固態(tài)食醋自然發(fā)酵醋醅中生淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選及初步應(yīng)用

康雪梅,羅雯,郭建,孫群

(1.四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,成都 610064;2.千禾味業(yè)食品股份有限公司,四川 眉山 625000)

中國(guó)傳統(tǒng)谷物醋是以生谷物為原料,大曲等為發(fā)酵劑,在開放式環(huán)境中發(fā)酵而成,其中涉及多菌種及多酶系的相互作用,多菌種混合發(fā)酵賦予谷物醋豐富且協(xié)調(diào)的風(fēng)味與口感[1-4]。固態(tài)食醋發(fā)酵過程中,微生物菌群的代謝網(wǎng)絡(luò)表明曲霉(Aspergillus)、根霉(Rhizopus)、紅曲(Monascus)是食醋大曲中主要的真菌,釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和漢遜酵母(Hansenulaanomala)是酒精發(fā)酵階段的主要酵母菌,醋酸菌屬(Acetobacter)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、葡糖醋桿菌屬(Gluconacetobacer)和芽孢桿菌屬(Bacillus)是食醋風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生的核心功能菌群,在醋的優(yōu)勢(shì)風(fēng)味物質(zhì)形成中起著重要作用[5-7]。

選育獲取優(yōu)良性能的功能微生物并進(jìn)行強(qiáng)化生產(chǎn),可促進(jìn)食醋發(fā)酵生產(chǎn)提高生產(chǎn)效率,降低成本,改善品質(zhì)。在食醋醋醅中添加A.pasteurianusG3-2、L.brevis4-22、L.fermentumM10-3和L.buchneriF2-5,可以原位增強(qiáng)食醋菌群的產(chǎn)乙偶姻功能[6]。在醋酸發(fā)酵開始時(shí)添加內(nèi)源巴氏桿菌,可以增強(qiáng)鎮(zhèn)江香醋的風(fēng)味,縮短了醋酸發(fā)酵周期,提高了總酸、2,3-丁二醇和川芎嗪的積累[8]。在保寧醋生產(chǎn)中,使用黑曲霉進(jìn)行強(qiáng)化制曲,可使原料利用率及有機(jī)酸含量得到提高[9-10]。將食醋醋醅中非常豐富的物種KomagataeibactereuropaeusJNP1篩選出來(lái)并強(qiáng)化應(yīng)用到食醋發(fā)酵中,可使食醋總酸提升14.78%,還原糖降低40.38%,促進(jìn)食醋出醋率的提升[11]。

本文從自然發(fā)酵醋醅中篩選獲取同時(shí)產(chǎn)生淀粉酶及蛋白酶的菌株,驗(yàn)證其在酸性條件下的生長(zhǎng)性能及酶活性能,并將其初步強(qiáng)化應(yīng)用到食醋發(fā)酵過程中,為固態(tài)食醋發(fā)酵生產(chǎn)的降本增效及風(fēng)味改善提供了新的改善思路。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

千禾味業(yè)食品股份有限公司食醋生產(chǎn)車間發(fā)酵周期為1～24 d的自然發(fā)酵狀態(tài)下的固態(tài)醋醋醅樣品共24個(gè),用無(wú)菌采樣袋采樣后存放于4 ℃冰箱中備用。

18種氨基酸標(biāo)品(均為色譜純):購(gòu)自Sigma公司;7種有機(jī)酸標(biāo)品(均為色譜純):購(gòu)自J &K公司、Aladdin等試劑官網(wǎng);其他化學(xué)試劑:均為分析純。

1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基:可溶性淀粉20 g/L,酵母粉5 g/L,蛋白胨10 g/L,Na2HPO40.5 g/L,K2HPO40.5 g/L,溶劑為蒸餾水。

初篩培養(yǎng)基:富集培養(yǎng)基內(nèi)添加瓊脂20 g/L。

復(fù)篩培養(yǎng)基:生玉米淀粉20 g/L,酵母粉5 g/L,蛋白胨10 g/L,Na2HPO40.5 g/L,K2HPO40.5 g/L,瓊脂20 g/L,溶劑為蒸餾水,其中生玉米淀粉單獨(dú)稱取到稱量瓶中,107 ℃烘箱干熱滅菌2 h后,在使用前加入到滅菌后的培養(yǎng)基中,混勻后傾倒平板。

醬油培養(yǎng)基:醬油原油50 g/L(氨基酸態(tài)氮大于1.2 g/dL),葡萄糖 20 g/L,溶劑為蒸餾水。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 生淀粉酶產(chǎn)生菌篩選

稱取100 g醋醅樣品于1 000 mL 0.85%的生理鹽水中混合均勻并過濾得到清液,取1 mL至富集培養(yǎng)基中,30 ℃、150 r/min培養(yǎng)2～3 d,并進(jìn)行3輪連續(xù)富集培養(yǎng)。將富集完成的菌液梯度稀釋后涂布于初篩培養(yǎng)基平板,35 ℃培養(yǎng)12～48 h后,挑選具有明顯水解透明圈生成的菌落,得到淀粉酶產(chǎn)生菌,進(jìn)行保存。同時(shí)點(diǎn)種至復(fù)篩培養(yǎng)基平板,35 ℃培養(yǎng)12～48 h后,挑選透明圈直徑與菌落直徑比較大的菌落進(jìn)行保存,得到生淀粉酶產(chǎn)生菌。

1.3.2 酶活力測(cè)定

待測(cè)菌株使用LB液體培養(yǎng)基活化培養(yǎng)48 h后,10 000 r/min、4 ℃離心10 min所得上清液即為粗酶液。

淀粉酶(或生淀粉酶)酶活定義:在40 ℃條件下,以可溶性淀粉(或玉米生淀粉)為底物,以醋酸-醋酸鈉(50 mmol/L,pH 5.8)為緩沖液,每1 min釋放1 mg還原糖(以葡萄糖計(jì))所需酶量為一個(gè)酶活力單位,記為1 U。測(cè)定方法:取5 mL底物溶液(可溶性淀粉或玉米淀粉)于試管內(nèi),在40 ℃下保溫5 min,加入40 ℃保溫5 min的酶液 30 μL,200 r/min反應(yīng)30 min,用200 μL 200 mmol/L的NaOH終止反應(yīng),以200 r/min反應(yīng)5 min,得反應(yīng)液。對(duì)照反應(yīng)添加滅活后酶液進(jìn)行相同處理。用DNS法測(cè)定反應(yīng)液與對(duì)照反應(yīng)液中的葡萄糖生成量,計(jì)算相應(yīng)的酶活。

pH對(duì)酶活的影響測(cè)定方法:使相同濃度底物溶液溶解于不同pH的緩沖溶液中(50 mmol/L),測(cè)定并計(jì)算酶活,其中緩沖溶液為不同pH條件下的NaH2PO4-Na2HPO4(50 mmol/L)緩沖液或醋酸-醋酸鈉(50 mmol/L)緩沖液。

采用GB/T 23527—2009中福林-酚法測(cè)定中性蛋白酶及酸性蛋白酶酶活。

1.3.3 目標(biāo)菌株鑒定

以目標(biāo)菌株的總DNA為模板,利用引物P1:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和P2:5′-AAG-GAG

GTGATCCAGCCGCA-3′擴(kuò)增菌株的16S rDNA基因,委托生工生物工程(上海)股份有限公司對(duì)該菌的16S rDNA擴(kuò)增及測(cè)序,得到該菌株的16S rDNA序列后,在NCBI網(wǎng)站上用BLAST檢索GenBank中相關(guān)菌株的16S rDNA基因序列,并進(jìn)行同源性比對(duì),構(gòu)建進(jìn)化樹,確定其種屬。

1.3.4 菌株培養(yǎng)及耐酸性實(shí)驗(yàn)

菌株培養(yǎng):使用食品級(jí)LB(酵母粉 5 g/L,蛋白胨 10 g/L,NaCl 10 g/L)培養(yǎng)基進(jìn)行種子培養(yǎng)及菌株生長(zhǎng)耐酸性能驗(yàn)證。使用醬油培養(yǎng)基進(jìn)行菌株的擴(kuò)大培養(yǎng),得到發(fā)酵菌株培養(yǎng)液,用于發(fā)酵生產(chǎn)。

耐酸性實(shí)驗(yàn):配制LB培養(yǎng)基(pH 6.0～3.0,乳酸調(diào)節(jié)),滅菌后接種種子液在35 ℃、200 r/min進(jìn)行培養(yǎng),觀察菌株的生長(zhǎng)狀況。

1.3.5 菌株產(chǎn)乙偶姻功能驗(yàn)證

LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行液態(tài)培養(yǎng)48 h得到的菌株培養(yǎng)液,以10 000 r/min離心,分離得到上清液備用。以未接種菌株的空白培養(yǎng)基作為對(duì)照,采用肌酐比色法測(cè)定乙偶姻含量[6]。

3）噴嘴煙氣流速：再循環(huán)煙氣在爐內(nèi)需起到充分?jǐn)嚢杓敖档蜖t溫的作用，不同爐型、不同處理規(guī)模的焚燒爐對(duì)應(yīng)的最低風(fēng)速要求均不相同。噴嘴煙氣流速需根據(jù)爐膛流場(chǎng)模擬進(jìn)行設(shè)計(jì)，并結(jié)合運(yùn)行情況進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.6 目標(biāo)菌株在固態(tài)食醋釀造中的初步應(yīng)用

將目標(biāo)菌株用LB斜面培養(yǎng)后,于醬油培養(yǎng)基中進(jìn)行種子培養(yǎng),獲得發(fā)酵菌種,并進(jìn)一步轉(zhuǎn)接至醬油培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),獲得發(fā)酵培養(yǎng)液。將獲得的發(fā)酵培養(yǎng)液按0.25%的接種量接種至液化糖醪液中,靜置培養(yǎng)過夜后,下水拌醅進(jìn)行食醋發(fā)酵,每輪選擇車間3個(gè)樓層共6個(gè)發(fā)酵池作為實(shí)驗(yàn)組,對(duì)照組為分別與實(shí)驗(yàn)組同樓層的未接種目標(biāo)菌株的正常進(jìn)行下水發(fā)酵生產(chǎn)的食醋。發(fā)酵過程中檢測(cè)總酸、氨氮的生成情況,發(fā)酵結(jié)束后進(jìn)行淋醋,所得原醋進(jìn)行總酸、氨氮、有機(jī)酸、氨基酸及風(fēng)味物質(zhì)檢測(cè)。連續(xù)進(jìn)行3輪實(shí)驗(yàn)后,計(jì)算出醋率。

1.4 分析方法及數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為3次實(shí)驗(yàn)的平均值,使用GraphPad Prism 9進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及繪圖,P<0.05表示顯著差異。

食醋總酸、氨氮、有機(jī)酸、氨基酸、風(fēng)味物質(zhì)等的測(cè)定參照文獻(xiàn)[9,12]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 生淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選

2.1.1 生淀粉酶產(chǎn)生菌株的篩選

采用透明圈法篩選出透明圈直徑與菌落直徑比大于2.5的菌株共78株,即為產(chǎn)淀粉酶菌株。為滿足食醋生料發(fā)酵需要,進(jìn)一步復(fù)篩得到具有透明圈且透明圈直徑與菌落直徑比大于2的菌株共16株,進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化,獲得生淀粉酶產(chǎn)生菌,見圖1。

圖1 生淀粉酶產(chǎn)生菌

2.1.2 生淀粉酶產(chǎn)生菌酶活測(cè)定及目標(biāo)菌株的確定

復(fù)篩所得生淀粉酶產(chǎn)生菌通過16S rDNA序列對(duì)比分析進(jìn)行鑒定,結(jié)果見表1,編號(hào)為k4、k5、k6、k7、k13的菌株鑒定為巴氏醋桿菌巴氏亞種(A.pasteurianussubsp.pasteurianus),通過酶活測(cè)定,菌株均有淀粉酶、生淀粉酶及中性蛋白酶活性,除k4及k13具有較低的酸性蛋白酶活性外,其他幾株巴氏醋桿菌均無(wú)酸性蛋白酶活性。在固態(tài)食醋發(fā)酵中,巴氏醋桿菌為產(chǎn)酸主要功能性菌株,其同時(shí)具有產(chǎn)生淀粉酶活性及蛋白酶活性,將在一定程度上促進(jìn)原料淀粉、蛋白的分解利用。篩選獲取的菌株除巴氏醋桿菌外,其他鑒定結(jié)果顯示均為芽孢桿菌屬(Bacillus),包括死谷芽孢桿菌(B.vallismortis)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)、暹羅芽孢桿菌(B.siamensis)、枯草芽孢桿菌堆肥亞種(B.subtilissubsp.stercoris)、中村芽孢桿菌(B.nakamurai),酶活測(cè)定結(jié)果顯示其均具有較好的生淀粉酶、淀粉酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶活性。

表1 菌株產(chǎn)酶酶活測(cè)定

芽孢桿菌抗逆性強(qiáng),部分對(duì)乙酸、高溫具有耐受性,同時(shí)也被認(rèn)為是一種食品級(jí)的安全菌株,具有豐富的酶系,能參與多種催化反應(yīng),具有較高的商業(yè)價(jià)值。篩選所得菌株在不同pH條件下培養(yǎng)的結(jié)果見表2。k4、k5、k6、k7、k13均能在酸性條件下生長(zhǎng),并且在pH 3.0時(shí)均能生長(zhǎng),接種液體培養(yǎng)基12 h內(nèi)均可形成渾濁菌液。所有芽孢桿菌在pH 4.5條件下均能生長(zhǎng),在pH 4.0時(shí),k2、k12、k15能生長(zhǎng),但是在接種后培養(yǎng)36 h內(nèi)不能形成渾濁菌液,在pH 3.5時(shí),k3、k8均不能在36 h內(nèi)形成渾濁菌液,在pH 3.5及pH 3.0時(shí),k1、k9、k16、k11均能正常生長(zhǎng),且能在接種培養(yǎng)36 h 內(nèi)形成明顯的渾濁菌液。由此可知,在食醋發(fā)酵過程中,在低pH環(huán)境條件下,死谷芽孢桿菌k1、暹羅芽孢桿菌k9、k16、中村芽孢桿菌k11的生長(zhǎng)不會(huì)受到影響,為食醋發(fā)酵中的又一種可利用的功能菌株。結(jié)合表1的酶活測(cè)定結(jié)果,由于暹羅芽孢桿菌k9缺少酸性蛋白酶酶活,死谷芽孢桿菌k1、暹羅芽孢桿菌k16、中村芽孢桿菌k11可作為優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行進(jìn)一步研究及利用。

表2 pH對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

2.1.3 pH對(duì)目標(biāo)菌株產(chǎn)酶酶活的影響

考察在酸性條件下菌株產(chǎn)酶酶活的變化情況,進(jìn)一步評(píng)估目標(biāo)菌株在食醋發(fā)酵過程中的適用性。由圖2可知,k1、k16、k11所產(chǎn)生的生淀粉酶最佳pH分別為6.5,7.0,6.5。在堿性條件下,酶活隨著pH的升高而升高,在酸性條件下,酶活隨著pH的降低而降低,在pH 3.0時(shí),菌株殘余酶活為最佳酶活的50%以上,其中,中村芽孢桿菌k11所產(chǎn)生的生淀粉酶酶活為最佳酶活的81.15%,保留了最大的酶活。死谷芽孢桿菌k1、暹羅芽孢桿菌k16的殘余酶活分別為初始酶活的52.84%及65.95%。中村芽孢桿菌k11為食醋發(fā)酵生產(chǎn)中的最佳生淀粉酶產(chǎn)生菌,可作為目標(biāo)菌株進(jìn)行在食醋生產(chǎn)中的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)。

圖2 pH對(duì)酶活的影響

2.1.4 目標(biāo)菌株產(chǎn)乙偶姻功能驗(yàn)證

乙偶姻是食醋中一種重要的風(fēng)味物質(zhì),能夠提供濃郁的奶油香,賦予食醋香甜美味。同時(shí),乙偶姻也是功能性物質(zhì)四甲基吡嗪的重要前體物質(zhì)[13-15]。

由圖3可知,篩選獲取菌株均具有產(chǎn)乙偶姻功能,其中,菌株k5、k7、k13所產(chǎn)乙偶姻均明顯低于其他菌株,分子生物學(xué)鑒定顯示其均為巴氏醋桿菌,研究表明巴氏醋桿菌具有乙偶姻生成功能,但將其與乳酸菌進(jìn)行共培養(yǎng),乙偶姻的積累更明顯[6]。同時(shí),芽孢桿菌也可促進(jìn)食醋中乙偶姻的積累,如在保寧醋發(fā)酵過程中使用強(qiáng)化接種解淀粉芽孢桿菌的大曲,將使發(fā)酵所得食醋乙偶姻含量大幅提升[16]。所篩選菌株中,k11、k14、k15的乙偶姻含量均較高,分別為45.71,45.21,45.38 mg/L,可作為產(chǎn)乙偶姻功能性菌株進(jìn)一步應(yīng)用到固態(tài)食醋發(fā)酵過程中。結(jié)合篩選菌株在酸性條件的生長(zhǎng)情況及其所產(chǎn)生淀粉酶在pH 3.0～4.0之間的酶活情況,綜合考慮,選取中村芽孢桿菌k11作為目標(biāo)菌株進(jìn)行固態(tài)食醋發(fā)酵的應(yīng)用。

圖3 菌株產(chǎn)乙偶姻濃度測(cè)定

2.2 生淀粉酶產(chǎn)生菌在固態(tài)食醋發(fā)酵過程中的初步應(yīng)用

2.2.1 發(fā)酵過程中理化指標(biāo)隨發(fā)酵周期的變化情況

測(cè)定了發(fā)酵過程中發(fā)酵池底鹵汁的理化指標(biāo),結(jié)果見圖4。

圖4 總酸、不揮發(fā)酸、氨氮、酒精度、還原糖、發(fā)酵溫度隨發(fā)酵周期的變化

實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在發(fā)酵過程中,總酸含量不斷升高,實(shí)驗(yàn)組在發(fā)酵過程中總酸、氨氮等均高于對(duì)照組,且實(shí)驗(yàn)組總酸的升高速度快于對(duì)照組,可見k11產(chǎn)生的淀粉酶、蛋白酶等對(duì)原料中淀粉、蛋白的水解促進(jìn)了還原糖即氨基酸的生成,促使酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵更快速地進(jìn)行,促進(jìn)總酸的生成,氨基酸的生成使氨氮的含量升高。發(fā)酵結(jié)束時(shí)實(shí)驗(yàn)組的鹵汁總酸為(7.10±0.14) g/dL,對(duì)照組為(6.28±0.25) g/dL,提高了15.9%。發(fā)酵結(jié)束時(shí)發(fā)酵池鹵汁中氨氮含量明顯高于對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組為(0.65±0.01) g/dL,對(duì)照組為(0.592±0.01) g/dL。食醋發(fā)酵過程中整體不揮發(fā)酸含量均先升高后降低,在發(fā)酵開始到接近發(fā)酵中期,鹵汁中不揮發(fā)酸濃度逐漸升高,在發(fā)酵第10～12天,不揮發(fā)酸達(dá)到最高值,隨著發(fā)酵進(jìn)行,不揮發(fā)酸開始逐漸降低,但實(shí)驗(yàn)組整體不揮發(fā)酸濃度均高于實(shí)驗(yàn)組。

發(fā)酵開始到發(fā)酵周期第4天,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組鹵汁中酒精度均表現(xiàn)出明顯且迅速地增高,第4天之后,酒精度逐漸降低,發(fā)酵后期,酒精度緩慢下降,到發(fā)酵后期,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組鹵汁中酒精度均低于0.5 %。發(fā)酵過程為淀粉糖化、酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵同時(shí)進(jìn)行,在發(fā)酵前期,淀粉糖化與酒精發(fā)酵速度高于醋酸發(fā)酵速度,酒精含量總體呈升高趨勢(shì),隨著醋酸菌的生長(zhǎng)與代謝逐漸旺盛,酒精產(chǎn)生的速度在一定程度上降低,同時(shí)酒精被快速消耗,醋酸快速生成,隨著發(fā)酵周期的進(jìn)行,淀粉糖化、酒精發(fā)酵與醋酸發(fā)酵均在一定程度上進(jìn)行,保持著一種微妙的平衡關(guān)系,直至發(fā)酵結(jié)束,酒精含量降低,醋酸含量達(dá)到最大值。在發(fā)酵過程中,酶解糖化淀粉質(zhì)所提供的還原糖為酒精發(fā)酵及醋酸發(fā)酵所需的底物,同時(shí)也為其他微生物菌群提供了能源,因此在整個(gè)發(fā)酵過程中,無(wú)還原糖的累積階段,還原糖一直處在生成與被消耗利用的過程中。隨著發(fā)酵的進(jìn)行,酸度升高,pH降低,長(zhǎng)期的酸性環(huán)境使大部分不耐酸的微生物死亡,僅留下耐酸高滲微生物存在于發(fā)酵后期。隨著發(fā)酵的進(jìn)行,在發(fā)酵前期,酵母產(chǎn)酒及醋酸菌等其他微生物的生長(zhǎng)代謝,使發(fā)酵醋醅中溫度急劇升高,通過翻醅等手段可在發(fā)酵前期將醋醅溫度控制在42 ℃以下,防止燒醅,保證發(fā)酵的正常進(jìn)行,發(fā)酵中后期,隨著酸度升高,微生物代謝減弱,發(fā)酵醋醅溫度也逐漸降低,在發(fā)酵中后期維持在32～34 ℃較穩(wěn)定的溫度范圍內(nèi)。

2.2.2 強(qiáng)化菌株對(duì)食醋出醋率的影響

連續(xù)進(jìn)行3輪中村芽孢桿菌k11的強(qiáng)化實(shí)驗(yàn),每輪6個(gè)不同樓層的發(fā)酵池為實(shí)驗(yàn)組,分別與實(shí)驗(yàn)組同樓層同日下水制醅的6個(gè)不接種中村芽孢桿菌k11的發(fā)酵池為對(duì)照組,每2個(gè)發(fā)酵池套淋得到一批原醋,每輪3批醋高溫滅菌后放置于同一個(gè)儲(chǔ)存罐內(nèi)。3次強(qiáng)化實(shí)驗(yàn)的出醋率數(shù)據(jù)見圖5。中村芽孢桿菌k11強(qiáng)化組3次實(shí)驗(yàn)的出醋率分別為(58.50±0.63)%、(58.08±0.55)%、(58.19±0.21)%,對(duì)照組的出醋率分別為(55.50±0.06)%、(55.29±0.13)%及(53.69±1.35)%,中村芽孢桿菌k11強(qiáng)化實(shí)驗(yàn)組3次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后通過套淋所得食醋折標(biāo)(3.5 g/dL)分別為(43.92±0.45),(43.60±0.71),(43.69±0.49) kL,對(duì)照組3次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后通過套淋所得食醋折標(biāo)產(chǎn)量分別為(41.66±0.39),(41.50±0.39),(40.31±2.26) kL,實(shí)驗(yàn)組3次實(shí)驗(yàn)比對(duì)照組分別增加了2.26,2.10,3.38 kL食醋,對(duì)應(yīng)出醋率分別提高了5.4%、5.05%及8.40%,具有顯著效果。中村芽孢桿菌k11具有產(chǎn)生淀粉酶的能力,能在酸性條件下生長(zhǎng)且產(chǎn)酶,所產(chǎn)生淀粉酶在酸性條下能保持較好的酶活,在食醋發(fā)酵生產(chǎn)中,發(fā)酵開始時(shí)強(qiáng)化接種中村芽孢桿菌k11,在淀粉質(zhì)原料所組成的醋醅環(huán)境中,優(yōu)于淀粉、蛋白質(zhì)等的存在,促進(jìn)中村芽孢桿菌進(jìn)一步生長(zhǎng)繁殖并產(chǎn)生生淀粉酶、蛋白酶等,作用于原料淀粉及蛋白質(zhì),促進(jìn)淀粉、蛋白質(zhì)的分解,同時(shí)生成的還原糖及氨基酸等又進(jìn)一步作為碳源、氮源促進(jìn)微生物細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖,促進(jìn)淀粉糖化、酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵的進(jìn)一步進(jìn)行,提高最終的出醋率,使原料的利用率進(jìn)一步提高。

圖5 3輪實(shí)驗(yàn)出醋率分析

2.2.3 食醋有機(jī)酸、氨基酸含量分析

3次實(shí)驗(yàn)分別淋取得到3批實(shí)驗(yàn)組原醋,對(duì)應(yīng)酸度分別為(6.67±0.23),(6.23±0.45),(6.44±0.28) g/dL,各22 kL,3批對(duì)照組原醋酸度分別為(6.66±0.43),(6.18±0.53),(6.35±0.53) g/dL,各22 kL。取第1次實(shí)驗(yàn)對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組原醋,分別測(cè)定其中有機(jī)酸與氨基酸組成與含量,所得結(jié)果見圖6。

圖6 食醋中有機(jī)酸(a)、氨基酸(b)組成及含量分析

由圖6中a可知,中村芽孢桿菌k11強(qiáng)化實(shí)驗(yàn)組乳酸含量明顯高于對(duì)照組,乙酸含量明顯低于對(duì)照組,且實(shí)驗(yàn)組檢測(cè)出了蘋果酸,對(duì)照組未檢出蘋果酸,實(shí)驗(yàn)組中草酸含量明顯低于對(duì)照組,其他有機(jī)酸含量基本保持不變。乳酸、蘋果酸等不揮發(fā)酸占比升高,能夠降低食醋的刺激味,使食醋的口感更柔和[2,17]。由圖6中b可知,實(shí)驗(yàn)組總氨基酸含量明顯高于對(duì)照組,其中,天冬氨酸、絲氨酸、精氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸在總氨基酸中的占比基本保持不變,強(qiáng)化接入中村芽孢桿菌k11后,谷氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸含量明顯降低,賴氨酸含量明顯升高,對(duì)照組未檢出半胱氨酸,但強(qiáng)化中村芽孢桿菌實(shí)驗(yàn)組半胱氨酸含量為(214 9±5.76) mg/L,占總氨基酸含量的9.51%。可見中村芽孢桿菌強(qiáng)化接入醋醅后,中村芽孢桿菌所產(chǎn)蛋白酶作用于原料大米、麩皮等,促進(jìn)了原料中蛋白質(zhì)分解,中村芽孢桿菌蛋白酶中有作用于半胱氨酸與其他氨基酸所形成的肽鍵基團(tuán),使肽鍵水解,釋放出半胱氨酸,同時(shí),與如谷氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸的相應(yīng)肽鍵的親和力不如醋醅中其他微生物所釋放的蛋白酶,從而使食醋中谷氨酸、丙氨酸等氨基酸在總游離氨基酸中的占比降低[18]。

2.2.4 食醋風(fēng)味物質(zhì)的比較分析

取第一次實(shí)驗(yàn)對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組原醋,使用GC-MS進(jìn)行風(fēng)味物質(zhì)掃描分析,所得結(jié)果分別按風(fēng)味物質(zhì)類別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果見圖7。

圖7 食醋中風(fēng)味物質(zhì)組成分析

由圖7可知,中村芽孢桿菌k11強(qiáng)化組風(fēng)味物質(zhì)的總峰面積遠(yuǎn)高于對(duì)照組,其中,酯類、醇類、酮類、酚類含量明顯增高,酸類含量比對(duì)照組偏低。由于中村芽孢桿菌具有產(chǎn)乙偶姻功能,且乙偶姻為食醋中較重要的酮類物質(zhì),因此,酮類明顯增加,又因在微生物代謝中,乙偶姻可以與2,3-丁二醇相互轉(zhuǎn)化,同時(shí)也與雙乙酰含量相關(guān),因此,酮類物質(zhì)、醇類物質(zhì)總含量均高于對(duì)照組[19-20]。由于乙偶姻是四甲基吡嗪的重要前體物質(zhì),因此,在中村芽孢桿菌k11強(qiáng)化組中吡嗪類物質(zhì)顯著高于對(duì)照組。將中村芽孢桿菌k11應(yīng)用到固態(tài)食醋釀造過程中,對(duì)豐富食醋風(fēng)味物質(zhì)具有積極作用。

3 結(jié)論

本研究從自然發(fā)酵醋醅中篩選獲得生淀粉酶、蛋白酶產(chǎn)生菌,鑒定為中村芽孢桿菌,編號(hào)為k11,此菌株能在酸性條件下生長(zhǎng)并產(chǎn)酶,所產(chǎn)生淀粉酶在酸性條件下能保存80%以上的酶活,并具有高產(chǎn)乙偶姻功能。將此菌株在固態(tài)食醋發(fā)酵生產(chǎn)中進(jìn)行初步應(yīng)用,在發(fā)酵過程中,池底鹵汁的總酸、氨氮、不揮發(fā)酸含量等均有明顯提高,通過3輪重復(fù)應(yīng)用實(shí)驗(yàn),可使食醋出醋率分別提高5.40%、5.05%及8.40%,可在一定程度上降低生產(chǎn)成本。所得食醋乳酸、蘋果酸占比提升,草酸含量降低,可使食醋的口感柔和。游離氨基酸總量提升了71.52%,且增加了其中半胱氨酸的含量,增加了食醋的酸味,且食醋中醇類、酯類、酮類、吡嗪類、酚類物質(zhì)的含量均有明顯提升。本研究結(jié)果表明,將中村芽孢桿菌應(yīng)用到固態(tài)食醋發(fā)酵過程中,可提高出醋率,降低生產(chǎn)成本,并在一定程度上提升食醋的口感,對(duì)于提升傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品的生產(chǎn)效率及產(chǎn)品品質(zhì)具有重要意義。