敲減抗增殖蛋白2促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549凋亡

張 婧，楊自更，韋紅梅，寧海虹，薛茜茜，金 玲，吳 賓*

新疆軍區(qū)總醫(yī)院 1.營(yíng)養(yǎng)科；2.核醫(yī)學(xué)科；3.衛(wèi)勤訓(xùn)練中心；4.老年醫(yī)學(xué)科，新疆 烏魯木齊 830000

肺癌是一種日益嚴(yán)重的公共健康問題,全球每年有220萬人被診斷為肺癌,有180萬人死于肺癌[1-3]。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占所有肺癌病例的85%以上[4]。目前影響NSCLC惡性表型關(guān)鍵分子的相關(guān)研究仍然有限,亟需尋找新靶點(diǎn)以改善NSCLC的診療現(xiàn)狀。

抗增殖蛋白2(prohibitin 2,PHB2)是一種高度保守的胚胎蛋白,參與了細(xì)胞生存、代謝和凋亡等許多重要的細(xì)胞生物學(xué)過程[5]。前期研究發(fā)現(xiàn),敲低PHB2可促進(jìn)NSCLC細(xì)胞系的凋亡[6],然而敲低PHB2誘發(fā)細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚不清楚。在人宮頸癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞中,敲低PHB2可通過誘導(dǎo)線粒體斷裂促進(jìn)HeLa細(xì)胞凋亡[7],而PHB2是否通過調(diào)控線粒體動(dòng)力學(xué)進(jìn)一步影響NSCLC細(xì)胞系的凋亡尚不清楚。本研究通過慢病毒感染A549細(xì)胞建立敲減PHB2的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,探索抑制PHB2促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡的新機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549(上海細(xì)胞庫(kù));胎牛血清、細(xì)胞培養(yǎng)基(RPMI 1640)(BI公司);RIPA裂解液、5×loading buffer、蛋白酶/磷酸酶抑制劑、BCA試劑盒、ATP含量檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);蛋白Marker(北京普利萊生物技術(shù)有限公司);TUNEL試劑盒(Roche公司);MitoTracker熒光探針(Thermo Fisher Scientific公司);檸檬酸合酶檢測(cè)試劑盒(Sigma-Aldrich生物科技公司);細(xì)胞色素c定量檢測(cè)試劑盒(R&D生物公司);PHB2抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司);動(dòng)力相關(guān)蛋白1(dynamin-related protein 1,DRP1)抗體(Santa Cruz公司);p-DRP1(Thr183/Thr185)抗體、HRP標(biāo)記的二抗(CST公司)。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒感染建立敲減PHB2的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株:依托吉瑪公司設(shè)計(jì)合成了兩個(gè)敲減PHB2的慢病毒(分別為shPHB2#1和shPHB2#2)及對(duì)照病毒(shCtrl),常規(guī)進(jìn)行慢病毒感染。按預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索的MOI值,嘌呤霉素篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。

1.2.2 細(xì)胞的分組及處理:慢病毒感染A549細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)分組:對(duì)照組(shCtrl),PHB2敲減組#1(shPHB2#1), PHB2敲減組#2(shPHB2#2);DRP1抑制劑Mdivi-1(25 μmol/L)處理敲減PHB2的A549穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,實(shí)驗(yàn)分為:shCtrl組、shCtrl+Mdivi-1組,shPHB2#1組,shPHB2#2組,shPHB2#1+Mdivi-1組,shPHB2#2+Mdivi-1組。

1.2.3 TUNEL測(cè)定細(xì)胞凋亡:細(xì)胞用4%的甲醛固定,加入通透液,作用10 min。加入TUNEL工作液,避光,37 ℃孵育1 h,DAPI染核。甘油封片,鏡下觀察,拍照并保存圖片。

1.2.4 MitoTracker染色觀察線粒體形態(tài):按照說明書配置熒光探針工作液,37 ℃的條件下孵育30 min,鏡下觀察各組細(xì)胞的線粒體形態(tài)。

1.2.5 Western blot測(cè)定蛋白質(zhì)表達(dá)量:常規(guī)提取蛋白質(zhì),BCA法定量。按照每孔40 μg蛋白質(zhì)上樣,濃縮膠電泳條件:60～70 V,30 min;分離膠電泳條件:120～130 V,90 min。轉(zhuǎn)膜條件:200～280 mA,1.5～2.5 h。牛奶封閉,孵一抗過夜,次日孵二抗,ECL發(fā)光,保存圖片。

1.2.6 Annexin V-FITC/PI雙染流式實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞凋亡:取對(duì)數(shù)增殖期的細(xì)胞,用含EDTA的胰蛋白酶消化,1 000 r/min,離心,倒到培養(yǎng)基。預(yù)冷的PBS緩沖液洗3遍。細(xì)胞重懸,計(jì)數(shù),加入適量的FITC標(biāo)記的annexin V和PI染色液孵育20 min。上機(jī),選取通道,分析細(xì)胞凋亡率。

1.2.7 ATP含量、檸檬酸合酶活性及細(xì)胞色素c含量的測(cè)定:按說明書步驟進(jìn)行操作,檢測(cè)相應(yīng)指標(biāo)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 慢病毒感染A549細(xì)胞建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株

與shCtrl組相比,shPHB2組PHB2的蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)(圖1)。

A, B.representative immunoblots and densitometric quantification for PHB2 and β-actin in A549 cells with stable knockdown of PHB2; *P<0.05 compared with shCtrl.圖1 各組PHB2蛋白表達(dá)的比較Fig 1 Comparison of PHB2 expression among different groups n=3)

2.2 敲低PHB2促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡

與shCtrl組相比,shPHB2組TUNEL陽性的細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P<0.05)(圖2B),annexin V/PI染色顯示凋亡率顯著增加(P<0.05)(圖2D)。

A, B.representative images of the TUNEL assay and quantitative analysis of the apoptotic index for A549 cells with stable PHB2 knockdown;C, D.representative flow cytometry plots of annexin V and PI double staining and quantification of apoptosis for A549 cells with stable PHB2 knockdown; *P<0.05 compared with shCtrl.圖2 各組細(xì)胞凋亡情況的比較Fig 2 Comparison of apoptotic index among different groups n=3)

2.3 敲低PHB2引發(fā)A549細(xì)胞線粒體功能受損

與shCtrl組相比,shPHB2組ATP含量減少(P<0.05),檸檬酸合酶活性降低(P<0.05),線粒體內(nèi)細(xì)胞色素c減少(P<0.05),細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞色素c增加(P<0.05)(圖3)。

A, B.ATP content and citrate synthase (CS) in mitochondria isolated from A549 cells from the respective groups;C.levels of cytochrome c in cytosolic and mitochondrial fractions from the respective groups; *P<0.05 compared with shCtrl group.圖3 各組ATP含量、檸檬酸合酶活性、細(xì)胞色素c水平的比較Fig 3 Comparison of ATP content, CS activity and cytochrome c content among different groups n=3)

2.4 敲低PHB2促進(jìn)A549細(xì)胞線粒體分裂

與shCtrl組相比,shPHB2組線粒體長(zhǎng)度變短(P<0.05),線粒體分裂顯著增加,p-DRP1表達(dá)顯著增加(P<0.05)(圖4)。

2.5 Mdivi-1可減輕敲低PHB2引發(fā)的A549細(xì)胞線粒體分裂

與shPHB2組相比,shPHB2+Mdivi-1組線粒體長(zhǎng)度顯著增加(P<0.05),線粒體分裂程度減輕(圖5)。

A.representative confocal images of mitochondrial morphology subjected to different treatments were detected by MitoTrackerTM Red CMXRos probe in A549 cells.B.quantification of mitochondrial length in A549 cells from the respective groups reflecting the levels of mitochondrial division; *P<0.05 compared with shCtrl; #P<0.05 compared with shPHB2#1; ΔP<0.05 compared with shPHB2#2.圖5 各組線粒體形態(tài)的比較Fig 5 Comparison of mitochondrial morphology among different groups n=3)

2.6 Mdivi-1可減輕敲低PHB2引發(fā)的A549細(xì)胞凋亡

與shPHB2組相比,shPHB2 +Mdivi-1組TUNEL陽性的細(xì)胞數(shù)量顯著減少,凋亡率顯著降低(P<0.05)(圖6)。

2.7 Mdivi-1可減輕敲低PHB2引發(fā)的A549細(xì)胞線粒體功能受損

與shPHB2組相比,shPHB2+Mdivi-1組ATP含量增加(P<0.05),檸檬酸合酶活性增加(P<0.05),線粒體內(nèi)細(xì)胞色素c增加(P<0.05),細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞色素c的減少(P<0.05)(圖7)。

A, B.ATP content and citrate synthase (CS) in mitochondria isolated from A549 cells from the respective groups;C.levels of cytochrome c in cytosolic and mitochondrial fractions from the respective groups; *P<0.05 compared with shCtrl; #P<0.05 compared with shPHB2#1; ΔP<0.05 compared with shPHB2#2.圖7 各組ATP含量、檸檬酸合酶活性、細(xì)胞色素c水平的比較Fig 7 Comparison of ATP content, CS activity and cytochrome c content among different groups n=3)

3 討論

越來越多的證據(jù)顯示,PHB2作為促癌因子通過不同途徑參與腫瘤增殖和誘發(fā)凋亡的病理生理過程[8-10]。前期研究發(fā)現(xiàn),PHB2表達(dá)與NSCLC腫瘤分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期具有相關(guān)性,同時(shí)PHB2的蛋白表達(dá)影響NSCLC的生物學(xué)行為。過表達(dá)PHB2可促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,而敲低PHB2可抑制NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲及促進(jìn)細(xì)胞凋亡[6]。本研究發(fā)現(xiàn),敲減PHB2可促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡,這與前期研究結(jié)論相一致[6]。

在HeLa細(xì)胞中,敲低PHB2可通過下調(diào)抗凋亡因子Hax-1和誘導(dǎo)線粒體斷裂,從而誘發(fā)caspase依賴的凋亡[7],這提示PHB2可能通過調(diào)控線粒體動(dòng)力學(xué)進(jìn)而誘發(fā)內(nèi)源性的細(xì)胞凋亡。線粒體動(dòng)力學(xué)是線粒體裂變和融合的重要過程,融合和裂變必須平衡才能實(shí)現(xiàn)有效的內(nèi)容交換,而異常的線粒體動(dòng)力學(xué)已被證明與癌、衰老、糖尿病等密切相關(guān)[11-13]。 特別是線粒體分裂已經(jīng)被認(rèn)為是腫瘤中線粒體介導(dǎo)凋亡的重要調(diào)控上游因子[12]。線粒體分裂可導(dǎo)致早期線粒體功能障礙,進(jìn)一步引發(fā)線粒體生物學(xué)紊亂、細(xì)胞色素c釋放、caspase酶激活和凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)[11]。本研究發(fā)現(xiàn),敲低PHB2導(dǎo)致線粒體分裂增加,同時(shí)ATP含量減少,檸檬酸合酶活性降低,細(xì)胞色素c由線粒體向細(xì)胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)移,說明敲低PHB2可促進(jìn)線粒體分裂進(jìn)一步引發(fā)線粒體生物學(xué)紊亂和凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng),這與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[11]。

DRP1是線粒體分裂的一個(gè)主要調(diào)控因子,它由高度保守的鳥苷三磷酸酶(guanylate triphos-phatase,GTPases)調(diào)控[14]。DRP1主要存在于細(xì)胞質(zhì)中,DRP1(Ser616)磷酸化導(dǎo)致DRP1激活,DRP1由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到線粒體表面,進(jìn)一步介導(dǎo)線粒體分裂[15]。本研究發(fā)現(xiàn),敲低PHB2導(dǎo)致DRP1磷酸化增加,而Mdivi-1可逆轉(zhuǎn)敲PHB2引發(fā)的A549細(xì)胞凋亡,提示Mdivi-1可能通過抑制DRP1介導(dǎo)的線粒體分裂來改善線粒體生物學(xué)紊亂,抑制線粒體途徑的凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng),這與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[14]。

綜上所述,抑制PHB2促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能與激活了DRP1介導(dǎo)的線粒體分裂有關(guān)。PHB2/DRP1信號(hào)通路可能是NSCLC治療的重要新靶點(diǎn),本研究為PHB2用于NSCLC治療藥物研發(fā)提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。