丙泊酚促進絕經后骨質疏松大鼠血管生成

趙曉琦，董 鑫，劉 聰，任鵬程，張 亮

1.空軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院 麻醉科，陜西 西安 710016；2.西安航天總醫(yī)院 麻醉科，陜西 西安 710100

絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMOP)以骨量減少和骨折風險增加為特征,主要由絕經后雌激素水平降低所致[1]。藥物干預、飲食和生活方式改變是PMOP的常見防治措施。據報道,血管生成與骨代謝間存在特定的“耦合”關系[2],調控骨血管生成可能對于PMOP防治至關重要。丙泊酚是一種靜脈麻醉劑,被廣泛應用于骨科手術,可通過抑制NF-κB受體活化因子配體(nuclear factor κB recep-tor activating factor ligand,RANKL)/骨保護素(osteoprotegerin,OPG)表達軸減弱破骨細胞的生成,從而對骨重塑發(fā)揮有益作用[3-4]。但丙泊酚對PMOP的作用及相關機制尚不清楚。激活Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號通路可促進骨髓間充質干細胞(BMSC)成骨分化,并防止卵巢切除術引起的骨丟失[5]。Wnt/β-catenin信號通路可促進血管生成,加速骨再生[6]。本研究探究丙泊酚對PMOP大鼠血管生成的影響及Wnt/β-catenin信號通路的作用,以期對麻醉藥物在骨丟失和骨折愈合中的作用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物:雌性Wistar大鼠,SPF級,12周齡,未孕,體質量240～260 g(湖南斯萊克景達實驗動物有限公司)[生產許可證號:SCXK(湘)2019-0004]。所有動物實驗程序遵循《實驗動物管理條例》中相關要求。

1.1.2 藥品和試劑:丙泊酚(上海源葉生物科技有限公司);Wnt抑制劑重組人血管內皮抑制素(Endostar)(山東先聲生物制藥有限公司);骨堿性磷酸酶(bone alkaline phosphatase,BALP)、OPG、促血管生成素-1(angiopoietin-1,Ang-1)酶聯免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司);RANKL、血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)ELISA試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司);蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining,HE)染色試劑盒(上海聯邁生物工程有限公司);CD31、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)、Runt相關轉錄因子2(runt-related transcription factor 2,Runx2)、VEGFA、3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體(Abcam公司);Wnt2、磷酸化糖原合酶激酶-3β[phosphorylated glycogen synthase kinase-3,p-GSK-3β(Ser9)]、β-catenin抗體(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分組及處理: 將大鼠分為假手術組、PMOP組(切除雙側卵巢[7])、丙泊酚2.5 mg/kg和5.0 mg/kg組(分別腹腔注射2.5、5.0 mg/kg丙泊酚[8])和丙泊酚(5.0 mg/kg)+Wnt抑制劑(尾靜脈注射2 mg/kg Endostar[9])組,每組10只,1次/周,持續(xù)12周。

1.2.2 ELISA法檢測大鼠血清骨代謝指標水平: 取腹主動脈血4 mL,分離血清。參照各自ELISA試劑盒說明檢測各組大鼠血清中骨代謝指標-BALP、OPG、RANKL及血管生成相關因子VEGF和Ang-1水平。

1.2.3 大鼠股骨骨密度(bone mineral density,BMD)的測定: 處死大鼠后取左側股骨,去除附著的肌肉和結締組織,將股骨置于雙能X射線骨密度儀中,掃描圖像后計算各組大鼠股骨BMD值,以單位面積骨礦物質含量表示(g/cm2)。

1.2.4 HE觀察大鼠骨組織病理:取大鼠右側股骨,置于4%多聚甲醛中固定,脫鈣液中脫鈣,脫水、透明后包埋于石蠟中,切成6 μm厚的冠狀切片,切片脫蠟至水后依次進行蘇木精-伊紅染色。于顯微鏡下觀察大鼠骨組織病理形態(tài)學改變。

1.2.5 免疫組化法檢測大鼠骨組織中CD31陽性表達: 6 μm厚的骨組織切片脫蠟至水后使用3% H2O2滅活內源性酶,在枸櫞酸鹽緩沖液中加熱進行抗原修復,5% BSA室溫封閉30 min,添加一抗(CD31抗體,1∶50)4 ℃孵育過夜,次日添加生物素標記二抗(1∶2 000),37 ℃孵育30 min,添加SABC-POD工作液37 ℃孵育30 min,DAB顯色,蘇木素染核。于顯微鏡下觀察CD31陽性表達情況(CD31陽性表達細胞呈棕黃色或棕褐色)并拍照,每張切片任選5個視野,采用Image-Pro Plus 6.0軟件定量分析平均吸光度(absorbance,A)值,并標準化為假手術組。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 丙泊酚對PMOP大鼠血清BALP、OPG和RANKL水平的影響

與假手術組比較,PMOP組大鼠血清BALP和OPG水平降低(P<0.05),RANKL水平升高(P<0.05);與PMOP組比較,丙泊酚組和丙泊酚+Wnt抑制劑組大鼠血清BALP和OPG水平升高,RANKL水平降低(P<0.05);與丙泊酚5.0 mg/kg組比較,丙泊酚+Wnt抑制劑組大鼠血清BALP和OPG水平降低,RANKL水平升高(P<0.05)(表1)。

表1 各大鼠血清BALP、OPG和RANKL水平Table 1 Serum BALP, OPG and RANKL levels of rats in each group n=10)

2.2 丙泊酚對PMOP大鼠血清VEGF和Ang-1水平的影響

與假手術組比較,PMOP組大鼠血清VEGF和Ang-1水平降低(P<0.05);與PMOP組比較,丙泊酚組和丙泊酚+Wnt抑制劑組大鼠血清VEGF和Ang-1水平升高(P<0.05);與丙泊酚5.0 mg/kg組比較,丙泊酚+Wnt抑制劑組大鼠血清VEGF和Ang-1水平降低(P<0.05)(表2)。

表2 各大鼠血清VEGF和Ang-1水平Table 2 Serum VEGF and Ang-1 levels of rats in each

2.3 丙泊酚對PMOP大鼠股骨BMD的影響

與假手術組比較,PMOP組大鼠股骨BMD降低(P<0.05);與PMOP組比較,丙泊酚組和丙泊酚+Wnt抑制劑組大鼠股骨BMD升高(P<0.05);與丙泊酚5.0 mg/kg組比較,丙泊酚+Wnt抑制劑組大鼠股骨BMD降低(P<0.05)(表3)。

表3 各大鼠股骨BMDTable 3 Femoral BMD of rats in each group

2.4 丙泊酚對PMOP大鼠骨組織病理形態(tài)學的影響

假手術組大鼠骨組織結構、形態(tài)未見明顯異常;PMOP組大鼠骨小梁不完整、斷裂、變細且數量減少,髓腔明顯擴大;丙泊酚組和丙泊酚+Wnt抑制劑組大鼠上述病理形態(tài)學改變較PMOP組均有所改善,且丙泊酚高劑量組改善更為明顯;與丙泊酚5.0 mg/kg組比較,丙泊酚+Wnt抑制劑組大鼠骨組織病理形態(tài)學改變加重(圖1)。

圖1 HE觀察各大鼠骨組織病理形態(tài)學(HE染色)Fig 1 Bone histomorphology of rats in each group(HE staining)

2.5 丙泊酚對PMOP大鼠骨組織中CD31陽性表達的影響

與假手術組比較,PMOP組大鼠骨組織中CD31陽性表達降低(P<0.05);與PMOP組比較,丙泊酚組和丙泊酚+Wnt抑制劑組大鼠骨組織中CD31陽性表達升高(P<0.05);與丙泊酚5.0 mg/kg組比較,丙泊酚+Wnt抑制劑組大鼠骨組織中CD31陽性表達降低(P<0.05)(圖2、表4)。

圖2 免疫組化法檢測各大鼠骨組織中CD31陽性表達Fig 2 Positive expression of CD31 in bone tissue of rats in each group was detected by immunohistochemistry

表4 各大鼠骨組織中CD31陽性表達Table 4 Positive expression of CD31 in bone tissue of rats in each group

2.6 丙泊酚對PMOP大鼠骨組織中BMP-2、Runx2、VEGFA、CD31蛋白表達的影響

與假手術組比較,PMOP組大鼠骨組織中BMP-2、Runx2、 VEGFA、 CD31蛋白表達降低(P<0.05);與PMOP組比較,丙泊酚組和丙泊酚+Wnt抑制劑組大鼠骨組織中BMP-2、Runx2、VEGFA、CD31蛋白表達升高(P<0.05);與丙泊酚5.0 mg/kg組比較,丙泊酚+Wnt抑制劑組大鼠骨組織中BMP-2、Runx2、VEGFA、CD31蛋白表達降低(P<0.05)(圖3、表5)。

圖3 Western blot法檢測各大鼠骨組織中BMP-2、Runx2、VEGFA、CD31蛋白表達Fig 3 BMP-2, Runx2, VEGFA, CD31 protein expression in bone tissue of rats in each group by Western blot

表5 各大鼠骨組織中BMP-2、Runx2、VEGFA、CD31蛋白表達Table 5 BMP-2, Runx2, VEGFA and CD31 protein expression in bone tissue of rats in each group

2.7 丙泊酚對PMOP大鼠骨組織中Wnt2、p-GSK-3β、β-catenin蛋白表達的影響

與假手術組比較,PMOP組大鼠骨組織中Wnt2、p-GSK-3β、β-catenin蛋白表達降低(P<0.05);與PMOP組比較,丙泊酚組和丙泊酚+Wnt抑制劑組大鼠骨組織中Wnt2、p-GSK-3β、β-catenin蛋白表達升高(P<0.05);與丙泊酚5.0 mg/kg組比較,丙泊酚+Wnt抑制劑組大鼠骨組織中Wnt2、p-GSK-3β、β-catenin蛋白表達降低(P<0.05)(圖4、表6)。

表6 各大鼠骨組織中Wnt2、p-GSK-3β、β-catenin蛋白表達Table 6 Wnt2, p-GSK-3β and β-catenin protein expression in bone tissue of rats in each group

3 討論

骨形成標志物BALP、OPG和骨吸收標志物RANKL,與骨吸收、骨形成能力密切相關[10]。本研究通過構建大鼠PMOP模型,發(fā)現其血清RANKL水平升高,血清BALP、OPG水平及骨組織中BMP-2、Runx2蛋白表達降低, 而給予丙泊酚維持麻醉后,PMOP模型大鼠血清及骨組織中上述指標得到改善,且骨組織病理形態(tài)學改變有所改善,表明丙泊酚可在一定程度上調節(jié)PMOP大鼠骨代謝失衡,促進骨形成,減少骨吸收,延緩骨量丟失,增加BMD,改善骨組織形態(tài)。

VEGFA是血管發(fā)生和血管生成中重要的調控因子,Ang-1、CD31分別是重要的促血管再生因子和血管新生因子,3者均在骨質疏松癥防治中發(fā)揮重要作用[11-12]。本研究中,丙泊酚維持麻醉的PMOP模型大鼠血清Ang-1水平及骨組織中CD31陽性表達和VEGFA、CD31蛋白表達均升高,表明一定濃度范圍內的丙泊酚可促進PMOP大鼠血管生成,提示丙泊酚可能通過提高骨血管再生和成骨分化能力增加BMD,進而發(fā)揮抗PMOP作用。

Wnt/β-catenin通路參與調節(jié)PMOP骨血管生成,Wnt與其受體結合增強GSK-3β Ser9磷酸化,促進β-catenin向細胞核內轉移,調節(jié)下游靶基因的轉錄和翻譯,進而維持細胞存活、分化等生物學過程[13-14]。本研究結果顯示,PMOP模型大鼠骨組織中Wnt2、p-GSK-3β、β-catenin蛋白表達降低,使用丙泊酚維持麻醉可升高PMOP模型大鼠骨組織中Wnt2、p-GSK-3β、β-catenin蛋白表達,表明丙泊酚可能通過激活骨組織中Wnt/β-catenin信號通路促進PMOP大鼠血管生成,調節(jié)骨代謝。進一步研究發(fā)現Wnt抑制劑不僅能夠抑制Wnt/β-catenin信號通路激活,而且減弱了丙泊酚對PMOP大鼠血管生成和骨代謝調節(jié)、骨組織形態(tài)的改善作用。這些結果提示丙泊酚可能是通過激活骨組織中Wnt/β-catenin信號通路實現的。

綜上所述,本研究證實丙泊酚可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進PMOP大鼠血管生成,調節(jié)骨代謝,進而發(fā)揮抗PMOP作用。本研究為麻醉藥物在骨丟失和骨折愈合中的應用提供了一定理論依據,但目前類似研究仍較少,后續(xù)研究將通過設置不同劑量組丙泊酚并使用自然絕經骨質疏松大鼠更加詳細探究其作用效果及機制。