孜然主要成分枯茗醛對吲哚美辛致胃潰瘍大鼠的保護作用

鄧紅雨，周慧英，康瑞萍，艾菲熱·阿布都艾尼，黃羅冬*，索菲婭*

（1.廣西大學生命科學與技術學院，廣西南寧 530004）（2.新疆大學生命科學與技術學院，新疆烏魯木齊 830046）

胃潰瘍（Gastric Ulcer）是常見的消化類疾病，會引起一系列并發(fā)癥如幽門梗阻、潰瘍穿孔、胃黏膜防御屏障損壞等，臨床表現(xiàn)主要為餐后上腹部位疼痛，胃酸、胃蛋白酶分泌過多，發(fā)作反復，治療周期長，難以根治[1,2]。胃潰瘍的病因主要包括壓力、過度吸煙、酒精攝入、胃酸和胃蛋白酶的分泌過多、幽門螺桿菌感染和非甾體抗炎藥（Non-steroidal Anti-inflammatory Drugs，NSAIDs）的使用[3,4]。吲哚美辛（Indomethacin）等NSAIDs在疾病治療過程中，常用作為鎮(zhèn)痛和抗炎藥物。但NSAIDs的持續(xù)使用，會引起如消化性潰瘍、出血和穿孔等消化道并發(fā)癥[5]。其主要是通過誘導促炎介質，促進中性粒細胞粘附，損害粘膜完整性，從而導致胃潰瘍的發(fā)生[5-7]。目前臨床上關于胃潰瘍的治療藥物主要分為抑制胃酸類藥物、胃黏膜保護類藥物、抗幽門螺桿菌類藥物，但這些藥物的治療作用有限且伴隨惡心、腹痛、腹瀉、頭痛、睡眠不足等癥狀。因此，需要高效低毒的新藥候選物來預防和治療胃潰瘍，防止疾病復發(fā)。

孜然（Cuminum cyminumL.）屬于傘形科（Apiaceae）孜然芹屬（Cuminum）植物，其氣味甘甜、辛溫無毒，常用作食物香料，但作為中草藥也被廣泛使用。中醫(yī)學認為，孜然具有暖胃健脾、消食化積、祛風止痛、醒腦通脈等功效，可治療胃寒疼痛、消化不良、腹痛腹瀉、癲癇和黃疸等病癥[8]。實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，孜然具有顯著的消炎和治療胃潰瘍的作用，孜然果實精油[9]、醇提物[10]、總黃酮[11]等成分均表現(xiàn)出良好的急性胃潰瘍保護作用。已有研究發(fā)現(xiàn)孜然的主要香氣來源和活性物質枯茗醛（Cuminaldehyde，CUM）具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒和抑菌等作用[12-15]，但目前關于孜然有效成分枯茗醛對胃潰瘍的作用研究欠缺。因此本研究以吲哚美辛誘導的大鼠急性胃潰瘍?yōu)槟Ｐ停骄靠蒈ξ笣兊谋Ｗo作用與作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

本實驗所用的36只SD大鼠購買于昆明醫(yī)科大學SPF級實驗動物中心，小鼠許可證號：SCXK（滇）K2020-004體質量180～220 g，飼養(yǎng)溫度（22±2）℃，相對濕度65%±10%，自然光照條件，飼料及水源充足。所有動物實驗操作按新疆大學實驗動物倫理委員會批準下進行，動物倫理編號XDSKY2020030401。

1.2 藥物與儀器

前期從孜然果實中提取純化獲得枯茗醛，純度達到87%。用蒸餾水配置0.5%羧甲基纖維素鈉（Sodium Carboxymethyl Cellulose，CMC-Na）溶液（質量分數(shù)）。分別稱取80、160和320 mg枯茗醛于40 mL 0.5%CMC-Na的溶液，制成質量濃度為2、4和6 mg/mL的枯茗醛溶液。用0.5% CMC-Na配置10 mg/mL吲哚美辛溶液。用蒸餾水配置3 mg/mL奧美拉唑溶液。

TRACE DSQ氣相色譜-質譜聯(lián)用儀，美國Finnigan質譜公司；RE-52AA旋轉蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；Multifuge X1R高速冷凍離心機、Multiskan Sky全波長酶標儀，美國Thermo公司；JT-12F生物組織脫水機、TKY-BMB石蠟包埋機，上海寰熙醫(yī)療器械有限公司；RM2126冷凍切片機，徠卡顯微系統(tǒng)上海貿易有限公司。

1.3 動物分組及模型制備

實驗條件下，大鼠自由飲食7 d以適應環(huán)境。隨機把大鼠分為6組，每組6只，分別為空白組（CK，0.5% CMC-Na），吲哚美辛模型組（Model，0.5%CMC-Na），奧美拉唑陽性對照組（Positive，30 mg/kg），枯茗醛低劑量組（CUM2）、中劑量組（CUM4）和高劑量組（CUM6）（濃度分別為20 mg/kg、40 mg/kg和60 mg/kg）。連續(xù)給藥7 d，每日1次。末次給藥前24 h，對大鼠采取禁食、不禁水和避免食糞性的措施。末次給藥1 h后，CK大鼠以1 mL/100 g劑量灌胃生理鹽水，其余組大鼠以相同劑量灌胃質量濃度為10 mg/mL的吲哚美辛溶液，制備胃潰瘍模型。造模5 h后，用乙醚麻醉大鼠并解剖。用真空采血管從腹主動脈采集血液，靜置1 h后4 500 r/min離心10 min，取上清存于-80 ℃。

1.4 大鼠胃組織觀察及指數(shù)測定

獲取大鼠胃組織，參考索菲婭等[4]的方法評定胃潰瘍指數(shù)及潰瘍抑制率。觀察大鼠胃潰瘍情況，測量潰瘍長度并計分，以分數(shù)平均值為潰瘍指數(shù)。按以下公式計算胃潰瘍抑制率：

式中：

UI——胃潰瘍抑制率，%；

Um——模型組大鼠胃潰瘍指數(shù)；

Ut——給藥組大鼠胃潰瘍指數(shù)。

剪取病變的胃組織區(qū)域，用4%甲醛（質量分數(shù)）固定，經脫水、包埋、切割等常規(guī)步驟獲得4 μm切片。用蘇木精-伊紅染色（Hematoxylin-Eosin Staining，HE染色），于光學顯微鏡下觀察病理學變化。

1.5 大鼠胃組織及血清指標測定

用生理鹽水將大鼠胃組織制成質量分數(shù)為10%的勻漿液，2 500 r/min離心10 min取上清。

胃組織抗氧化性能：據試劑盒檢測氧化應激因子過氧化氫酶（Catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione Peroxidase，GSH）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）的活性或含量（南京建成生物工程研究所）。

血清炎癥因子：據試劑盒檢測大鼠腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）、白細胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）、白細胞介素-10（Interleukin-10，IL-10）的表達量（Elabscience公司），及髓過氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）活性（南京建成生物工程研究所）。

胃黏膜保護因子：據試劑盒檢測血清前列腺素E2（Prostaglandin E2，PGE2）的表達量（Elabscience公司）和胃組織一氧化氮（Nitric Oxide，NO）的活性（南京建成生物工程研究所）。

1.6 數(shù)據處理

2 結果與討論

2.1 大鼠胃組織形態(tài)學與黏膜病理形態(tài)學觀察

胃黏膜狀況可較直觀的反映大鼠胃組織健康狀態(tài)。吲哚美辛等非甾體類抗炎藥（NSAIDs）會引起氧化應激和炎癥，導致胃腸道黏膜損傷，其誘導的動物模型可用于評價藥物對腸胃的保護作用[16,17]。對于枯茗醛抗胃潰瘍的研究較少，在濃度劑量選擇上參考了枯茗醛對高脂飲食誘導的肥胖大鼠的6 mg/kg劑量[18]，改善高脂飲食誘導的非酒精性脂肪肝的14 mg/kg劑量[19]。在預實驗中以10 mg/kg劑量進行了抗胃潰瘍的研究，但對胃潰瘍治療效果不明顯，因此設置了20、40和60 mg/kg劑量。各組大鼠胃組織形態(tài)學觀察如圖1所示?？瞻捉MCK大鼠黏膜依舊完整無損，粘液屏障完好，無潰瘍點、糜爛等現(xiàn)象（圖1a）；Model大鼠胃黏膜表層損傷，存在多處暗紅色出血條帶及點狀潰瘍（圖1b）；Positive大鼠胃黏膜無明顯損傷，整體黏膜呈淡粉色，與CK組相近（圖1c）；枯茗醛給藥組大鼠胃黏膜損傷程度呈劑量依賴，逐步無長條狀潰瘍條帶出現(xiàn)（圖1d～f），高劑量的CUM6效果較明顯，大鼠粘膜整體無水腫、糜爛等狀況，僅少且短的潰瘍出血點（圖1f）。

圖1 各組大鼠胃組織的形態(tài)學觀察Fig.1 Morphological observation of gastric tissuein each group rats

各組大鼠胃組織HE染色結果如圖2。CK大鼠胃黏膜結構完整無損傷，胃小凹及腺體排列緊密整齊無充血現(xiàn)象，上表皮細胞未見脫落（圖2a）；Model大鼠胃黏膜結構損傷明顯，腺體排列紊亂分散，出血點清晰可見，上皮細胞少量脫落，黏膜下表層炎細胞浸潤（圖2b）；3個濃度的枯茗醛給藥組大鼠胃黏膜腺體排列趨于整齊，下表層炎癥細胞浸潤減輕，損傷情況得到改善（圖2d～f），其中高劑量枯茗醛組（CUM6）大鼠胃黏膜損傷的病理形態(tài)與CK、Positive較為相似，上皮細胞未見脫落，無充血點（圖2f）。這個結果與胃組織形態(tài)學觀察結果趨于一致，均未看到明顯損傷。

圖2 各組大鼠胃黏膜HE染色病理學觀察（100×）Fig.2 Pathological observation of gastric mucosa by HE staining in each group rats (100×)

在有關藥用植物對大鼠胃潰瘍病理學形態(tài)的研究結果中，具有類似的作用效果。如從漆樹科的乳香黃連木（Pistacia lentiscus）果實中提取的精油可顯著減少大鼠胃潰瘍和出血性區(qū)域[20]；山欖科的鐵線子（Manilkara hexandra）樹皮的甲醇提取物可以顯著減輕動物胃潰瘍程度[21]；蕓香科的假黃皮（Clausena excavata）根的提取物齒葉黃皮素顯著減少了乙醇誘導的胃潰瘍面積（P＜0.05）[22]。本研究中，胃組織形態(tài)學與黏膜病理形態(tài)學結果均顯示，高劑量枯茗醛組（CUM6）抗?jié)冃Ч罴?，與藥物奧美拉唑的潰瘍抑制效果類似，表明枯茗醛也具有作為抗胃潰瘍藥物的潛力。

2.2 大鼠胃潰瘍指數(shù)及胃蛋白酶活性比較

胃潰瘍的病理機制復雜，胃酸與胃蛋白酶的相互作用、氧化應激與炎癥反應被認為是胃黏膜損傷的主要原因[23,24]。胃酸分泌過多會引起屏障功能減弱，導致胃黏膜組織的自我消化，誘導潰瘍發(fā)生[24,25]，胃蛋白酶活性過高也是誘導胃潰瘍的因素之一[26]。各組大鼠潰瘍指數(shù)、潰瘍抑制率和胃液情況如表1。與CK相比，Model組大鼠潰瘍指數(shù)顯著上升達57.00（P＜0.01）。相較于Model組、Positive組的潰瘍指數(shù)顯著下降（P＜0.01），僅為2.67，其對應的潰瘍抑制率高達95.32%；枯茗醛預給藥的CUM4、CUM6大鼠潰瘍指數(shù)顯著下降（P＜0.01），且存在呈劑量依賴的可能。CUM2、CUM4、CUM6的潰瘍抑制率也隨劑量增加而逐步提高，分別為15.35%、46.78%、58.48%。表明枯茗醛對大鼠胃黏膜的保護作與給藥劑量相關，可有效降低吲哚美辛對大鼠胃黏膜的傷害。盧帥等[10]的研究發(fā)現(xiàn)，孜然乙醇提取物也可以有效降低潰瘍指數(shù)，提高潰瘍抑制率（P＜0.05），同時還可降低胃蛋白酶活性（P＜0.01）。

表1 各組大鼠潰瘍指數(shù)、抑制率和胃蛋白酶活性比較Table 1 Comparison of ulcer index, inhibition rate and pepsin activity in each group rats (n=6,±s)

表1 各組大鼠潰瘍指數(shù)、抑制率和胃蛋白酶活性比較Table 1 Comparison of ulcer index, inhibition rate and pepsin activity in each group rats (n=6,±s)

注：CK為空白組；Model為模型組；Positive為陽性對照組；CUM2為20 mg/kg枯茗醛組；CUM4為40 mg/kg枯茗醛組；CUM6為60 mg/kg枯茗醛組。#P＜0.05、##P＜0.01為與空白組（CK）相比；*P＜0.05、**P＜0.01為與模型組（Model）相比。

組別潰瘍指數(shù) 潰瘍抑制率/% 胃蛋白酶/(U/mg prot)CK - - 1.99±0.07 Model57.00 ±9.35##- 3.56±0.20##Positive2.67±1.53**95.32 2.08±0.69**CUM248.25±6.7515.35 1.67±0.40**CUM430.33±6.81**46.78 1.65±0.61**CUM623.67±6.77**58.48 1.59±0.50**

另外，胃蛋白酶活性測定結果顯示，與CK組相比，Model組大鼠胃蛋白酶活性顯著上升達3.56 U/mg prot（P＜0.01）。Positive組大鼠的胃蛋白酶活性為2.08 U/mg prot，枯茗醛處理組的活性處于1.59～1.67 U/mg prot水平。表明相對于Model組，奧美拉唑、枯茗醛均能有效抑制大鼠胃蛋白酶活性（P＜0.01），通過降低胃蛋白酶活性起到一定的胃黏膜保護作用。

2.3 枯茗醛對大鼠胃組織抗氧化性能的影響

NSAIDs會直接損傷消化道黏膜屏障，破壞其線粒體的結構，使中性粒細胞大量衍生氧自由基而被積累浸潤[27]。機體的抗氧化系統(tǒng)可以清除自由基，該系統(tǒng)主要包括SOD、CAT、GSH等物質。SOD能夠使O2-歧化生成氧和H2O2；CAT酶可將H2O2分解，起到保護細胞免受活性氧毒性的作用；GSH可保護胃黏膜免受自由基誘導的組織損傷，是衡量機體抗氧化能力的重要因子；MDA是脂質過氧化的終產物[3,22,28]。這些物質的水平可間接反映機體抗氧化能力?？蒈胚崦佬聊Ｐ痛笫笪附M織抗氧化性能的影響如圖3。與CK組相比，Model組大鼠胃組織中的SOD、CAT、GSH水平分別降低了31.97%、46.54%、25.58%，MDA含量增加了131.58%（0.44 nmol/mg prot），存在顯著差異（P＜0.05或P＜0.01）。與Model組相比，Positive組大鼠的SOD、CAT、GSH水平升高但無明顯差異；但枯茗醛灌胃的各組大鼠CAT活性均顯著增加（P＜0.01），在CUM6達到最大值3.68 U/mg prot；CUM4、CUM6大鼠的SOD活性顯著增加（P＜0.05）；此外，CUM6大鼠胃組織的GSH活性提高了28.81%（16.90 μmol/g prot），MDA含量顯著降低31.82%（0.30 nmol/mg prot），均存在顯著差異。

圖3 各組大鼠胃組織抗氧化性能比較Fig.3 Comparison of antioxidant properties of gastric tissue in each group rats (n=6,±s)

研究表明，枯茗醛可以顯著提高高脂飲食小鼠肝臟的GSH、SOD和CAT活性水平，并顯著降低MDA含量（P＜0.01）[19]；優(yōu)化的枯茗醛制劑對四氯化碳處理大鼠血漿抗氧化指標具有相似作用效果（P＜0.05）[29]。除孜然成分枯茗醛外，龔頻等[30]的研究發(fā)現(xiàn)，黃芪的重要功效成分黃芪甲苷可以降低由鎘聯(lián)合高脂高糖致糖尿病小鼠胰腺組織的MDA含量，增加SOD、GSH活性（P＜0.05或P＜0.01）。本研究中，與Model組相比，枯茗醛和陽性對照奧美拉唑治療后的胃潰瘍大鼠SOD、CAT活性和GSH含量均有所提高，枯茗醛效果較顯著。表明枯茗醛和奧美拉唑可提高抗氧化系統(tǒng)清除自由基的性能，存在一定的修復和恢復抗氧化活性的作用。吲哚美辛灌胃造成大鼠胃組織嚴重損傷，過氧化程度高，使得MDA含量顯著增加。但與Model組相比，枯茗醛（CUM2、CIM6）顯著降低了胃組織中MDA含量（P＜0.05）。表明枯茗醛可影響胃部組織的抗氧化活性，起到修復和改善細胞免受活性氧毒性的作用，保護胃黏膜免受自由基誘導的組織損傷。對于Positive組，也表現(xiàn)出了MDA含量低于模型組，但作用效果不明顯，表明枯茗醛對吲哚美辛致胃潰瘍的治療作用比奧美拉唑良好。

2.4 枯茗醛對大鼠血清炎癥因子的影響

除影響胃潰瘍大鼠胃組織抗氧化酶活性外，枯茗醛還影響大鼠血清炎癥因子。胃粘膜損傷常伴隨炎癥的出現(xiàn)。大鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-10含量及MPO活性的測定結果如圖4。Model組中的TNF-α含量、IL-1β含量和MPO活性分別為89.66 pg/mL、227.43 pg/mL和3.71 U/L，與CK組相比差異顯著（P＜0.05或P＜0.01），其中TNF-α含量增加了125.56%；此外IL-10的含量較CK組降低了60.78%（18.71 pg/mL，P＜0.01）。與Model組相比，CUM4、CUM6和奧美拉唑均能顯著降低大鼠血清中TNF-α和IL-1β含量（P＜0.05或P＜0.01）；CUM6和奧美拉唑組還顯著增加了IL-10含量（P＜0.05或P＜0.01），其中CUM6組IL-10含量最高，達到47.60 pg/mL（增加了154.41%）；同時，CUM6和奧美拉唑組還顯著降低了MPO活性（P＜0.05），CUM6的MPO活性降低至2.50 U/L（降低了32.61%）。TNF-α、IL-1β等是判斷炎癥程度的促炎因子，TNF-α促炎因子是NSAIDs誘導胃潰瘍的關鍵指標，其含量可作為胃腸道系統(tǒng)有害的標志[5]；IL-10是一種多功能負調節(jié)因子，可以抑制和拮抗促炎因子的產生和作用；MPO活性可以用來評估中性粒細胞對胃粘膜組織的浸潤[31]。研究表明，枯茗醛可以顯著降低四氯化碳處理的大鼠血清和肝組織中的促炎介質TNF-α和IL-6水平（P＜0.01）[29]；25～100 mg/kg劑量的枯茗醛可以顯著減輕神經性疼痛模型大鼠的異常痛和痛覺過敏（Allodynia and Hyperalgesia），降低血清TNF-α和IL-1β水平[32]。本研究中，枯茗醛對吲哚美辛胃潰瘍模型大鼠也具有較好的抗炎活性，可以減緩吲哚美辛所引起的炎癥反應。因此，枯茗醛對機體的保護作用與其良好的抗炎活性相關。

圖4 各組大鼠血清炎癥因子水平比較Fig.4 Comparison of serum inflammatory factors in each group rats (n=6,±s)

2.5 枯茗醛對大鼠血清PGE2和胃組織NO含量的影響

NO和PGE2是機體胃黏膜的防御因子。PGE2對胃潰瘍的保護作用與刺激胃黏液和碳酸氫鹽分泌、在維持胃粘膜防御的完整性方面發(fā)揮重要作用[3]。NO與維持胃黏膜血流量和抑制炎癥有關，具有抑制中性粒細胞的黏附、清除氧自由基等作用[33]。大鼠血清PGE2和胃組織NO含量測定結果如圖5。與CK相比，Model組大鼠血清PGE2（P＜0.01）和胃組織NO（P＜0.05）水平顯著降低。與Model組相比，枯茗醛可以顯著提高大鼠血清中PGE2含量（P＜0.01）。此外，CUM4、CUM6大鼠胃組織NO含量與Positive組類似，都接近于CK組，但只有CUM6的NO水平較Model組存在差異性（P＜0.05），其余枯茗醛劑量雖可增加NO含量，但無差異。表明枯茗醛對吲哚美辛致胃潰瘍的胃黏膜保護作用與PGE2和NO有關，在一定程度上增強了胃黏膜的防御作用。

圖5 各組大鼠血清PGE2、胃組織NO活性比較Fig.5 Comparison of serum PGE2 and gastric NO activity in each group rats (n=6, ±s)

3 結論

本研究以孜然活性物質枯茗醛灌胃大鼠，再用非甾體類抗炎藥（NSAIDs）吲哚美辛構建大鼠胃潰瘍模型，探討了枯茗醛對大鼠胃潰瘍的保護作用及機制。結果發(fā)現(xiàn)，枯茗醛可以通過降低大鼠胃蛋白酶活性、增加抗氧化能力和抗炎活性，從而抵御吲哚美辛對大鼠胃組織的傷害，其中60 mg/kg劑量的枯茗醛效果最佳。表明孜然活性物質枯茗醛具有作為胃潰瘍治療的潛力，可為胃潰瘍藥物的開發(fā)研究及枯茗醛的實際應用奠定基礎。