IL-6促進小鼠小膠質細胞系BV2壞死性凋亡

鄭建濱，吳少華，黃玉景

寧德師范學院附屬寧德市醫(yī)院 麻醉科，福建 寧德 352100

神經(jīng)炎性反應常導致神經(jīng)損傷和死亡,并驅動多種神經(jīng)退行性疾病(如阿爾茨海默病和帕金森病)的進展和惡化,以及視網(wǎng)膜變性[1],因此調控神經(jīng)炎性反應成為神經(jīng)退行性疾病的一種有希望的策略,因為它有可能阻止神經(jīng)損傷的持續(xù)發(fā)生。

小膠質細胞存在于腦和脊髓中,參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎性反應過程[2],并且在體內平衡和疾病的交叉路口發(fā)揮細胞毒性和細胞保護作用[3-5]。脂多糖 (lipopolysaccharide,LPS) 誘導的M1小膠質細胞通過產生促炎介質來增強炎性反應[3]。壞死性凋亡是一種會引發(fā)炎性反應的壞死細胞死亡的形式,活化的小膠質細胞/巨噬細胞也誘導慢性炎性反應部位的壞死性凋亡,從而形成正反饋環(huán)[4]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞:小鼠小膠質細胞系BV2(中國典型培養(yǎng)物保藏中心)。

1.1.2 試劑:RPMI 1640培養(yǎng)基(Hyclone公司),胎牛血清(Gibco公司),LPS (Sigma-Aldrich公司),IL-6拮抗劑siltuximab(Selleck Chemicals公司),CCK-8反應試劑(碧云天生物技術公司),Trizol試劑(Invitrogen公司),PrimerScript RT Master Mix,SYBR Premix Ex Taq (Takara公司),BCA蛋白質測定試劑盒與ABI 7500熒光定量PCR儀(Thermo Fisher Scientific公司)。蛋白抗體(p-STAT3、STAT3、p-JAK、JAK、RIP1、RIP3、GAPDH一抗和羊抗兔二抗IgG)(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 BV2細胞的分組與處理:BV2細胞培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基添加10%胎牛血清的培養(yǎng)其中,每24 h更換1次培養(yǎng)基,當達到70%～80%匯合時,對細胞進行傳代培養(yǎng)或冷凍保存。為建立小膠質細胞神經(jīng)炎性反應體外模型,使用1 μg/mL LPS處理BV2細胞24 h,進一步使用1 μg/mL 的IL-6拮抗劑siltuximab處理細胞24 h[5]。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖:將細胞接種到96孔板中(3×103個細胞/孔)并在37 ℃下培養(yǎng)。分別培養(yǎng)0、24、48和72 h后,向每個孔中加入10 μL CCK-8反應試劑。37 ℃孵育4 h后,檢測450 nm處的吸光度,繪制細胞增殖曲線。

1.2.3 流式細胞測量術檢測細胞凋亡:調整細胞濃度為5×108/L,加入5 μL annexin V-APC and 5 μL 7-AAD,在室溫避光孵育15 min,用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.4 RT-qPCR檢測mRNA表達水平:按照說明書,使用Trizol試劑從培養(yǎng)的細胞中分離出總RNA。用PrimerScript RT Master Mix將1 μg RNA反轉錄為cDNA。然后根據(jù)說明書用SYBR Premix Ex Taq在 ABI 7500上進行RT-qPCR實驗,Gapdh作為內參,通過2-ΔΔCt[6]法分別計算基因的相對表達量。PCR引物(表1)。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer sequence of RT-qPCR

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 LPS誘導建立小膠質細胞炎性反應模型

LPS誘導后,BV2細胞的增殖活力顯著降低(P<0.01)(圖1A),而BV2細胞凋亡顯著增加(P<0.01)(圖1B)。此外,促炎因子IL-6與TNF-α均含量增加(P<0.01)(圖1C)。

A.the cell proliferation was detected by CCK-8 assay; B.flow cytometry was used to detect cell apoptosis; C.ELISA assay was used to detect the content of pro-inflammatory cytokines IL-6 and TNF-α; *P<0.01 compared with Ctrl.圖1 LPS誘導建立小膠質細胞炎性反應模型Fig 1 LPS-induced microglial inflammation model n=3)

2.2 LPS誘導小膠質細胞M1極化

LPS誘導后,M1極化標志物IL-1β和IFN-γ表達上調,而M2極化標志物CD206和Arg-1表達下調(P<0.01)(圖2)。

The expression of M1 polarization markers IL-1β and IFN-γ and M2 polarization markers CD206 and Arg-1 in BV2 cells was detected by *P<0.01 LPS compared with Ctrl.圖2 LPS誘導小膠質細胞M1極化Fig 2 LPS induced microglia M1 polarization n=3)

2.3 IL-6激活JAK-STAT3通路調節(jié)神經(jīng)炎性反應中小膠質細胞壞死性凋亡

LPS誘導促進了JAK-STAT3信號通路的磷酸化,上調壞死性凋亡相關蛋白RIP1和RIP3(P<0.01);但使用IL-6拮抗劑塞妥昔單抗處理后,上述蛋白表達變化均被部分逆轉(P<0.01)(圖3)。

LPS-induced BV2 cells were treated with IL-6 antagonist siltuximab, and the phosphorylation of key proteins in the JAK-STAT3 pathway and the expression of necroptosis-related proteins RIP1 and RIP3 were detected by Western blot; *P<0.01 compared with Ctrl; #P<0.01 compared with LPS.圖3 IL-6激活JAK-STAT3通路調節(jié)神經(jīng)炎性反應中小膠質細胞壞死性凋亡Fig 3 IL-6 activated JAK-STAT3 pathway to regulate necroptosis of microglia in neuroinflammatory response

3 討論

與其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細胞不同,小膠質細胞來源于卵黃囊中的造血干細胞,是對中樞神經(jīng)系統(tǒng)病原體或損傷做出反應的初級細胞。類似于巨噬細胞, 小膠質細胞可極化為M1表型(例如被LPS誘導)以產生促炎介質[7]。相反, 抗炎細胞因子IL-4在鼠卒中模型中引起保護性M2小膠質細胞群的形成[8]?？刂菩∧z質細胞的M1/M2極化的介質有望調節(jié)神經(jīng)炎性反應。

在神經(jīng)炎性反應條件下,小膠質細胞釋放炎性細胞因子,如TNF-α、IL-6和IL-1β,導致神經(jīng)炎性反應患者的突觸功能障礙和神經(jīng)元死亡[9]。IL-6是神經(jīng)血管功能障礙、神經(jīng)退行性變和(或)神經(jīng)炎性反應的重要介質。JAK/STAT3的早期激活主要由小膠質細胞中的IL-6誘導,并有助于疾病的發(fā)展[10]。STAT3是JAK/STAT信號家族的成員,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達,其活性磷酸化形式在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后上調,并參與小膠質細胞炎性反應[10]。這與本實驗中所探究的結果相一致。

壞死細胞的死亡也可以是一個受調控的過程,這就是所謂的壞死性凋亡[11]。壞死性凋亡由含壞死體的受體相互作用蛋白1(receptor-interacting protein 1,RIP1)、RIP3和混合譜系激酶結構域樣蛋白 (MLKL) 介導。在某些病理條件下,RIP1將被激活,并通過RIP同型相互作用基序 (RIP homotypic interaction motif, RHIM) 與RIP3結合,形成淀粉樣蛋白復合物,稱為復合物IIb。復合物IIb中活化的RIP3進一步磷酸化下游分子MLKL,在質膜上形成寡聚體和聚集體,通過質膜破裂和細胞溶解引起壞死性凋亡。隨后,大量的細胞內容物如損傷相關分子模式(dam-age-associ-ated molecular patterns, DAMPs) 被釋放,引起繼發(fā)性炎性反應加重組織損傷[12-13]。而本研究觀察到拮抗IL-6后,可以抑制小膠質細胞的壞死性凋亡。

本研究僅僅只在細胞層面探究了IL-6介導的JAK/STAT3通路可以影響小膠質細胞的壞死性凋亡。在今后研究中,將進一步在動物實驗中驗證該通路調控機制,以期為臨床上小膠質細胞相關疾病的治療提供新的思路。