鬼針草多糖的抗氧化性研究

李程瑤

(清遠市食品藥品檢驗所，廣東 清遠 511500)

0 引言

鬼針草(Bidens pilosa L.)，又名鬼釵草、婆婆針等，為菊科管狀花亞科，其味苦、性平、無毒，具有清熱解毒、活血化瘀、止瀉等功效，可用于治療尿路感染、痢疾、炎癥、感冒、咽喉腫痛等癥狀，是我國民間常用的中草藥。采收時節(jié)為夏季、秋季的開花期，可鮮用或者曬干，全草均可入藥。鬼針草屬植物分布于亞洲、美洲的熱帶和亞熱帶等地區(qū)，在我國主要產(chǎn)于華東、華中、華南、西南的各個省區(qū)，田邊、路邊荒地中均可生長，生命力旺盛。鬼針草始載于《本草綱目拾遺》，并且被列為上品；曾收載于1997 年版《中華人民共和國藥典》中，質(zhì)量標準鑒別項僅有水分測定，無含量測定；現(xiàn)收載于各省中藥材標準中，主要為鑒定和檢查項目。

鬼針草主要化學成分為黃酮類、多炔類、多糖、有機酸、酯類及苷類等，其多糖成分具有抑菌抗炎、抗高血脂、保肝護肝、抗腫瘤、抗結(jié)石等藥效[1]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，鬼針草主要具有降壓鎮(zhèn)痛、抑菌、抗病毒和消炎等功效，鬼針草多糖是發(fā)揮其藥效學作用的物質(zhì)基礎(chǔ)之一[2]?，F(xiàn)如今，國內(nèi)外對鬼針草的藥理作用已有研究，其化學成分也在不斷闡明，但對單體活性成分的研究較少。鬼針草具有多種明顯的藥理作用，并且廣泛應(yīng)用于臨床，目前鬼針草中藥飲片每公斤市場價格僅在5 到10 元之間，這很大程度上是因為鬼針草的單一組分未能被不斷地挖掘和純化。如今，大部分研究和實踐缺少對鬼針草多糖含量及其特征性成分的測定，主要原因是多糖在質(zhì)量標準、表征鑒定等方面存在一定的研究難度和特殊性；其次，多糖結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系、作用機制和在人體內(nèi)的代謝過程尚未得到充分闡明。

就多糖的抗氧化性實驗而言，由于天然產(chǎn)物成分復雜而具有多種多樣的生物活性，從而易發(fā)生多種化學反應(yīng)[3]。抗氧化活性研究是天然產(chǎn)物研究領(lǐng)域的熱點，因此，本實驗通過對鬼針草DPPH、OH-和超氧陰離子三種自由基的清除能力的測定，考察其抗氧化能力。

1 實驗部分

1.1 主要試劑與儀器

本次實驗所需的主要試劑包括鬼針草、水楊酸、95%乙醇、無水乙醇、丙酮、硫酸亞鐵、抗壞血酸、焦性沒食子酸、1,1-二苯基-2-苦基肼自由基(DPPH)、蒸餾水；主要設(shè)備包括721N 分光光度計、KQ3200D 超聲波清洗器、DFT-50 手提式高速萬能粉碎機、HWS26型電熱恒溫水浴鍋、TC-15 套式恒溫器、SHZ-D 循環(huán)水式真空泵。

1.2 實驗方法

1.2.1 藥材前處理及供試品溶液的制備

將鬼針草藥材置于高速組織搗碎機中充分搗碎，過2 目篩，每次稱取50 g，置于1 000 mL 燒瓶中，加入8 倍鬼針草藥材量的95%乙醇，回流浸提2 h 后，用紗布過濾，藥渣置于70 ℃干燥箱烘干，待用。精密稱取鬼針草藥材粉末1 g，放入潔凈干燥的三角瓶中，加入蒸餾水20 mL，加蓋，稱重并記錄。在溫度為60 ℃、超聲時間為40 min、超聲功率為150 W、料液比為1∶20(g/mL)的條件下，進行超聲提取。按以上步驟重復多次，收集濾液進行濃縮，再添加4 倍量的無水乙醇，在4 ℃下，靜置過夜。然后在轉(zhuǎn)速3 000 r/min 下離心10 min，再進行抽濾。將所得沉淀依次用無水乙醇、丙酮洗滌2 次并揮干溶劑，再于60 ℃下烘干，即得到深棕色粗鬼針草多糖。精密稱取50 mg 粗多糖，用蒸餾水溶解，定容于50 mL 容量瓶中，得到鬼針草多糖溶液，其濃度為1 mg/mL[4]。

1.2.2 DPPH 清除能力測定

鬼針草多糖對DPPH 清除能力測定采用DPPH自由基清除法：精密稱取8.0 mg DPPH，置于100 mL棕色容量瓶中，用無水乙醇溶解并定容，得到的DPPH溶液濃度為2×10-4mol/L，避光保存。

取3 mL DPPH 溶液，再分批加入0.5 mL 鬼針草多糖溶液中，邊加邊混勻，并觀察溶液顏色褪色情況，當溶液顏色基本褪去時，記錄鬼針草多糖溶液的加樣量為4.0 mL。此時鬼針草多糖溶液的加樣量即為最大加樣量，在最大用量基礎(chǔ)上往前設(shè)置5 個用量，其用量梯度為0.8、1.6、2.4、3.2、4.0 mL。同理可得，應(yīng)以20 μg/mL VC 溶液為陽性對照，其用量梯度也為0.8、1.6、2.4、3.2、4.0 mL。實驗設(shè)計見表1。

⑦連接好的管道應(yīng)及時進行水壓試驗，試壓分段長度1km左右，最大不超過1.5km。試水壓力為管道設(shè)計工作壓力的1.5倍，即管材壓力（MPa）乘以1.5。試壓時排氣點應(yīng)設(shè)在管道最高處，打壓點應(yīng)設(shè)在管道端頭較低處。當?shù)皆噳褐翟O(shè)計標準之后，應(yīng)靜置1h。1h內(nèi)，壓力值下降不超過0.1 MPa時該段管道試驗合格，管道試壓合格后進行通水沖洗。

表1 DPPH 清除能力測定實驗設(shè)計表

分別取不同量鬼針草多糖溶液和VC 溶液加入95% 乙醇后，置于4 mL 試管中，再加入3 mL 配制的DPPH 溶液，混勻后避光反應(yīng)30 min，再分別測定其在517 nm 波長下的吸光度。進行3 次平行實驗，求其平均值，換算出DPPH 的清除率。以組別為橫坐標，DPPH 清除率為縱坐標，繪制出鬼針草多糖溶液和VC 溶液對DPPH 的清除能力曲線[5]。

DPPH 的清除率公式見式(1)。

式中：Ai 為3 mL DPPH 溶液+ 4 mL 多糖提取液的吸光度；Aj 為3 mL 95%乙醇+ 4 mL 多糖提取液的吸光度；A0 為3 mL DPPH 溶液+ 3 mL 95%乙醇的吸光度。

1.2.3 OH-清除能力測定

鬼針草多糖對羥自由基清除能力的測定采用水楊酸捕獲法：取3 支試管，分別加入1.0、3.0、5.0 mL 鬼針草多糖溶液，加蒸餾水至5 mL，再依次加入1 mLFeSO4(6 mmol/L)，3 mL 水楊酸溶液(6 mmol/L)，1 mL H2O2(6 mmol/L)，混勻后觀察溶液顏色褪色情況，記錄溶液基本褪色時樣品的加樣量為5.0 mL。此加樣量為樣品最大加樣量，在最大用量基礎(chǔ)上往前設(shè)置5 個用量，其用量梯度為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL。同理可得，應(yīng)以200 μg/mL VC 溶液為陽性對照，其用量梯度也為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL。實驗設(shè)計見表2。

表2 OH-清除能力測定實驗設(shè)計表

測定時，向10 mL 容量瓶中加入1 mL FeSO4(6 mmol/L)，3 mL 水楊酸溶液(6 mmol/L)，1 mL H2O2(6 mmol/L)，空白對照以蒸餾水代替多糖提取液，最后再加入1 mL H2O2(6 mmol/L)溶液啟動反應(yīng)，混勻后，在37 ℃水浴中反應(yīng)15 min，反應(yīng)結(jié)束后測定其在波長為510 nm 下的吸光度，由于樣液本身具有吸光度，測其本底值時用蒸餾水代替H2O2溶液。以200 μg/mL VC 溶液為陽性對照，進行3 次平行實驗，求其平均值，換算出羥自由基的清除率[5]。以組別為橫坐標，OH-清除率為縱坐標，繪制出鬼針草多糖溶液和VC 溶液對羥自由基的清除能力曲線。

羥自由基的清除率公式見式(2)。

式中：Ai 為加入多糖提取液的吸光度；Aj 為樣液本底吸光度，且未加顯色劑H2O2溶液；A0 為空白對照吸光度。

1.2.4 超氧陰離子清除能力測定

超氧陰離子自由基清除能力的測定采用鄰苯三酚法：取3 支試管，分別加入1.0、3.0、5.0 mL 的樣品液，加蒸餾水至5 mL，再加入50 mmol/L、pH=8.1 的Tris-HCl 緩沖液2 mL，混勻后，于37 ℃水浴中反應(yīng)10 min，再加入0.5 mL 鄰苯三酚溶液(25 mmol/L)，迅速混勻后，于37 ℃ 下反應(yīng)4 min，再加入0.5 mL 濃鹽酸終止反應(yīng)，并觀察溶液顏色褪色情況，記錄溶液基本褪色時樣品的加樣量為5.0 mL。此加樣量為樣品最大加樣量，在最大用量基礎(chǔ)上往前設(shè)置5 個用量，其用量梯度為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL。同理可得，應(yīng)以100 μg/mL VC 溶液為陽性對照，其用量梯度也為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL。實驗設(shè)計見表3[6-7]。

表3 超氧陰離子清除能力測定實驗設(shè)計表

測定時，向10 mL 容量瓶中加入多糖提取液5 mL(空白對照以蒸餾水代替多糖提取液)，再加入50 mmol/L、pH=8.1 的Tris-HCl 緩沖液2 mL，混勻后，于37 ℃水浴中反應(yīng)10 min，再加入0.5 mL 鄰苯三酚溶液(25 mmol/L)，迅速混勻后，于37 ℃下反應(yīng)4 min，再加入0.5 mL 濃鹽酸終止反應(yīng)，測定其在325 nm 波長下的吸光度，以100 μg/mL VC 溶液為陽性對照，進行3 次平行實驗，換算出超氧陰離子的清除率。以組別為橫坐標，超氧陰離子清除率為縱坐標，繪制出鬼針草多糖溶液和VC 溶液對超氧陰離子的清除能力曲線。

超氧陰離子自由基的清除率公式見式(3)。

式中：Ai 為加入多糖提取液的吸光度；Aj 為樣液本底吸光度，且未加顯色劑鄰苯三酚溶液；A0 為空白對照吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 DPPH 清除能力測定

由圖1 可知，不同濃度的鬼針草多糖、VC 溶液都具有抗氧化能力，且清除率隨著濃度的增加而增大，清除率的提高隨著濃度的增加而逐漸減緩。在實驗濃度范圍內(nèi)，鬼針草多糖溶液濃度為4.0 mg/mL 時，對DPPH 清除率達到最大，為65.227%；對照品VC 溶液在實驗濃度范圍內(nèi)的最大清除率為79.438%，相應(yīng)濃度為0.020 mg/mL，由清除率可看出鬼針草多糖與VC 溶液清除率較為接近，對比濃度可知鬼針草多糖溶液濃度為相應(yīng)VC 溶液濃度的50 倍。由此表明，鬼針草多糖對DPPH 清除能力不及VC 溶液，約為VC溶液的1/50。

圖1 鬼針草多糖、VC 溶液對DPPH 的清除效果

2.2 OH-清除能力測定

由圖2 可知，不同濃度的鬼針草多糖、VC 溶液都具有清除OH-的能力，并呈一定的量效關(guān)系。在實驗濃度范圍內(nèi)，當鬼針草多糖溶液濃度為1.0 mg/mL 時，對OH-清除率達到最強，為83.385%；對照品VC 溶液的最大清除率為93.133%，相應(yīng)的濃度是0.20 mg/mL，由此可以看出，鬼針草多糖與VC 溶液清除率較為接近，對比濃度和清除率可知，鬼針草多糖溶液濃度為相應(yīng)VC 溶液濃度的5 倍時，清除率較接近，但鬼針草多糖溶液的清除率略低于VC 溶液。由此表明，鬼針草多糖對OH-清除能力不及VC 溶液，約為VC 溶液的1/5。

圖2 鬼針草多糖、VC 溶液對羥基自由基的清除效果

2.3 超氧陰離子自由基清除率測定

由圖3 可知，濃度不同的鬼針草多糖、VC 溶液都具有清除超氧陰離子的能力，濃度增加時，清除率隨之增大。在實驗濃度范圍內(nèi)，當鬼針草多糖溶液濃度為1.0 mg/mL 時，對超氧陰離子清除率達到最強，為96.972%；對照品VC 溶液的最大清除率為69.992%，相應(yīng)濃度為0.10 mg/mL，由此可看出VC 溶液對超氧陰離子的清除率遠低于鬼針草多糖。對比濃度可知，鬼針草多糖溶液濃度為相應(yīng)VC 溶液濃度的10 倍。由此表明，鬼針草多糖對超氧陰離子清除能力不及VC溶液，約為VC 溶液的1/10。

圖3 鬼針草多糖、VC 溶液對超氧陰離子自由基的清除效果

3 討論

研究鬼針草多糖對DPPH 清除能力時，采用DPPH 自由基清除法，這是自由基清除劑體外模型研究中常用的研究方法，操作簡單，但DPPH 穩(wěn)定性差，操作時需要新鮮配制。清除羥自由基的能力測定時，采用水楊酸捕獲法，原理為利用羥自由基與水楊酸反應(yīng)生成的2,3-二羥基苯甲酸在510 nm 處有特殊吸收。清除超氧陰離子自由基的能力測定用鄰苯三酚法，該法應(yīng)用于初步篩選抗氧化劑及各種活性物質(zhì)對超氧陰離子自由基的抗氧化功能評價，通過鏈式反應(yīng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基。此三種方法均通過紫外-分光光度計定量測定體系對DPPH、羥自由基和超氧陰離子的清除作用，從而間接評價樣品的抗氧化能力。實驗中均采用VC 溶液作為對照品，可以更加直觀地了解鬼針草多糖的抗氧化性。

由實驗結(jié)果可見，鬼針草多糖對DPPH 清除能力不及VC 試劑，略小于VC 試劑的1/50。實驗中，數(shù)據(jù)的方差較大，這可能是因為提取過程中操作時間過長，而DPPH 最好于3.5 h 內(nèi)用完，因此導致實驗誤差較大，也可能是因為操作不完全相同、儀器不完全一樣等原因。鬼針草多糖溶液對羥自由基清除能力略有提升，約為VC 試劑的1/5；對超氧陰離子的清除能力小于VC 試劑，約為VC 試劑的1/10。本實驗僅對鬼針草多糖的抗氧化活性進行初步測定，可為鬼針草多糖抗氧化活性的深入研究提供參考。

4 結(jié)語

本實驗結(jié)果顯示，鬼針草多糖有一定的清除DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基的能力。在實驗濃度范圍內(nèi)，抗氧化能力與濃度有良好的量效關(guān)系，鬼針草多糖溶液對DPPH 自由基的清除能力約為VC 試劑的1/50；對羥自由基清除能力約為VC 試劑的1/5；對超氧陰離子自由基清除能力約為VC 試劑的1/10。到目前為止，對鬼針草的化學成分已經(jīng)有了部分了解，今后可以加強開展鬼針草其他化學成分研究以及生藥學、藥理作用研究，并深入研究鬼針草單方和復方制劑，為臨床應(yīng)用該藥提供指導，也為鬼針草新藥的進一步研發(fā)奠定堅實基礎(chǔ)。