IL-22對(duì)酒精性肝纖維化小鼠回腸緊密連接蛋白及Nrf2/HO-1抗氧化通路的影響

閆虹佑 許曉娟 衛(wèi)彥芳 劉杏 霍俊燕 李軻 許翠萍

酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)是長期飲酒引起的慢性肝損害,其病理變化包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纖維化(alcoholic liver fibrosis,ALF)、肝硬化和原發(fā)性肝癌[1]。其中,ALF是指長期飲酒所致的肝內(nèi)纖維結(jié)締組織異常沉積的慢性病理過程,該過程在早期是可逆的[2]。長期飲酒可致腸屏障功能破壞,腸黏膜通透性增加,腸道細(xì)菌及代謝產(chǎn)物經(jīng)門靜脈進(jìn)入肝臟,加重肝臟炎癥和纖維化等病變[3]。腸黏膜上皮細(xì)胞的緊密連接蛋白是腸黏膜屏障的重要結(jié)構(gòu),腸道緊密連接蛋白破壞可致腸屏障功能減弱[4,5]。腸道緊密連接蛋白的破壞與氧化應(yīng)激有關(guān),Nrf2/HO-1通路是機(jī)體重要的抗氧化應(yīng)激通路之一[6,7]。IL-22是一種重要的肝臟保護(hù)因子[8],是由免疫細(xì)胞產(chǎn)生的IL-10家族的細(xì)胞因子,IL-22通過與IL-22受體1(IL-22 receptor 1,IL-22R1)和 IL-10受體2(IL-10 receptor 2,IL-10R2)組成的異源二聚體受體結(jié)合發(fā)揮作用。IL-10R2可表達(dá)于多種細(xì)胞,而IL-22R1僅表達(dá)于非造血細(xì)胞,比如消化道上皮細(xì)胞和皮膚的上皮細(xì)胞中[9]。在肝細(xì)胞中IL-22與其受體結(jié)合發(fā)揮抗肝細(xì)胞脂肪變性、抗凋亡功能和促進(jìn)肝祖細(xì)胞增殖及肝臟修復(fù)等功能[10]。研究發(fā)現(xiàn),IL-22過表達(dá)可誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞衰老,從而減輕肝纖維化[11]。此外,IL-22對(duì)腸黏膜上皮細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)和修復(fù)發(fā)揮著重要作用[12]。本研究探討IL-22對(duì)ALF小鼠的保護(hù)作用。

資料與方法

一、主要材料

(一)動(dòng)物 健康SPF級(jí)C57BL/6J小鼠60只,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供,6～8周齡,體重為(25±5)g,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2021-006,飼養(yǎng)于山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。飼養(yǎng)溫度為22～26 ℃,相對(duì)濕度為40%～70%,每籠5只,適應(yīng)飼養(yǎng)1周。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(K-K0154)

(二) 藥物與試劑 Lieber-DeCarli對(duì)照液體飼料和酒精液體飼料(南通特洛菲飼料有限公司);重組小鼠IL-22蛋白(艾博抗貿(mào)易有限公司);Nrf2抑制劑ML385(MCE公司);兔抗Nrf2多克隆抗體(proteintech公司);Occludin抗體試劑盒(山西鯤鵬同創(chuàng)科技有限公司);鼠抗ZO-1和NQO1單克隆抗體(proteintech公司);鼠抗HO-1單克隆抗體(Santa Cruz公司);抗鼠/兔通用型免疫組化檢測(cè)試劑盒(購于博士德生物);橄欖油(麥克林);二甲苯、乙醇等購于山西博科聯(lián)創(chuàng)生物科技有限公司。

(三)儀器 石蠟切片機(jī)(德國Leica公司);TKY-TKB攤片烤片機(jī)(湖北泰康公司);科研及病理玻片掃描分析系統(tǒng),3D HISTECH;通風(fēng)櫥(北京東勝科星);EVOS M5000熒光顯微鏡(賽默飛世爾科技有限公司)。

二、分組

實(shí)驗(yàn)小鼠經(jīng)普通顆粒飼料適應(yīng)喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)分成5組,分別為正常(N)組、對(duì)照(C)組、模型(M)組、IL-22組和IL-22+ML385(Nrf2抑制劑)組,每組各12只。

N組自由攝取固體顆粒飼料及蒸餾水,不進(jìn)行任何處理。M組、IL-22組和IL-22+ML385組小鼠用Lieber-DeCarli TP-4030B酒精液體飼料喂養(yǎng)4周后,10%的四氯化碳橄欖油腹腔注射2 μL/g,2次/周,共8周建立小鼠ALF模型;C組用Lieber-DeCarli TP-4030C對(duì)照液體飼料喂養(yǎng)4周后,純橄欖油腹腔注射2 μL/g,2次/周。造模后4周,IL-22組、IL-22+ML385組腹腔注射白介素100 ng/只,注射體積為200 μL,其中,IL-22+ML385組于注射IL-22 前1小時(shí)給予ML385,劑量為5 μg/g,C組和M組腹腔注射等劑量的PBS溶液。各組小鼠于末次給藥后禁食24 h,禁水2 h,稱重后麻醉處死,留取肝右葉組織及距小鼠回盲部1 cm左右的回腸組織1段,10%甲醛固定,脫水,石蠟包埋,制備成5 μm石蠟切片。

三、觀察指標(biāo)

蘇木精-伊紅(hematoxyli-eosin, HE)染色和馬松(Masson)染色:HE觀察小鼠肝臟和回腸組織病理變化,Masson染色評(píng)估小鼠肝纖維化程度,經(jīng)Masson后,膠原纖維呈藍(lán)色。

免疫組化:觀察回腸Occludin、ZO-1、Nrf2、NQO1和HO-1的表達(dá)。參照文獻(xiàn)[13]步驟操作。于400倍光鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野,利用ImageJ圖像分析軟件進(jìn)行定量分析,統(tǒng)計(jì)陽性蛋白平均吸光度(A)值。平均吸光度值越大,提示陽性蛋白的表達(dá)量越高。

免疫熒光染色:回腸組織石蠟切片60℃烤片2 h,恢復(fù)常溫,二甲苯脫蠟3次,梯度酒精脫水,PBS浸洗5次,每次5 min,在高溫高壓下行抗原修復(fù),待其自然冷卻后,PBS浸洗5次,將切片浸入3%的H2O2甲醇溶液中,避光孵育10 min,PBS浸洗5次,室溫下血清封閉1 h,滴加Occludin(1∶500)和ZO-1(1∶500)一抗,4℃濕盒孵育過夜,PBS浸洗5次,隨后于二抗生物素抗體中孵育1 h,PBS浸洗3次,滴加DAPI孵育5 min,PBS浸洗3次,滴加熒光淬滅封片液封片,在熒光顯微鏡下觀察拍照,上述步驟均在暗室中進(jìn)行。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、小鼠肝組織病理變化

HE染色示:N組與C組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)大致正常,肝細(xì)胞以中央靜脈為中心放射狀分布。與C組相比,M組肝臟有明顯變性、壞死及炎細(xì)胞浸潤表現(xiàn),肝小葉的結(jié)構(gòu)受損且存在假小葉。與M組比較,IL-22組肝臟組織變性、壞死表現(xiàn)減弱,纖維條索狹窄。與IL-22組相比,IL-22+ML385組小鼠肝臟組織存在多處變性、壞死,纖維條索略增寬。

Masson染色示:膠原纖維被染成藍(lán)色。N組與C組僅有少量膠原表達(dá)于中央靜脈壁;與C組相比,M組小鼠中央靜脈周圍、匯管區(qū)膠原纖維有大量膠原沉積,并進(jìn)入肝小葉形成不完全的間隔,顯示肝纖維化形成,肝細(xì)胞周圍纖維面積增加;與M組相比,IL-22組小鼠肝組織膠原沉積明顯降低;與IL-22組相比,IL-22+ML385組小鼠肝組織膠原纖維沉積略增多。見圖1。

HE染色:A為N組,B為C組,C為M組,D為IL-22組,E為IL-22+ML385組;Masson染色:F為N組,G為C組,H為M組,I為IL-22組,J為IL-22+ML385組

Masson染色示:Masson染色時(shí)膠原纖維被染成藍(lán)色。N組、C組膠原纖維表達(dá)量分別為1.462±0.315、1.723±0.415,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與C組膠原纖維表達(dá)量相比,M組(19.759±1.319)小鼠中央靜脈周圍、匯管區(qū)膠原纖維有大量膠原沉積,并進(jìn)入肝小葉形成不完全的間隔,顯示肝纖維化形成,肝細(xì)胞周圍纖維面積增加(P<0.05);與M組膠原纖維表達(dá)量相比,IL-22組(10.851±0.951)小鼠肝組織膠原沉積明顯降低(P<0.05);與IL-22組相比,IL-22+ML385組(19.264±0.932)小鼠肝組織膠原纖維沉積略增多(P<0.05)(見圖1)。

二、小鼠回腸組織病理變化

N組與C組小鼠回腸黏膜分布連續(xù),上皮細(xì)胞排列致密整齊;M組小鼠腸絨毛脫落,細(xì)胞排列紊亂,固有層略微充血;IL-22組小鼠回腸黏膜改變較M組明顯減輕;IL-22+ML385組小鼠仍可見腸絨毛脫落及細(xì)胞排列紊亂。見圖2。

A為N組,B為C組,C為M組,D為IL-22組,E為IL-22±ML385組

三、各組小鼠回腸組織中緊密連接蛋白Occludin、ZO-1及Nrf2、NQO1、HO-1蛋白的表達(dá)

與C組相比,M組小鼠回腸組織中Occludin和ZO-1陽性蛋白的A值下降(P=0.001),Nrf2陽性蛋白的A值升高(P=0.015)、NQO1陽性蛋白的A值升高(P=0.017)和HO-1陽性蛋白A值升高(P=0.009),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與M組相比,IL-22組小鼠回腸組織Occludin、ZO-1、NQO1、HO-1陽性蛋白的A值升高(P=0.001),Nrf2陽性蛋白的A值升高(P=0.003);與IL-22組相比,IL-22+ML385組小鼠回腸組織Occludin、ZO-1、Nrf2、HO-1陽性蛋白的A值下降(P=0.001), NQO1陽性蛋白的A值下降(P=0.003); N組與C組比較,Occludin、ZO-1及Nrf2、NQO1、HO-1陽性蛋白表達(dá)均無顯著差異。見圖3和表1。

表1 各組小鼠回腸組織Nrf2、NQO1、HO-1、Occludin和ZO-1陽性蛋白的A值比較 (±s)

圖3 5組小鼠8周后回腸組織Nrf2、NQO1、HO-1、Occludin和ZO-1陽性蛋白染色結(jié)果(免疫組化×400)

四、各組小鼠回腸組織中Occludin和ZO-1免疫熒光染色結(jié)果

Occludin和ZO-1熒光染色結(jié)果見圖4、5。N組與C組小鼠回腸回腸組織Occludin和ZO-1熒光染色較強(qiáng), M組小鼠Occludin和ZO-1熒光強(qiáng)度較弱;與M組相比,IL-22組熒光強(qiáng)度顯著升高,熒光信號(hào)分布清楚、完整;與IL-22組相比,IL-22+ML385組小鼠Occludin和ZO-1熒光強(qiáng)度減弱。

圖4 免疫熒光 5組小鼠8周后回腸組織Occludin陽性蛋白染色結(jié)果

圖5 5組小鼠8周后回腸組織ZO-1陽性蛋白免疫熒光染色結(jié)果

討 論

流行病學(xué)調(diào)查顯示,我國酒精性肝硬化占肝硬化病因的9.48%,酒精相關(guān)病因的肝癌占5.8%[14]。由此可見,ALD嚴(yán)重威脅人類健康。而ALF是肝硬化的必經(jīng)階段,且對(duì)ALD的預(yù)后起著關(guān)鍵作用[15],若能在ALF早期階段給予干預(yù),有望使ALD逆轉(zhuǎn)。

Lieber-DeCarli乙醇液體飼料建立ALD模型是國際公認(rèn)的ALD模型,但該方法造模周期長,病理改變以肝脂肪變?yōu)橹?難以形成肝纖維化[16]。Lieber-DeCarli乙醇液體飼料聯(lián)合微量CCL4腹腔注射建立小鼠ALF復(fù)合模型,方法簡(jiǎn)單易行,小鼠死亡率低,模型穩(wěn)定性好[17,18]。故本實(shí)驗(yàn)采用Lieber-DeCarli乙醇液體飼料聯(lián)合腹腔注射CCL4建立ALF復(fù)合模型,經(jīng)Masson染色發(fā)現(xiàn)M組小鼠膠原纖維沉積明顯增加,提示ALF復(fù)合模型制備成功。

腸黏膜屏障功能障礙是加重ALF發(fā)生的重要因素。長期飲酒可使腸黏膜屏障功能受損,腸源性內(nèi)毒素經(jīng)門靜脈進(jìn)入體循環(huán),腸道微生物及代謝產(chǎn)物易位至肝臟,進(jìn)而加重肝臟損傷[19]。腸上皮間緊密連接蛋白是構(gòu)成腸黏膜屏障的主要結(jié)構(gòu),由Claudins、Occludin和黏附連接3種膜蛋白及閉合小環(huán)蛋白(ZOs)等外周相鄰蛋白組成[20]。已有研究證實(shí),酒精可使腸上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白的表達(dá)下降,腸道通透性增加[21]。在本實(shí)驗(yàn)中,與C組相比,M組小鼠回腸黏膜絨毛脫落,上皮細(xì)胞排列紊亂,且Occludin和ZO-1蛋白A值明顯下降,IL-22治療后,Occludin和ZO-1蛋白A值升高,而IL-22+ML385組Occludin和ZO-1蛋白A值相對(duì)減弱。推測(cè)IL-22可使回腸緊密連接蛋白表達(dá)增加,增強(qiáng)回腸屏障功能,進(jìn)而阻斷ALF的進(jìn)展,而使用Nrf2的抑制劑ML385后,減弱了IL-22對(duì)ALF小鼠回腸屏障的改善作用,可能與ML385抑制回腸抗氧化應(yīng)激能力有關(guān)。

氧化應(yīng)激在調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白的完整性方面起重要作用,且貫穿ALD的各個(gè)階段,在該病的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用[22]。Nrf2/HO-1是目前發(fā)現(xiàn)重要的抗氧化應(yīng)激通路之一。本研究顯示,與C組相比,M組小鼠回腸Nrf2、HO-1和NQO-1的A值相對(duì)增高,經(jīng)IL-22治療后,Nrf2、HO-1和NQO-1的A值較M組明顯增高,與IL-22組相比,使用Nrf2抑制劑ML385后,小鼠回腸組織中Nrf2、HO-1和NQO-1的A值相對(duì)減弱。推測(cè)IL-22可激活回腸Nrf2/HO-1抗氧化應(yīng)激通路,增加回腸緊密連接蛋白表達(dá),進(jìn)而保護(hù)回腸黏膜屏障,減少腸道代謝產(chǎn)物對(duì)肝臟的進(jìn)一步損傷,阻斷酒精性肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。

IL-22作為肝細(xì)胞的保護(hù)因子,其抗纖維化作用已在動(dòng)物模型中被證實(shí)。Kong等[23]研究發(fā)現(xiàn),IL-22過表達(dá)可活化STAT3信號(hào)通路誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞衰老,進(jìn)而減輕肝纖維化。Ni等[24]發(fā)現(xiàn),乙醛可刺激大鼠肝星狀細(xì)胞活化增殖,而IL-22可促進(jìn)nrf2向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位,抑制乙醛所致的活化增殖,阻斷肝纖維化進(jìn)展。此外,IL-22可激活JAK/STAT途徑上調(diào)腸道緊密連接蛋白表達(dá),進(jìn)而增加腸黏膜上皮的完整性[25]。但I(xiàn)L-22維持腸黏膜上皮的完整性是否與Nrf2/HO-1抗氧化通路有關(guān)尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,IL-22可改善ALF小鼠肝臟及回腸組織病理損傷程度,增加回腸緊密連接蛋白Occludin、ZO-1表達(dá),且增強(qiáng)回腸組織抗氧化通路中Nrf2、NQO-1和HO-1蛋白的表達(dá),提示IL-22對(duì)阻斷ALF進(jìn)展起一定作用,其機(jī)制可能與激活回腸Nrf2/HO-1抗氧化應(yīng)激通路改善回腸緊密連接蛋白表達(dá),維持回腸屏障功能,進(jìn)而阻斷ALF的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述,IL-22可通過增強(qiáng)回腸抗氧化應(yīng)激能力、提升回腸緊密連接蛋白Occludin、ZO-1表達(dá),改善回腸屏障功能,進(jìn)而減輕腸滲漏來阻斷ALF的發(fā)生發(fā)展。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。