轉(zhuǎn)化生長因子β1促進大鼠子宮內(nèi)膜纖維化

金國鈺，楊春潤，何 靜，張舒榮，劉歡歡，李長忠

1.山東中醫(yī)藥大學 第一臨床醫(yī)學院，山東 濟南 250000；2.山東省立醫(yī)院 婦科，山東 濟南 250021；3.山東大學 醫(yī)學融合與實踐中心，山東 濟南 250021；4.北京大學深圳醫(yī)院 婦產(chǎn)科，廣東 深圳 518036

宮腔黏連(intrauterine adhesions,IUA)指各種因素引起的子宮內(nèi)膜基底層損傷,導致的宮腔部分或全部黏連[1],常伴月經(jīng)紊亂、痛經(jīng)、閉經(jīng)、習慣性流產(chǎn)及繼發(fā)性不孕等癥狀,嚴重影響女性身心健康[2]。

創(chuàng)傷與纖維細胞增生活躍學說是目前公認的宮腔黏連的主要機制之一,子宮內(nèi)膜纖維化是IUA的最終病理表現(xiàn)[3]。纖維化的形成是多種因素綜合作用的結(jié)果,TGF-β及其相關信號通路的激活是肺、心、腎等多個器官纖維化的關鍵因素[4]。妊娠大鼠刮宮后,子宮內(nèi)膜纖維化面積和 TGF-β1 表達明顯增加,TGF-β1 與子宮內(nèi)膜纖維化程度相關,但其具體機制尚不明確[5]?；诖?本實驗通過觀察轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-beta 1,TGF-β1)和α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)在子宮內(nèi)膜纖維化中的表達,進一步探討其背后機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:SPF級雌性SD 大鼠24只,質(zhì)量(220±10)g[斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司],飼養(yǎng)于山東省立醫(yī)院動物實驗中心屏障環(huán)境中。實驗動物的處理符合山東省立醫(yī)院動物實驗中心動物實驗倫理規(guī)范(NO.2020-004)。

1.1.2 主要實驗試劑:動物用三溴乙醇麻醉劑(山東省立醫(yī)院動物實驗中心);脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)、 HE染色試劑盒和Masson三色染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);兔抗α-SMA、兔抗TGF-β1和即用型HRP標記羊抗兔二抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠的分組:將大鼠隨機分為假手術(shù)組和模型組,各12只。按參考文獻[6],采用機械損傷加脂多糖雙重損傷法建立大鼠子宮內(nèi)膜纖維化模型,假手術(shù)組僅開關腹。

1.2.2 采集標本與處理:腹腔注射過量三溴乙醇麻醉處死大鼠,肉眼觀察各組大鼠子宮組織。仔細剝離多余脂肪和結(jié)締組織,用預冷的PBS沖洗子宮組織,洗掉多余血液后,子宮組織放入4%多聚甲醛中固定,常規(guī)脫水,石蠟包埋,行4 μm切片。

1.2.3 HE染色檢測子宮內(nèi)膜形態(tài)及腺體數(shù)量:組織切片常規(guī)脫蠟至水,蘇木素染色, 1%鹽酸乙醇分化,伊紅染色,常規(guī)脫水、透明,中性樹膠封片。

1.2.4 Masson染色檢測子宮內(nèi)膜纖維化程度:組織切片脫蠟至水,Weigert鐵蘇木素染色,1%鹽酸乙醇分化,氨水返藍,麗春酸性品紅染液染色,磷鉬酸水溶液分化,苯胺藍染色,常規(guī)脫水、透明,中性樹膠封片。

1.2.5 免疫組織化學法檢測TGF-β1及α-SMA 蛋白的表達:組織切片脫蠟至水, Tris-EDTA修復液抗原修復,3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,5% BSA封閉非特異性靶點,分別加入稀釋后的一抗,即兔抗大鼠TGF-β1(1∶400)和兔抗大鼠α-SMA(1∶5 000),4 ℃孵育過夜,37 ℃復溫,滴加適量即用型HRP標記抗兔二抗,DAB顯色,滴加適量1% CuSO4增強信號,蘇木素復染,常規(guī)脫水、透明,中性樹膠封片。空白對照組滴加PBS代替一抗,其余步驟同前。

鏡下觀察子宮內(nèi)膜病理改變。每張切片隨機選取5個互不重疊視野進行圖像采集(200×),使用Image Pro Plus 6.0 圖像處理軟件分析子宮內(nèi)膜腺體數(shù)目變化、子宮內(nèi)膜纖維化面積比例和目的蛋白平均吸光度值(mean absorbance,MA)。子宮內(nèi)膜纖維化面積比例=子宮內(nèi)膜間質(zhì)纖維化面積/子宮內(nèi)膜間質(zhì)及腺體總面積。平均吸光度值代表免疫組化陽性區(qū)域的平均染色強度,平均吸光度=累積吸光度(integrated absorbance,IA)/累積面積(sum area)。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 子宮組織形態(tài)學觀察

假手術(shù)組子宮為淡紅色“Y”字形宮體,結(jié)構(gòu)完整清晰,質(zhì)軟,有彈性。模型組子宮可見明顯充血水腫,宮腔積液明顯,宮體失去原有形態(tài),與周圍組織有不同程度黏連(圖1)。

圖1 子宮組織形態(tài)學觀察Fig 1 Histomorphological observation of the uterus

2.2 鼠子宮內(nèi)膜組織形態(tài)變化

模型組子宮淺肌層部分缺失,纖維性黏連帶形成、間質(zhì)結(jié)構(gòu)疏松、部分有炎性細胞浸潤,并伴不同程度的出血水腫(圖2)。術(shù)后7、14和28 d模型組子宮內(nèi)膜腺體數(shù)目較假手術(shù)組逐漸減少,術(shù)后14和28 d腺體數(shù)目較假手術(shù)組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖3)。

圖2 各組大鼠子宮HE和Masson染色Fig 2 HE and Masson staining of the uterus in various groups of rats

2.3 大鼠子宮內(nèi)膜纖維化程度

Masson 染色可將膠原纖維染成綠色,肌纖維、黏膜及細胞核染成紫紅色(圖2)。術(shù)后7、14和28 d模型組子宮內(nèi)膜纖維化面積比例較假手術(shù)組逐漸增加,術(shù)后14和28 d子宮內(nèi)膜纖維化面積比例較假手術(shù)組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖3)。

2.4 大鼠子宮組織TGF-β1、α-SMA 蛋白表達

TGF-β1、α-SMA 陽性表達為黃色或棕黃色顆粒,α-SMA 主要在胞質(zhì)中表達,TGF-β1主要在胞漿中表達,二者隨著子宮內(nèi)膜纖維化程度而加重(圖4)。術(shù)后7、14和28 d,模型組各組大鼠TGF-β1、α-SMA 表達較假手術(shù)組明顯增加。術(shù)后14和28 d模型組TGF-β1、α-SMA表達較假手術(shù)組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖5)。

圖4 各組大鼠子宮組織免疫組化染色Fig 4 Immunohistochemical staining of uterine tissues from various groups of rats

*P<0.05, **P<0.001, ***P<0.0001 compared with sham operation group.圖5 各組大鼠子宮組織TGF-β1、α-SMA 蛋白表達Fig 5 TGF-β1 and α-SMA protein expression in uterine tissues of rats of all groups

3 討論

作為TGF-β家族中活性最強的亞型,TGF-β1被公認為是組織纖維化和肌成纖維細胞分化的關鍵誘導劑[7]。一方面,TGF-β1通過絲裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase,MAPK)、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)和Wnt/β-連環(huán)蛋白等信號通路帶來一系列復雜作用,最終導致纖維蛋白原分泌異常。另一方面TGF-β1能夠誘導成纖維細胞、上皮細胞、內(nèi)皮細胞、周細胞和間充質(zhì)干細胞等多種細胞轉(zhuǎn)化為表達α-SMA的肌成纖維細胞(myofibroblast, MFB)。

MFB是纖維化的關鍵介質(zhì)細胞,具有更強的增殖和分泌特性,有助于細胞外基質(zhì)(extracellular matrixc,ECM)和膠原蛋白的沉積[8]。含有α-SMA 的應力纖維出現(xiàn)是MFB的特征性標志物[9]。肌動蛋白亞型通常在血管平滑肌細胞中出現(xiàn),新出現(xiàn)的、摻入應力纖維中的α-SMA 能夠增加MFB的收縮活性,隨之產(chǎn)生的機械張力可造成周圍組織破壞、出血、瘢痕,從而導致不可逆的纖維化和組織結(jié)構(gòu)的破壞[10]。MFB是多種細胞轉(zhuǎn)分化的結(jié)果。通常,MFB表達Ⅰ型膠原蛋白、TGF-β1、α-SMA等其他因子,而這些因子又能夠刺激其他細胞轉(zhuǎn)化為MFB,促進纖維化進程。因此,雖然肌成纖維細胞的具體機制尚不明確,其仍被認為是纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。

本實驗以雙重損傷法建立IUA大鼠為模型,研究宮腔黏連后子宮內(nèi)膜纖維化的病理改變。該模型在單一機械損傷的基礎上,宮腔放置脂多糖棉線,加重炎性反應,促進膠原合成、分泌和膠原纖維的增生。乙醇灌注、熱剝離、機械損傷均能誘導IUA 模型[11]。但本研究所用的IUA動物模型最為符合臨床IUA病理特征。在造模后7、14及28 d,隨著時間的延長,子宮腺體數(shù)目逐漸減少、纖維化程度不斷加重。術(shù)后14 d時子宮內(nèi)膜纖維性黏連帶逐漸形成,炎性反應出現(xiàn)、纖維化程度最為明顯。免疫組化實驗結(jié)果可見隨著時間的延長,TGF-β1和α-SMA 蛋白表達呈時間依賴性逐漸增加,與子宮內(nèi)膜纖維化程度呈正相關,進一步提示MFB參與子宮內(nèi)膜纖維化的發(fā)生發(fā)展過程。

綜上所述,TGF-β1在子宮內(nèi)膜纖維化中起著重要作用,可能通過激活MFB進一步促進子宮內(nèi)膜纖維化,對其起源及相關信號通路進行進一步研究,可為IUA臨床治療提供新的解決方案。