,使用R語言工具制作稀疏曲線。

2.2.2 臨床療效 分別于治療前及治療4周后采用IBS嚴(yán)重程度評分系統(tǒng)(irritable bowel syndrome-severity scoring system, IBS-SSS)評估兩組患者臨床療效,該評分系統(tǒng)從腹痛程度、腹痛頻率、腹脹情況、排便滿意度及生活困擾度5個方面進(jìn)行評分,評分越高表明患者癥狀越嚴(yán)重。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 利用QIIME v.1.8.0進(jìn)行微生物α多樣性分析,為了估計β多樣性,采用R包進(jìn)行偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis, PLS-DA),組間差異使用Anosim分析。不同分類學(xué)水平的菌群差異使用Wilcoxon檢驗。采用LEfSe(LDA Effect Size)分析進(jìn)行多個分組之間的比較:采用單因素方差分析檢測不同分組間豐度差異顯著(P<0.05)的物種,再用線性判別分析(linear discriminant analysis, LDA)對數(shù)據(jù)進(jìn)行評估,選取LDA評分>3的物種。

3 結(jié)果

3.1 兩組患者治療前后IBS-SSS評分比較 兩組患者治療前IBS-SSS評分比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);治療4周后,兩組患者IBS-SSS評分均較治療前顯著下降(P<0.05),且中藥組評分降低程度更顯著(P<0.05)。見表1。

3.2 測序數(shù)據(jù) 在97%相似度條件下,對序列進(jìn)行操作單元聚類,獲得OTUs代表序列1 022個。稀釋曲線結(jié)果顯示,當(dāng)測序的序列數(shù)達(dá)到20 000條時,曲線趨于平緩,提示數(shù)據(jù)量飽和,測序深度足以覆蓋物種中的OTUs。見圖1。OTUs數(shù)據(jù)的韋恩圖顯示,5組樣本的“核心OTUs”為224種,Normal組特有OTUs為137種,Pre_BL組特有OTUs 76種,Pro_BL組特有OTUs 11種, Pre_JWJT組特有OTUs 33種, Pro_JWJT組特有OTUs 29種。見圖2。

表1 兩組患者治療前后IBS-SSS評分比較

圖1 測序數(shù)據(jù)稀釋曲線

注:Normal為健康對照;Pre_BL為地衣芽孢桿菌治療前;Pro_BL為地衣芽孢桿菌治療后;Pre_JWJT為加味交泰丸治療前;Pro_JWJT為加味交泰丸治療后

3.3 菌群多樣性分析 采用α和β多樣性分析評價菌群的整體結(jié)構(gòu)。α多樣性的Chao1指數(shù)評估表明,健康對照組的α多樣性均顯著高于其他4組(P<0.05),地衣芽孢桿菌治療后α多樣性有升高的趨勢,而加味交泰丸治療對α多樣性無明顯影響。β多樣性分析中,PLS-DA顯示健康對照組的菌群分布與其他4組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),但地衣芽孢桿菌及加味交泰丸治療沒有顯著改變菌群的β多樣性。見圖3、圖4。

注:Normal為健康對照;Pre_BL為地衣芽孢桿菌治療前;Pro_BL為地衣芽孢桿菌治療后;Pre_JWJT為加味交泰丸組治療前;Pro_JWJT為加味交泰丸組治療后

注:Normal為健康對照;Pre_BL為地衣芽孢桿菌治療前;Pro_BL為地衣芽孢桿菌治療后;Pre_JWJT為加味交泰丸治療前;Pro_JWJT為加味交泰丸治療后

3.4 菌群相對豐度 在門水平上,健康對照組主要由Firmicutes(厚壁菌門)、Actinobacteria(放線菌門)和Bacteroidetes(擬桿菌門)組成,而其他4組主要由厚壁菌門、Proteobacteria(變形菌門)、放線菌門組成,且加味交泰丸及地衣芽孢桿菌治療前后主要菌門未發(fā)生顯著變化。見圖5。在屬水平上,加味交泰丸治療顯著增加了優(yōu)勢菌Eubacterium_eligens_group、Flavonifractor及Lachnospira的相對豐度,降低了優(yōu)勢菌Eysipelotrichaceae_UCG-007、Scardovia及Senegalimassilia的相對豐度;地衣芽孢桿菌治療顯著增加了優(yōu)勢菌Peptoclostridium的相對豐度,降低了優(yōu)勢菌Collinsella、Lactococcus及Streptococcus的相對豐度。見圖6、圖7。

注:Normal為健康對照;Pre_BL為地衣芽孢桿菌治療前;Pro_BL為地衣芽孢桿菌治療后;Pre_JWJT為加味交泰丸治療前;Pro_JWJT為加味交泰丸治療后

注:Pre_JWJT為加味交泰丸治療前;Pro_JWJT為加味交泰丸治療后

3.5 LEfSe(LDA Effect Size)分析 在各分類學(xué)水平通過LEfSe分析后進(jìn)行5組之間的比較,選取P<0.05且LDA 評分>3的物種,按照門、綱、目、科、屬5個層級進(jìn)化分支樹繪圖,見圖8。圖中所示,健康對照組富集的菌群主要?dú)w類于擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria);地衣芽孢桿菌治療前富集的菌群主要?dú)w類于桿菌綱(Bacilli);地衣芽孢桿菌治療后富集的菌群主要?dú)w類于變形菌門(Proteobacteria);加味交泰丸治療前富集的菌群主要?dú)w類于毛螺菌科(Lachnospiraceae);加味交泰丸治療前后富集的菌群主要?dú)w類于梭桿菌門(Fusobacteria)。結(jié)果表明,加味交泰丸及地衣芽孢桿菌治療均顯著改變了腸道菌群的結(jié)構(gòu),但兩者改變的菌群不同,同時治療后的菌群也與健康對照組有所差異。

注:Pre_BL為地衣芽孢桿菌治療前;Pro_BL為地衣芽孢桿菌治療后

4 討論

IBS-D是消化內(nèi)科的常見病及多發(fā)病,近年來發(fā)病率逐年上升。目前,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療IBS-D主要以緩解癥狀為目的,但存在不良反應(yīng)多、遠(yuǎn)期療效差等弊端,導(dǎo)致患者在長期緩解疼痛或不適的治療中獲益較少,治療效果不理想。因此,急需尋找補(bǔ)充或替代藥物[10]。而中醫(yī)藥治療IBS-D具有相對優(yōu)勢,并取得良好的療效[11-12]。

中醫(yī)學(xué)中并無IBS-D的病名,根據(jù)相關(guān)臨床癥狀及特點(diǎn),可將其歸屬于中醫(yī)“泄瀉”“腹痛”“郁證”范疇,其病因有感受外邪、飲食所傷、情志失調(diào)及臟腑虛弱等,脾胃功能障礙是本病發(fā)生的關(guān)鍵。脾虛濕勝是導(dǎo)致本病發(fā)生的重要因素。外因與濕邪關(guān)系較大,濕邪侵入,損傷脾胃,運(yùn)化失常。內(nèi)因則與脾虛關(guān)系最為密切,脾虛失運(yùn),水谷不化精微,濕濁內(nèi)生,混雜而下,發(fā)為本病。近年來,有學(xué)者認(rèn)為IBS外在表象為肝郁脾虛,其內(nèi)在本質(zhì)實為心腎不交,以心腎不交論來指導(dǎo)治療IBS,可進(jìn)一步豐富臨床治療的思路和方法[13]。

注:Normal為健康對照;Pre_BL為地衣芽孢桿菌治療前;Pro_BL為地衣芽孢桿菌治療后;Pre_JWJT為加味交泰丸治療前;Pro_JWJT為加味交泰丸治療后

交泰丸及其加味方是治療心腎不交的經(jīng)典方劑,主治胸中痞悶嘈雜。大便稀則胸中暢快,大便堅則痞悶難當(dāng),不思飲食,出現(xiàn)心火偏亢、心腎不交,表現(xiàn)為怔忡、失眠等癥。心火亢盛、腎陽不足可導(dǎo)致心腎不交。欲使心腎相交,則必須既清心瀉火以使心火下降,又當(dāng)扶助腎陽以鼓舞腎水上承。只有水火相濟(jì),才能心腎相交。加味交泰丸作為交泰丸和痛瀉要方的綜合藥方,具有全面綜合的治療效果,能改善患者生活質(zhì)量,降低IBS-D嚴(yán)重程度。方中黃連、肉桂使心腎相交,黃連清心瀉火以制偏亢之心陽,肉桂溫補(bǔ)下元以扶不足之腎陽;心火不熾則心陽自能下降,腎陽得扶則腎水上承自有動力。本研究結(jié)果顯示,治療后中藥組IBS癥狀嚴(yán)重程度較西藥組顯著改善,說明加味交泰丸可以通過“心腎相交”明顯緩解IBS-D患者的臨床癥狀。

IBS-D是由多種病理生理機(jī)制引起的,主要包括遺傳和心理因素、胃腸動力異常、內(nèi)臟感覺異常、飲食習(xí)慣、腸道菌群等因素[14-15]。目前已有較多研究[16]表明,本病與腸道菌群密切相關(guān),腸道菌群的變化可能導(dǎo)致腸道通透性增加,誘發(fā)內(nèi)臟過敏,激活免疫反應(yīng),進(jìn)而引起胃腸道功能紊亂。近年來,高通量測序已廣泛應(yīng)用于IBS的腸道菌群研究。研究[17]顯示,IBS患者的腸黏膜和糞便菌群的多樣性均減少。而且隨著病情的發(fā)展,IBS-D變得更加復(fù)雜。在IBS-D患者腸道微生態(tài)失調(diào)的情況下,臨床治療應(yīng)重視對腸道菌群的調(diào)整,以提高治療效果,促進(jìn)患者康復(fù)[18]。

本研究中,與健康對照組比較,IBS-D患者腸道中擬桿菌門及放線菌門的豐度顯著降低,而變形菌門的豐度顯著增加,這與之前的報道結(jié)果一致[19-20]。但在中藥及西藥治療后,α多樣性及主要的菌門豐度無顯著改變,這可能與研究人群的長病程及實驗觀察的時間有關(guān)。本研究的研究對象都是成年人,菌群結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定,而且IBS-D的平均病程較長,而實驗觀察的時間僅為28 d,考慮短期的干預(yù)很難徹底改變腸道菌群的總體結(jié)構(gòu)。但在菌屬的水平上,中藥及西藥治療均在一定程度上改變了菌群的構(gòu)成。

中藥組Eubacterium_eligens_group、Flavonifractor及Lachnospira的相對豐度顯著增加,Eubacterium_eligens_group及Flavonifractor與IBS-D的相關(guān)性報道較少。目前研究發(fā)現(xiàn),Eubacterium_eligens_group豐度的增加與壓力應(yīng)激下的心理健康相關(guān)并具有抗炎作用[21],而Flavonifractor的較低豐度與情感障礙相關(guān)[22]。Lachnospira作為一種產(chǎn)生丁酸鹽的梭菌簇XIVa物種,對IBS-D發(fā)揮保護(hù)性作用。對于在加味交泰丸治療后相對豐度顯著減少的Eysipelotrichaceae_UCG-007、Scardovia及Senegalimassilia,其中Eysipelotrichaceae與免疫介導(dǎo)的炎癥性腸病密切相關(guān)[23],尚未報道Scardovia及Senegalimassilia在炎癥性疾病中的作用。這些結(jié)果表明,加味交泰丸可以通過改變IBS-D患者的腸道菌群發(fā)揮治療作用,并且這種作用可能與抗壓力應(yīng)激、抗炎癥反應(yīng)等相關(guān)。西藥組Peptoclostridium的豐度顯著增加,優(yōu)勢菌Collinsella、Lactococcus及Streptococcus的相對豐度降低,其中Collinsella與全身性炎癥相關(guān)[24],而Streptococcus也與感染及炎癥反應(yīng)相關(guān)[25]。地衣芽孢桿菌治療同樣可以改變IBS-D患者的腸道菌群,并且腸道菌群的改變與炎癥反應(yīng)相關(guān)。

總的來說,加味交泰丸雖然對IBS-D患者腸道菌群多樣性無顯著影響,但其可以改變腸道菌群的結(jié)構(gòu)和組成,與西藥地衣芽孢桿菌的作用有所不同。另外,加味交泰丸治療無法逆轉(zhuǎn)IBS-D引起的腸道菌群的失調(diào)。本研究為加味交泰丸在臨床的應(yīng)用提供參考價值,但關(guān)于加味交泰丸的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。