PPARα缺失加重乙醇誘導(dǎo)的小鼠胃黏膜慢性損傷

胡 曉，郭 然，張旭光

1.河北醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病理生理學(xué)教研室，河北 石家莊 050017；2.河北醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 普外三科，河北 石家莊 050004；3.日本信州大學(xué)醫(yī)學(xué)部 代謝調(diào)控學(xué)研究室，日本 松本 390-0803

乙醇是各類飲用酒的主要成分,進(jìn)入體內(nèi)后部分通過胃黏膜擴(kuò)散吸收,但濃度過大或停留時間過長均可導(dǎo)致胃黏膜屏障功能受損[1]。長期攝入乙醇會刺激黏膜下血管內(nèi)皮損傷和中性粒細(xì)胞的活化,引起胃黏膜內(nèi)炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子的釋放水平升高,促進(jìn)胃內(nèi)慢性炎性反應(yīng)的發(fā)生[2]。近年來中國酒類產(chǎn)量和飲酒人群的比例逐年增加,酒精相關(guān)性胃炎的發(fā)病率也是居高不下[3]。

過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator-activating receptor α, PPARα)屬于核受體轉(zhuǎn)錄因子超家族的成員,在脂質(zhì)氧化、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能[4]。有文獻(xiàn)指出PPARα的激活在調(diào)節(jié)腸道炎性反應(yīng)、提高腸黏膜抗氧化能力等方面發(fā)揮了顯著的調(diào)控作用[5]。在PPARα基因敲除小鼠構(gòu)建的慢性酒精性肝損傷模型研究中發(fā)現(xiàn),PPARα缺失可導(dǎo)致乙醇誘導(dǎo)的肝內(nèi)脂肪蓄積程度加重,造成更嚴(yán)重的肝內(nèi)炎性損傷[6]。PPARα在胃黏膜內(nèi)也有表達(dá),但在酒精持續(xù)損傷胃黏膜的過程中,PPARα是否能夠發(fā)揮抗損傷效應(yīng)尚不清楚。因此,長期攝入乙醇的情況下,通過觀察PPARα的缺失是否會加重胃黏膜損傷,有助于闡明PPARα在胃內(nèi)是否發(fā)揮保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑及試劑盒:Lieber-DeCarli液體飼料(日本東方酵母工業(yè)株式會社);腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)ELISA檢測試劑盒,丙二醛(malondialdehyde, MDA)比色法定量檢測試劑盒(OxisResearch公司);總RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒和RT-PCR(SYBR Green)Pre-Mix試劑(Takara公司);抗NF-κB-p65抗體(Cell Signaling Technology公司);Histone H1抗體(Santa Cruz Biotechnology公司);堿性磷酸酶標(biāo)記的IgG二抗(Jackson ImmunoResearch公司);細(xì)胞核蛋白提取試劑盒,BCA蛋白定量試劑盒和1-StepTMNBT/BCIP 底物溶液(Thermo Fisher公司)。

1.1.2 動物:SPF級Sv129品系的野生型小鼠和PPARα敲除型小鼠各10只[7],飼養(yǎng)于日本信州大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 動物的分組及處理:將小鼠分為野生型對照飲食組(WT-Con,n=4)、野生型乙醇飲食組(WT-EtOH,n=6)、PPARα敲除型對照飲食組(KO-Con,n=4)和PPARα敲除型乙醇飲食組(KO-EtOH,n=6)。WT-EtOH組和KO-EtOH組給予含4%乙醇的Lieber-DeCarli液體飼料,WT-Con組和KO-Con組則同時給予對照Lieber-DeCarli液體飼料。對于小鼠的飼養(yǎng)和實驗方式遵循美國國立衛(wèi)生研究院頒布的《實驗動物護(hù)理和使用指南》,經(jīng)日本信州大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物實驗指導(dǎo)方針研究委員會批準(zhǔn)。飼養(yǎng)期間各組小鼠自由攝食,無意外死亡情況。飼養(yǎng)16周后,取胃組織。

1.2.2 HE染色檢查胃組織病理學(xué):采用5%多聚甲醛固定小鼠胃組織,24 h后常規(guī)石蠟包埋,制作厚度為5 μm的切片。采用常規(guī)HE染色,使用中性膠封片,制成病理切片。通過光學(xué)顯微鏡觀察胃組織形態(tài)學(xué)病理變化。

1.2.3 ELISA檢測血清的TNF-α和IL-1β水平:取小鼠腹主動脈血液樣本1.5 mL,在4 ℃、3 000 r/min離心15 min,取上清液。按照制造商的說明,用ELISA試劑盒測定血清中TNF-α和IL-1β的水平。

1.2.4 血清及胃組織中MDA的檢測:取小鼠腹主動脈血液樣本1.5 mL,在4 ℃、3 000 r/min離心15 min,取上清液。取小鼠胃組織稱重,按質(zhì)量(g)∶體積(mL)=1∶9加入預(yù)冷生理鹽水,機械勻漿后,3 500 r/min離心15 min,吸取上清液制備成組織勻漿。制造商的試劑盒說明,測定血清及組織勻漿中MDA的含量。MDA在血清中的含量表示為μmol/L,在胃組織勻漿中的含量表示為nmol/g。

1.2.5 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測胃組織內(nèi)炎性相關(guān)基因,TNF-α、IL-1β和細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)的表達(dá):取小鼠胃組織在液氮條件下研磨成組織勻漿。采用TRIzol法提取組織勻漿內(nèi)總RNA,并測定RNA濃度和純度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書嚴(yán)格操作,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)合成cDNA。實時熒光定量PCR反應(yīng)嚴(yán)格按照試劑說明書配置反應(yīng)體系,充分混勻放入實時熒光定量PCR儀,擴(kuò)增條件為:95 ℃變性15 s,60 ℃退火/延伸30 s,延伸階段采取熒光值,于40個循環(huán)后進(jìn)行熔解曲線分析。GADPH作為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt法分析各個檢測基因的相對表達(dá)量。引物序列GADPH正向: 5′-TGCACCACCAACTGCTTAG-3′,反向:5′-GGATGCAG GGATGATGTTCTG-3′; TNF-α正向:5′-CCACCACGC TCTTCTGTCTAC-3′,反向:5′-AGGGTCTGGGCCATA GAACT-3′; IL-1β正向:5′-TGAAGCAGCTATGG CAACTG-3′,反向:5′-AGGTCAAAGGTTTGGAAGC A-3′;ICAM-1正向:5′-ACCCAC CTCACAGGGTACT T-3′,反向:5′-CCAGGTGAGGAC CATATAGCAC-3′。

1.2.6 Western blot法檢測胃組織內(nèi)NF-κB通路相關(guān)蛋白的表達(dá):在液氮條件下,取小鼠胃組織制備成組織勻漿。使用試劑盒提取組織勻漿中的核蛋白,并采用BCA法對蛋白濃度進(jìn)行定量分析。每孔加入30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE后并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,用5%的脫脂奶粉進(jìn)行封閉,之后分別加入兔源抗p65一抗在4 ℃孵育過夜。經(jīng)TBST洗滌3次,加入堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗,室溫孵育1 h。經(jīng)TBST洗滌3次,使用NBT/BCIP底物溶液顯影并得到蛋白條帶。Histone H1作為內(nèi)參蛋白,使用Image J軟件對各個條帶的吸光度值進(jìn)行分析,計算蛋白的相對表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 PPARα缺失加重乙醇飲食組小鼠的胃黏膜組織損傷

WT-Con組和KO-Con組小鼠的胃黏膜上皮完整,腺體規(guī)則。WT-EtOH組小鼠偶可見上皮細(xì)胞丟失和少量炎性細(xì)胞浸潤。但KO-EtOH組小鼠的胃黏膜上皮層出現(xiàn)明顯缺損和水腫,胃小凹消失,固有層內(nèi)腺體結(jié)構(gòu)異常,出現(xiàn)大量腫脹透明的退化細(xì)胞,黏膜全層均出現(xiàn)大量的炎性細(xì)胞浸潤(圖1)。

圖1 各組小鼠胃組織病理學(xué)改變(HE染色)Fig 1 Changes of mouse gastric tissue pathology in each group (HE staining)

2.2 PPARα缺失增加乙醇飲食組小鼠血清中TNF-α和IL-1β的水平

KO-Con組與WT-Con組小鼠相比, TNF-α和IL-1β的含量無顯著變化;與WT-Con組相比,WT-EtOH組小鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量顯著增高(P<0.001);與KO-Con組相比,KO-EtOH組小鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量顯著增高(P<0.001);相較于WT-EtOH組,KO-EtOH組小鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量進(jìn)一步顯著升高(P<0.05)(圖2)。

#P<0.001 compared with WT-Con group; *P<0.05 compared with WT-EtOH group;ΔP<0.001 compared with KO-Con group.圖2 KO-EtOH組小鼠血清中TNFα和IL-1β的含量增多Fig 2 Increased content of TNFα and IL-1β in serum of PPARα-knockout mice in ethanol-diet group

2.3 PPARα缺失增強乙醇飲食組小鼠胃組織內(nèi)的脂質(zhì)過氧化水平

KO-Con組與WT-Con組小鼠相比,MDA水平無明顯變化;與WT-Con組相比,WT-EtOH組小鼠血清和胃組織中MDA的含量明顯增高(P<0.01);與KO-Con組相比,KO-EtOH組小鼠血清和胃組織中MDA的含量明顯增高(P<0.001);相較于WT-EtOH組,KO-EtOH組小鼠血清和胃組織中的MDA含量均進(jìn)一步明顯升高(P<0.05)(圖3)。

#P<0.01, ##P<0.001 compared with WT-Con group; *P<0.05,**P<0.01 compared with WT-EtOH group;ΔP<0.001compared with KO-Con group.圖3 KO-EtOH組小鼠血清和胃組織中MDA的含量增多Fig 3 Increased content of MDA in serum and stomach of PPARα-knockout mice in ethanol-diet group

2.4 PPARα缺失上調(diào)乙醇飲食組小鼠胃組織內(nèi)的炎性相關(guān)因子的mRNA表達(dá)水平

KO-Con組與WT-Con組相比,小鼠胃組織中炎性相關(guān)因子的mRNA表達(dá)水平無明顯變化;與WT-Con組相比,WT-EtOH組小鼠胃組織中TNF-α、IL-1β和ICAM-1的mRNA表達(dá)水平顯著增高(P<0.01);與KO-Con組相比,KO-EtOH組小鼠胃組織中TNF-α、IL-1β和ICAM-1的mRNA表達(dá)水平顯著增高(P<0.001);相較于WT-EtOH組,KO-EtOH組小鼠胃組織中TNF-α、IL-1β和ICAM-1的mRNA表達(dá)水平均進(jìn)一步顯著增高(P<0.05)(圖4)。

#P<0.01, ##P<0.001 compared with WT-Con group; *P<0.05, **P<0.01 compared with WT-EtOH group;ΔP<0.001 compared with KO-Con group.圖4 KO-EtOH組小鼠胃組織中炎性相關(guān)因子的mRNA表達(dá)水平上調(diào)Fig 4 Elevated mRNA expression levels of inflammatory factors in gastric tissue of PPARα-knockout mice in ethanol-diet group

2.5 PPARα缺失引起乙醇飲食組小鼠胃組織NF-κB通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平升高

與WT-Con組相比,KO-Con組和WT-EtOH組小鼠的胃組織中的胞核p65蛋白表達(dá)水平均明顯上調(diào)(P<0.05;P<0.01); KO-EtOH組與KO-Con組相比,小鼠胃組織中的胞核p65蛋白表達(dá)水平無明顯變化;相較于WT-EtOH組,KO-EtOH組小鼠胃組織中的胞核p65蛋白的表達(dá)水平進(jìn)一步明顯升高(P<0.01)(圖5)。

#P<0.05, ##P<0.01 compared with WT-Con group; *P<0.01 compared with WT-EtOH group.圖5 KO-EtOH組小鼠胃組織中的核p65蛋白表達(dá)水平上調(diào)Fig 5 Elevated protein expression levels of nuclear p65 in gastric tissue of PPARα-knockout mice in ethanol-diet group

3 討論

在長期喂飼乙醇的PPARα敲除小鼠模型中觀察到,缺失PPARα的小鼠胃黏膜出現(xiàn)更為嚴(yán)重的組織學(xué)改變及炎性浸潤,血中和胃組織中的炎性因子TNF-α、IL-1β及ICAM-1的轉(zhuǎn)錄和釋放增多,胃內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強,其機制可能與PPARα的缺失引起胃內(nèi)NF-κB信號通路激活有關(guān)。上述實驗結(jié)果證明,缺失PPARα?xí)又匾掖颊T導(dǎo)的胃黏膜慢性損傷。

長期頻繁接觸乙醇可破壞胃黏膜屏障,誘導(dǎo)炎性細(xì)胞的聚集和活化,引發(fā)炎性反應(yīng)[2,8]。既往研究發(fā)現(xiàn),TNF-α、IL-1β和ICAM-1可通過誘導(dǎo)炎性細(xì)胞的活化和遷移,介導(dǎo)中性粒細(xì)胞在血管內(nèi)皮的黏附等方式促進(jìn)乙醇誘導(dǎo)的胃黏膜炎性反應(yīng)啟動和放大[9-10]。PPARα在諸多病理模型中的抗炎性損傷作用已被證實。在酒精性肝病小鼠模型中,小鼠肝內(nèi)僅部分表達(dá)PPARα即可下調(diào)TNF-α和IL-1β的表達(dá)水平,肝臟病理損傷也相對減輕[11];PPARα激動劑可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞過表達(dá)ICAM-1[12]。根據(jù)實驗結(jié)果顯示,長期攝入乙醇引起小鼠血中TNF-α含量明顯增多,而缺失PPARα則引起血中TNF-α和IL-1β進(jìn)一步增多,并引起胃組織中TNF-α、IL-1β和ICAM-1的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)一步增強。有文獻(xiàn)指出,PPARα能夠抑制NF-κB亞單位RelA(p65)的轉(zhuǎn)導(dǎo)活性從而抑制NF-κB信號通路,降低下游炎性因子的表達(dá)[4]。上述機制在實驗結(jié)果中也得以體現(xiàn):缺失PPARα引起細(xì)胞核內(nèi)p65的表達(dá)明顯上調(diào)。這些結(jié)果說明,缺失PPARα可導(dǎo)致胃內(nèi)NF-κB信號通路活化,進(jìn)而引起TNF-α、IL-1β和ICAM-1的表達(dá)和釋放增多。

乙醇刺激氧自由基生成過多,進(jìn)而誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化損傷也是發(fā)病的關(guān)鍵因素[13-14]。而PPARα可以通過增強線粒體能量代謝的方式對抗過氧化損傷[15]。通過實驗結(jié)果可見,乙醇喂養(yǎng)的PPARα敲除組小鼠的血中和胃內(nèi)MDA含量明顯升高,提示PPARα的缺失引起胃黏膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強。

綜上所述,缺少PPARα引起乙醇誘導(dǎo)的胃黏膜慢性損傷加重,其機制可能與缺少PPARα導(dǎo)致NF-κB信號通路激活,進(jìn)而激活炎性反應(yīng)和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有關(guān)。這些研究為后續(xù)探討PPARα外源性激動劑治療酒精性胃黏膜損傷的可能性提供了理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。