發(fā)酵沙棘原果汁的乳酸菌篩選及工藝優(yōu)化

毛新亮，王憬，周明，陸路，張新雪，付少委*

（1.完美（廣東）日用品有限公司，廣東中山 528400）（2.廣東完美生命健康科技研究院有限公司，廣東中山528400）（3.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司北京市蛋白功能肽技術(shù)研究中心，北京 100015）

我國是世界上沙棘資源最為豐富的國家[1]，在全國各地都有分布[2]。沙棘是藥食同源植物[3]，具有極高的營養(yǎng)價值和藥用價值[4]，其果實含有豐富的營養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)[5]，已報道的活性成分約190多種，包括維生素和黃酮等[6]。沙棘黃酮有很高的保健和藥用價值，具有降低心血管疾病[7]、抗氧化[8]、抗衰老[9]、抗疲勞、抗腫瘤、抗菌、降血脂、降血糖[10]等作用[11]。大部分黃酮在植物體內(nèi)以糖苷形式存在，僅有小部分以游離苷元形式存在[12]。研究表明，黃酮糖苷在人體內(nèi)生物利用度低于黃酮苷元[13]，黃酮糖苷所具有的功能活性作用，多依賴于其去除糖基后的黃酮苷元[14]。糖苷形式的黃酮類物質(zhì)難以被人體胃腸道直接吸收[15]，只有在腸道菌群的作用下，黃酮苷可以通過微生物轉(zhuǎn)化生成黃酮苷元，易于被人體吸收、利用[16]。微生物細(xì)胞中存在的酶種類較多，且具有較好的糖苷類化合物轉(zhuǎn)化為苷元的潛力[17,18]，可以將黃酮類化合物以去糖基化反應(yīng)、脫羥基化反應(yīng)等方式轉(zhuǎn)化為黃酮苷元，提高其生物利用度[14]。乳酸菌發(fā)酵被認(rèn)為是一種保持并提高果蔬營養(yǎng)價值及感官特性的加工方法[19,20]，而目前關(guān)于乳酸菌顯著提高沙棘原果汁黃酮的研究鮮有報道，且關(guān)于多個菌株復(fù)合進行黃酮苷轉(zhuǎn)化黃酮苷元的研究也比較少見。

本研究以沙棘原果汁為原料，3種實驗室自行保藏鑒定的乳酸菌作為發(fā)酵劑，采用微生物發(fā)酵技術(shù)提高沙棘原果汁中黃酮類物質(zhì)的含量，利用高效液相色譜法檢測其中黃酮類物質(zhì)的含量，并通過單因素和正交試驗，對其發(fā)酵工藝條件進行優(yōu)化，得到最佳發(fā)酵工藝手段。目的是高效利用沙棘中的主要活性物質(zhì)，提供優(yōu)質(zhì)發(fā)酵菌種資源以及多種黃酮類物質(zhì)高效液相檢測的方法，以期為沙棘黃酮類物質(zhì)的研究提供參考、為中國沙棘工業(yè)產(chǎn)業(yè)化加工提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

沙棘原果汁，張北寶得康食品有限公司；菌種，所有菌種均來自實驗室內(nèi)自行鑒定保藏；MRS培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；山奈素、異鼠李素、槲皮素、金絲桃苷，純度均≥98%，成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司；異鼠李素-3-O-槐二糖-7-O-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-槐二糖-7-O-鼠李糖苷，純度均≥98%，武漢格林特生物技術(shù)有限公司；異鼠李素-3-O-葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷，純度均≥98%，寶雞市辰光生物科技有限公司；異鼠李素-3-O-蕓香糖苷、異槲皮苷，純度均≥98%，成都曼斯特生物科技有限公司；蘆丁，純度均≥98%，中國藥品生物制品檢定所。甲醇、乙腈（色譜純），德國Merck；甲酸（色譜純），迪馬科技；試驗用超純水（18.2 MΩ·cm）由Milli-Q純水系統(tǒng)制備。S20P型pH計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；1389A2型生物安全柜，美國Thermo；HZQ-211C型恒溫震蕩培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；水浴鍋，蘇州珀瓦爾實驗設(shè)備有限公司；NexeraX2超高效液相色譜儀，島津（上海）實驗器材有限公司；XS205DU型分析天平，美國Mettler Toledo；QL-901型渦旋混合儀，中國其林貝爾儀器制造有限公司；BXM-50VE立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅。

1.2 試驗方法

1.2.1 黃酮類化合物的檢測

11種黃酮類化合物的高效液相色譜條件依照Chen等[21]的方法，在此基礎(chǔ)上略有改動：色譜柱為Ascentis RP-Amide 15 cm×4.6 mm，3 μm；流動相為A相-乙腈+0.3%磷酸（V/V）；B相-乙腈+水（2.5+97.5）（V/V），用磷酸調(diào)節(jié)流動相至pH值3；流速：1.0 mL/min；檢測波長：270 nm；進樣量：50 μL。

1.2.2 沙棘原果汁發(fā)酵工藝流程

沙棘原果汁發(fā)酵的工藝流程如圖1所示。

圖1 沙棘原果汁發(fā)酵工藝流程Fig.1 Fermentation process of seabuckthorn juice

1.2.3 菌種復(fù)蘇及培養(yǎng)

菌種保藏于-80 ℃，室溫解凍，以1%（V/V）的接種比例接種于液體培養(yǎng)基中，（36±1）℃條件下培養(yǎng)24 h，活化2代備用。

1.2.4 沙棘前處理

稱取一定體積的沙棘原果汁，利用小麥肽和碳酸鈉調(diào)節(jié)沙棘原果汁的pH值，分裝并在115 ℃下滅菌20 min。

1.2.5 菌株篩選

單一菌株篩選：選擇唾液乳桿菌、戊糖片球菌、副干酪乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、德氏乳桿菌以及植物乳植物桿菌等共26個菌株進行單一菌株篩選實驗。碳源添加量為4%（m/V），調(diào)節(jié)pH值為5，接種量為1%（V/V），于30 ℃下發(fā)酵5 d。

復(fù)配菌株篩選：根據(jù)單一菌株發(fā)酵后異鼠李素的含量，選擇發(fā)酵效果顯著的菌株，進行復(fù)配實驗研究。共設(shè)計15組方案進行實驗，碳源添加量為4%（m/V），調(diào)節(jié)pH值為5，接種量為1%（V/V），于30 ℃下發(fā)酵14 d，選擇發(fā)酵后異鼠李素的含量最高的菌株復(fù)配組合，確定發(fā)酵終點。

1.2.6 工藝優(yōu)化

針對發(fā)酵前后異鼠李素含量變化較高的菌種組合進行單因素實驗設(shè)計，分別對溫度、pH值、碳源添加量以及菌種組合的接種比例進行考察，探究相關(guān)因素對發(fā)酵過程中沙棘原果汁中異鼠李素含量（mg/L）的影響，確定各因素合適的發(fā)條件，為沙棘中異鼠李素含量的提高提供參考，每個因素設(shè)置3個平行（見表1）。

表1 單因素實驗因素及水平表Table 1 Factors and levels of single factor formula experimental

表2 11種黃酮類化合物出峰順序和時間Table 2 Peak sequence and time of 11 flavonoids

1.2.7 正交試驗設(shè)計

通過單因素實驗結(jié)果確定正交試驗設(shè)計的因素和水平，選取溫度、pH值、碳源添加量以及接種比例四個因素及其對應(yīng)的三個較優(yōu)水平，以異鼠李素含量為考察指標(biāo)設(shè)計L9（34）正交試驗表，每組試驗做3次計算沙棘異鼠李素的平均含量。

1.2.8 沙棘原果汁和沙棘發(fā)酵液中基本指標(biāo)的測定

粗多糖的測定：根據(jù)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SNT 4260-2015《出口植物源食品中粗多糖的測定》；總黃酮的測定：根據(jù)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 2010-2011《柑橘類水果及制品中總黃酮含量的測定》；總酚酸的測定：參照Ledoux等人[22]的方法；有機酸的測定：根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.157-2016《食品中有機酸的測定》。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0，進行分析，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用ANOVA單因素分析，P＞0.05為無顯著性差異，P≤0.05為差異性顯著，P≤0.01為差異性極顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 黃酮類化合物高效液相色譜圖

圖2為黃酮混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖，每種物質(zhì)都有單一的峰出現(xiàn)，共11個峰，時間與表3出峰順序和時間相一致，由于異鼠李素在黃酮苷元占比較高，且具有較好的抗氧化和抗腫瘤作用，故后續(xù)以異鼠李素的增量作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，得出最優(yōu)的發(fā)酵工藝條件。

表3 菌種復(fù)配方案Table 3 The recombination scheme of strains

圖2 黃酮類化合物高效液相色譜圖Fig.2 High performance liquid chromatography of flavonoids

2.2 菌株篩選結(jié)果

2.2.1 單個菌株的篩選結(jié)果

以異鼠李素含量為篩選依據(jù)，與空白沙棘原果汁相比，除11#菌株發(fā)酵后無明顯差異之外，沙棘發(fā)酵液具有不同層次的差異，但2#、18#、19#、20#、22#、23#、24#、25#菌株發(fā)酵后異鼠李素含量顯著降低，這可能是因為菌株在此時間段內(nèi)沒有開始發(fā)揮作用，一些黃酮類物質(zhì)作為營養(yǎng)物質(zhì)被利用掉，沙棘中其它物質(zhì)的發(fā)酵趨勢在其它研究中也有表明[23]。故綜合篩選得到6株發(fā)酵后異鼠李素含量顯著性提高的菌株，說明這6株菌具有較好的轉(zhuǎn)化黃酮苷元的能力。它們分別是1#植物乳植物桿菌（L21）、6#德氏乳桿菌（L25）、9#植物乳植物桿菌（L23）、14#戊糖片球菌（P27）、21#德氏乳桿菌（L22）和26#類干酪乳桿菌（L09），如圖3所示。

圖3 沙棘發(fā)酵前后異鼠李素的含量Fig.3 Content of isorhamnetin before and after fermentation of sea-buckthorn

2.2.2 復(fù)配菌株的第一次篩選結(jié)果

由于1#植物乳植物桿菌（L21）發(fā)酵后的異鼠李素含量大于9#植物乳植物桿菌（L23）的含量，6#德氏乳桿菌保加利亞亞種（L25）發(fā)酵后的異鼠李素含量大于21#德氏乳桿菌保加利亞亞種（L22）。故選擇9#植物乳植物桿菌（L23）、14#戊糖片球菌（P27）、21#德氏乳桿菌保加利亞亞種（L22）和26#類干酪乳桿菌（L09）進行復(fù)配，實驗設(shè)計如表3所示。將不同實驗組發(fā)酵14 d每隔1 d取一次樣品進行檢測，選擇以異鼠李素增量為篩選依據(jù)，與空白相比，如圖4所示，12#（L23+P27+L09）菌種組合在第10天的異鼠李素增量相對較高，故選取12#進行后續(xù)菌種復(fù)配方案優(yōu)化，這說明菌株復(fù)合相比較單個菌株發(fā)酵具有更好的效果。

圖4 不同實驗組的異鼠李素增量Fig.4 Isorhamnetin increment in different experimental groups

圖5 不同實驗組的異鼠李素增量Fig.5 Isorhamnetin increment in different experimental groups

2.2.3 復(fù)配菌株的第二次篩選結(jié)果

結(jié)合單菌和第一次復(fù)配方案，再將發(fā)酵菌種的復(fù)配方案進行優(yōu)化。發(fā)酵10 d，取樣進行檢測。如表4設(shè)計菌種復(fù)配方案，結(jié)果顯示1#菌種復(fù)配組合異鼠李素增量明顯，故選擇1#菌種組合進行后續(xù)工藝優(yōu)化實驗，由此可見更多菌株的復(fù)合反而減少菌株之間的協(xié)同作用，阻礙次級代謝物質(zhì)發(fā)揮作用，從而減少黃酮苷轉(zhuǎn)化為黃酮苷元。

表4 菌種復(fù)配方案優(yōu)化Table 4 Optimization of the recombination scheme of strains

2.3 單因素試驗結(jié)果

2.3.1 pH值

在溫度為30 ℃、碳源添加量為4%（m/V），接種比例為1:1:1和接種量為1%的條件下，不同pH值條件3、4、5、6和7對發(fā)酵液中異鼠李素含量的影響見圖6。pH值對異鼠李素增量的影響表現(xiàn)先升高后下降的趨勢，并且在pH值為5時，異鼠李素增量表現(xiàn)明顯。

圖6 pH值對發(fā)酵液中異鼠李素含量的影響Fig.6 Effect of pH value on the isorhamnetin content in fermentation broth

2.3.2 溫度

在pH值為5、碳源添加量為4%（m/V）、接種比例為1:1:1和接種量為1%的條件下，不同溫度條件25、30、35、40和45 ℃對發(fā)酵液中異鼠李素含量的影響見圖7。結(jié)果表明在30 ℃時異鼠李素表現(xiàn)出最高的增量，提升至7.17 mg/L，說明乳酸菌在該溫度下表現(xiàn)出較高的活力，利用其次級代謝產(chǎn)物提高黃酮類物質(zhì)的含量。

圖7 溫度對發(fā)酵液中異鼠李素含量的影響Fig.7 Effect of temperature on isorhamnetin content in fermentation broth

2.3.3 碳源添加量

在溫度為30 ℃、pH值為5，接種比例為1:1:1和接種量為1%的條件下，不同碳源添加量2%（m/V）、4%（m/V）、6%（m/V）、8%（m/V）和10%（m/V）對發(fā)酵液中異鼠李素含量的影響見圖8。由圖可知在添加4%（m/V）的碳源時，異鼠李素的增量較高。碳源作為乳酸菌的底物，供給乳酸菌生長。

圖8 碳源添加量對發(fā)酵液中異鼠李素含量的影響Fig.8 Effect of carbon sources addition on the isorhamnetin content in fermentation broth

2.3.4 接種比例

在溫度為30 ℃、pH值為5，碳源添加量4%（m/V）和接種量為1%的條件下，不同接種比例1:1:1、1:2:1、1:1:2、2:1:2和2:1:1對發(fā)酵液中異鼠李素含量的影響見圖9。接種比例1:1:1時，異鼠李素的增量趨勢明顯。不同菌株具有不同的轉(zhuǎn)化能力，不同接種比例會影響菌株的生長狀態(tài)，故影響異鼠李素的含量。

圖9 接種比例對發(fā)酵液中異鼠李素含量的影響Fig.9 Effect of inoculation proportion on the isorhamnetin content in fermentation broth

2.3.5 正交試驗優(yōu)化發(fā)酵工藝

根據(jù)單因素實驗結(jié)果確定正交試驗設(shè)計的因素和水平，選取溫度（A）、pH值（B）、碳源添加量（C）和接種比例（D）為試驗因素。正交試驗因素水平表如表5所示。結(jié)果見表6。

表5 L9（34）正交試驗因素水平表Table 5 Design of L9(34) orthogonal test

根據(jù)正交試驗設(shè)計進一步研究，得到正交試驗結(jié)果。由上表分析結(jié)果表明各因素對異鼠李素含量影響大小的順序依次是pH值＞碳源添加量＞接種比例＞溫度，最優(yōu)條件為A2B1C3D2，即溫度30 ℃，pH值為4，碳源添加量為6%（m/V），接種比例為1:2:1。并以最優(yōu)的條件進行了驗證，異鼠李素含量達到15.78 mg/L，與正交試驗結(jié)果無太大差異，為后續(xù)研究提供參考。此結(jié)果在付依依等[23]的研究結(jié)果中也有同樣展示結(jié)果，該研究利用酒酒球菌CICC 6066發(fā)酵沙棘，得到異鼠李素含量約為1.93 mg/L，與空白對照1.48 mg/L相比，提升約30%，而本研究通過乳酸菌的復(fù)配，與空白對照相比，提升約90%。表明多個乳酸菌復(fù)合具有較高黃酮苷元轉(zhuǎn)化的能力，而此發(fā)酵工藝可以發(fā)揮最大的效益。

2.4 基本指標(biāo)檢測結(jié)果

黃酮含量的提高對于人體的免疫健康等具有明顯的益處；而粗多糖能夠降血脂，提高肝臟抗氧化能力，還可以防止一些糖尿病的出現(xiàn)；酚酸可以殺菌，也可作為抗氧化劑，防止自由基氧化反應(yīng)引起的細(xì)胞損傷；有機酸有利于人體及消化，幫助提高食欲，增強免疫力軟化血管等功效。如表7所示，沙棘發(fā)酵液與沙棘原果汁相比，基本指標(biāo)所測含量都有所提升，總黃酮含量無明顯差異，但含量提升約108%，有效的提高了發(fā)酵液中總黃酮含量。崔欣悅等[24]利用單個乳酸菌發(fā)酵橘皮黃酮，其得率提高至0.21 mg/g，提升了20%，由此可見本研究多個乳酸菌復(fù)合發(fā)酵具有更好轉(zhuǎn)化黃酮苷元的作用。發(fā)酵前后兩者的粗多糖、總酚酸以及有機酸含量都具有顯著性差異。付依依等[25]檢測總酚酸的結(jié)果發(fā)酵后的含量約為586.00 mg/L，提升約4%，本研究提高了約5倍。由此可見乳酸菌復(fù)合發(fā)酵沙棘原果汁可以明顯提升基本指標(biāo)含量，幫助其提高作用功效，在促進人體健康方面具有很大的潛力。

表7 基本指標(biāo)的檢測結(jié)果Table 7 Test results of basic indicators

3 結(jié)論

本研究通過對26個菌株進行單菌株發(fā)酵沙棘原果汁篩選，選出6個具有較好轉(zhuǎn)化的菌株進行復(fù)配發(fā)酵，最終得到植物乳植物桿菌L23、戊糖片球菌P27和植物乳植物桿菌L21這三個菌株復(fù)配效果最好；再通過單因素試驗和正交試驗進行優(yōu)化，得到沙棘的發(fā)酵工藝條件為：植物乳植物桿菌L23、戊糖片球菌P27和植物乳植物桿菌L21在pH值為4，溫度30 ℃，添加碳源6%，接菌比例為1:2:1時發(fā)酵得到的黃酮苷元含量較高，在此條件下，異鼠李素的含量提升至15.78 mg/L，與空白對照8.26 mg/L相比提升了約90%。可見植物乳植物桿菌L23、戊糖片球菌P27和植物乳植物桿菌L21在優(yōu)化發(fā)酵工藝后具有更好轉(zhuǎn)化沙棘黃酮苷元的能力，這些數(shù)據(jù)為后續(xù)的相關(guān)研究提供參考，同時本研究還提供一種檢測11種黃酮類物質(zhì)高效液相色譜的檢測方法。

利用發(fā)酵手段及對發(fā)酵條件的有效控制實現(xiàn)對黃酮類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化及相關(guān)機理的探究，提高了生物轉(zhuǎn)換效率，為實現(xiàn)黃酮類化合物等功能資源的高值化利用提供數(shù)據(jù)支撐，同時為今后利用沙棘發(fā)酵工藝實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，為黃酮苷和黃酮苷元具體轉(zhuǎn)化機制提供數(shù)據(jù)參考。