不同成熟度鮮煙素質(zhì)對烤后煙葉品質(zhì)貢獻(xiàn)度的研究

胡永濤， 汪代斌， 陳益銀， 楊超， 鄭林林， 史宏志， 王建安*

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，鄭州 450002； 2.中國煙草總公司重慶市公司，重慶 404100）

鮮煙采收成熟度是煙葉在田間生長發(fā)育和干物質(zhì)積累到適于調(diào)制加工的質(zhì)量狀態(tài)和程度，對煙葉烘烤的難易程度有較大的影響，同時也是提高烤后煙葉品質(zhì)的必要條件[1]。不同成熟度煙葉的鮮煙素質(zhì)差異較大，會影響烤后煙葉的品質(zhì)。鮮煙素質(zhì)是煙葉自身具備的特征特性，主要體現(xiàn)在組織結(jié)構(gòu)、色素含量、酶活性、化學(xué)成分含量等方面[2]。鮮煙素質(zhì)是田間煙葉成熟的基礎(chǔ)，因此，與成熟度具有對應(yīng)關(guān)系。陳頤等[3]、劉輝等[4]研究表明適熟煙葉烤后質(zhì)量最佳，然后反推適熟煙葉的植物學(xué)特性指標(biāo)，得到了成熟度判斷標(biāo)準(zhǔn)。徐興陽等[5]研究了煙葉成熟度與鮮煙葉特征間的關(guān)系，得到了適宜采收的成熟度。高憲輝等[6]研究表明，可通過顏色值及其判別函數(shù)來判別煙葉的成熟度。張冰濯等[7]研究表明，SPAD 值可作為煙葉采收成熟度的判斷標(biāo)準(zhǔn)。這些研究大多通過烤后煙葉品質(zhì)來反推鮮煙葉成熟度的植物學(xué)特征，羅列不同成熟度鮮煙素質(zhì)的指標(biāo)來確定采收成熟度的判斷標(biāo)準(zhǔn)，但對不同鮮煙素質(zhì)指標(biāo)影響烤后煙葉品質(zhì)的貢獻(xiàn)度并不明確。偏最小二乘法-判別分析（partial least squares discriminant analysis,PLS-DA）屬于有監(jiān)督分析，通過預(yù)設(shè)分類盡可能去除未控制變量對數(shù)據(jù)造成的影響，進(jìn)一步挖掘數(shù)據(jù)信息，量化特征物質(zhì)造成樣品之間差異的程度[8]。因此，本研究通過PLS-DA 分析不同成熟度鮮煙素質(zhì)特征指標(biāo)對烤后煙葉品質(zhì)影響的貢獻(xiàn)度大小，為煙葉成熟度判斷標(biāo)準(zhǔn)的選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和地點

試驗于2019—2020 年在重慶市巫溪縣古路鎮(zhèn)黃陽村（海拔992.99 m，E 109°22′55″，N 31°18′50″）進(jìn)行，土壤類型為沙壤土，地勢平坦，肥力適中。供試烤煙品種為‘渝金香1號’，田間采用標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)范管理。

1.2 試驗設(shè)計

試驗按照煙葉外觀特征設(shè)置3 個成熟度，各成熟度鮮煙葉采收特征如表1 所示。各處理分別選取具有代表性的9 片鮮煙葉（中部葉：10~12 葉位）用于測定每片煙葉的色素含量、組織結(jié)構(gòu)和主要酶活性等指標(biāo)，3次重復(fù)。每個成熟度選取5竿樣煙進(jìn)行烘烤試驗，烘烤時置于同一烤房中層，按照當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)烘烤工藝進(jìn)行烘烤。烘烤結(jié)束后，對烤后煙葉進(jìn)行外觀質(zhì)量評價、化學(xué)成分檢測和感官質(zhì)量評吸。

表1 田間鮮煙葉采收特征Table 1 Harvest characteristics of fresh tobacco leaves in the field

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1葉片生理指標(biāo)的測定 各處理取中部鮮煙葉（10~12 葉位），在葉片第5~8 支脈之間，距主脈左右兩側(cè)3 cm 處用8 mm 打孔器取樣，樣品混合均勻后用于葉綠素a（chlorophyll a，CA）、葉綠素b（chlorophyll b，CB）、類胡蘿卜素（carotenoid，CD）、總?cè)~綠素含量（total chlorophyll，TC）、類葉比（ratio of carotenoids to chlorophyll，RCC）、丙二醛含量（malondialdehyde，MDA）、過氧化物酶（peroxidase，POD）活性、超氧化物歧化酶（superoxide Dismutase，SOD）活性和總淀粉酶（total amylase，TA）活性共8 項指標(biāo)的測定。其中，色素和MDA 含量及POD 和SOD 活性的測定采用分光光度法[9]；總淀粉酶活性采用3, 5-二硝基水楊酸比色法測定[10]。

1.3.2葉片組織結(jié)構(gòu)石蠟切片的制備 對田間鮮煙葉沿著葉片中部至尖部中央段兩側(cè)距主脈2～3 cm 進(jìn)行打孔取樣（圖1），將取下的葉片樣品用福爾馬林-乙酸-乙醇 （formalin-aceto-alcohol，F(xiàn)AA）固定液（70%酒精）固定保存。按照常規(guī)石蠟切片法[11]進(jìn)行切片，采用番紅-固綠染色。使用Eclipse Ci-L 拍照顯微鏡選取葉片組織的目的區(qū)域進(jìn)行100 倍成像。成像完成后使用Image-Pro Plus 6.0 分析軟件測定各部分?jǐn)?shù)據(jù)。主要包括葉片厚度（thickness of leaf，TL）、上表皮厚度（thickness of upper epidermis，TUE）、下表皮厚度（thickness of lower epidermis，TLE）、柵欄組織厚度（thickness of palisade tissue，TPT）和海綿組織厚度（thickness of spongy tissue，TST），并計算組織比（tissue ratio， TR），公式如下。

圖1 鮮煙葉取樣點Fig.1 Sampling point of fresh tobacco leaves

組織比=柵欄組織厚度/海綿組織厚度 （1）

1.3.3烤后煙葉常規(guī)化學(xué)成分測定 取不同成熟度C3F 烤后煙葉2 kg，于65 ℃條件下烘干并粉碎研磨，采用孔徑為0.25 mm 的濾篩過濾。參考張炳輝等[12]的方法，使用連續(xù)流動法測定烤后葉片的總糖、還原糖及鉀、氯、煙堿和總氮含量，并計算氮堿比、糖堿比和鉀氯比。

1.3.4烤后煙葉外觀質(zhì)量評價 由專業(yè)分級的技術(shù)人員按照GB 2635—1992 烤煙分級標(biāo)準(zhǔn)[13]進(jìn)行外觀質(zhì)量評價，包括：顏色、成熟度、結(jié)構(gòu)、身份、油分和色度。

1.3.5烤后煙葉感官質(zhì)量評價 由河南中煙技術(shù)中心專家按照YC/T 138—1998 標(biāo)準(zhǔn)[14]進(jìn)行評價。包括：香氣質(zhì)、香氣量、濃度、刺激性、雜氣、余味。

1.4 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用Excel 2016 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的初步統(tǒng)計，運(yùn)用SPSS 22.0 進(jìn)行差異顯著性分析，運(yùn)用Origin 2021進(jìn)行PLS-DA分析及圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同成熟度鮮煙色素含量變化

由表2 可知，隨著煙葉成熟度的提高，葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量逐漸降低，且不同成熟度之間存在顯著差異；而類葉比逐漸增加，其中，適熟和過熟煙葉的類葉比顯著高于尚熟煙葉，但適熟和過熟煙葉間差異不顯著。

表2 不同成熟度鮮煙葉色素含量Table 2 Pigment contents of fresh tobacco leaves with different maturity

2.2 不同成熟度鮮煙葉組織結(jié)構(gòu)差異

隨著成熟度的增加，煙葉的組織結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)由緊密到疏松的變化趨勢（表3 和圖2）。尚熟葉片的厚度顯著大于適熟和過熟葉片，而適熟與過熟間差異不顯著。適熟煙葉的上表皮厚度顯著大于尚熟煙葉；而過熟煙葉與尚熟和適熟間均差異不顯著。適熟和過熟煙葉的柵欄組織厚度顯著大于尚熟煙葉。3 個成熟度鮮煙葉的下表皮厚度、海綿組織厚度及組織比無顯著差異。

圖2 不同成熟度鮮煙葉組織結(jié)構(gòu)Fig. 2 Tissue structure of fresh tobacco leaves with different maturity （100×）

表3 不同成熟度鮮煙葉的組織結(jié)構(gòu)Table 3 Tissue structure of fresh tobacco leaves with different maturities

2.3 不同成熟度鮮煙葉主要酶活性

由圖3可知，隨著煙葉成熟度的增加，MDA含量顯著增加，表現(xiàn)為過熟>適熟>尚熟；葉內(nèi)SOD和POD 活性顯著降低，表現(xiàn)為尚熟>適熟>過熟；總淀粉酶活性先升高后降低，表現(xiàn)為適熟>過熟>尚熟，且各處理間差異顯著。

圖3 不同成熟度鮮煙葉酶活性Fig. 3 Enzyme activity of fresh tobacco leaves with different maturity

2.4 烤后煙葉常規(guī)化學(xué)成分分析

不同成熟度烤后煙葉的化學(xué)成分如表4 所示。隨著煙葉成熟度的增加，煙葉中總糖、還原糖、鉀離子含量無顯著變化；過熟煙葉的氯離子含量顯著高于適熟和尚熟煙葉；尚熟煙葉的煙堿含量顯著高于適熟煙葉，而過熟煙葉的煙堿含量與尚熟和適熟煙葉差異不顯著；適熟煙葉的氮堿比和糖堿比顯著高于尚熟和過熟煙葉。不同成熟度煙葉的鉀氯比差異不顯著，但適熟煙葉的鉀氯比為4.13，更接近優(yōu)質(zhì)煙葉[15]。

表4 不同成熟度烤后煙葉化學(xué)成分Table 4 Chemical composition of flue-cured tobacco leaves with different maturity

2.5 不同成熟度烤后煙葉外觀品質(zhì)

不同成熟度烤后煙葉外觀品質(zhì)評價如表5 所示，隨著成熟度的提高，‘渝金香1號’烤后煙葉外觀品質(zhì)的綜合評價得分呈先升高后降低趨勢，表現(xiàn)為適熟>過熟>尚熟，且不同成熟度間差異顯著。其中，適熟煙葉烤后顏色較好、成熟充分、結(jié)構(gòu)尚疏松、身份適中、油分足，色度強(qiáng)，外觀品質(zhì)較好。

表5 不同成熟度烤后煙葉外觀品質(zhì)評價Table 5 Evaluation of appearance quality of flue-cured tobacco leaves with different maturity

2.6 不同成熟度烤后煙葉感官質(zhì)量

不同成熟度烤后煙葉的感官質(zhì)量評價如表6所示，其中，適熟煙葉烤后的香氣質(zhì)、香氣量、濃度、勁頭、余味顯著優(yōu)于尚熟和過熟煙葉，且評吸得分顯著高于尚熟和過熟煙葉。由此表明，適熟煙葉烤后香氣質(zhì)較好、香氣量充足、濃度豐裕、勁頭適中、刺激性較小、雜氣較少、余味舒適，表現(xiàn)出更優(yōu)的感官品質(zhì)。

表6 不同成熟度烤后煙葉感官質(zhì)量得分Table 6 Sensory quality scores of flue-cured tobacco leaves with different maturity

2.7 鮮煙素質(zhì)指標(biāo)的回歸分析

回歸分析能夠反映不同成熟度鮮煙素質(zhì)指標(biāo)對烤后煙葉外觀質(zhì)量和感官質(zhì)量的影響，回歸系數(shù)為正值，代表該指標(biāo)與外觀質(zhì)量和感官質(zhì)量呈正相關(guān)，反之呈負(fù)相關(guān)。由圖4 可知，葉片厚度、下表皮厚度、海綿組織厚度、組織比、葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量與烤后煙葉外觀質(zhì)量和感官質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)；上表皮厚度、柵欄組織厚度、類胡蘿卜素含量與烤后煙葉外觀質(zhì)量和感官質(zhì)量呈正相關(guān)；類葉比與外觀質(zhì)量呈正相關(guān)，與感官質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。其中，上表皮厚度、柵欄組織厚度和葉綠素b 含量對烤后煙葉外觀質(zhì)量和感官質(zhì)量影響較大。

圖4 鮮煙素質(zhì)指標(biāo)對煙葉外觀質(zhì)量和感官質(zhì)量回歸系數(shù)圖Fig.4 Regression coefficient diagram of fresh tobacco quality index on tobacco appearance quality and sensory quality

2.8 不同成熟度的鮮煙素質(zhì)對烤后煙葉品量的影響

為進(jìn)一步分析鮮煙素質(zhì)指標(biāo)對烤后煙葉質(zhì)量貢獻(xiàn)度的大小，通過PLS-DA 模型下的變量重要性因子（variable importance in the projection，VIP）對其進(jìn)行排序，篩選出VIP>1 的因子作為代表性差異指標(biāo)，結(jié)果如圖5 所示。共獲得了5 個VIP>1的鮮煙素質(zhì)指標(biāo)，分別為柵欄組織厚度（VIP=1.31）、上表皮厚度（VIP=1.24）、組織比（VIP=1.22）、下表皮厚度（VIP=1.09）和類葉比（VIP=1.05）。這5個鮮煙素質(zhì)指標(biāo)對烤后煙葉的品質(zhì)影響較大。因此，在采烤前，可通過這些指標(biāo)的鑒定來確定適宜采收的成熟度，進(jìn)而提高烤后煙葉品質(zhì)。

圖5 不同鮮煙素質(zhì)的 VIP值Fig. 5 VIP values for different fresh tobacco qualities

3 討論

不同成熟度煙葉的色素含量、組織結(jié)構(gòu)和相關(guān)酶活性等指標(biāo)差異顯著[16]。本研究結(jié)果表明，隨著煙葉成熟度的提高，煙葉的葉綠素和類胡蘿卜素含量逐漸減少，類葉比逐漸增大；葉片厚度逐漸降低，上表皮和下表皮厚度、柵欄組織厚度及組織比先升高后降低；MDA 含量顯著增加，SOD 和POD 活性顯著下降，總淀粉酶活性先升高后降低，與前人研究結(jié)果一致[17-20]。

鮮煙素質(zhì)的差異是不同成熟度煙葉的內(nèi)在反映，且影響調(diào)制后煙葉的品質(zhì)[21]。光合色素含量不僅影響鮮煙葉的采收成熟度，也是影響烤后煙葉外觀質(zhì)量的重要因素[22]。疏密適中的組織結(jié)構(gòu)有利于煙葉內(nèi)理化成分的充分轉(zhuǎn)化，是形成優(yōu)質(zhì)煙葉的基礎(chǔ)[23]。MDA 含量的高低反映了細(xì)胞膜脂過氧化水平[24]，SOD 在生物抗氧化系統(tǒng)中具有重要作用[25]，各種酶活性的不同反映了煙葉細(xì)胞生理生化反應(yīng)和內(nèi)含物降解轉(zhuǎn)化的程度不同，進(jìn)而影響煙葉最終品質(zhì)的形成。本研究結(jié)果表明，適熟煙葉烤后的化學(xué)成分更為協(xié)調(diào)，外觀質(zhì)量和感官質(zhì)量均顯著優(yōu)于尚熟和過熟煙葉；上表皮和下表皮厚度、柵欄組織厚度、組織比和類葉比5 個鮮煙素質(zhì)指標(biāo)對烤后煙葉品質(zhì)影響較大（VIP>1）。其中，下表皮厚度、組織比與烤后煙葉的外觀質(zhì)量和感官質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)；上表皮厚度、柵欄組織厚度與烤后煙葉外觀質(zhì)量和感官質(zhì)量呈正相關(guān)；類葉比與外觀質(zhì)量呈正相關(guān)，與感官質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)。研究表明，上、下表皮厚度影響烘烤過程中煙葉的水分遷移和烤后煙葉身份[26]，但具體機(jī)理還有待進(jìn)一步研究；柵欄組織的厚度反映了植物保水性、適應(yīng)性的強(qiáng)弱，柵欄組織越厚，光能利用率越高[27]。適熟煙葉的柵欄組織較厚，光合效率高，因此，內(nèi)含物較為充足，烤后煙葉品質(zhì)較好。葉片緊密度與組織比呈正相關(guān)關(guān)系，而葉片緊密度影響煙葉的調(diào)制。類葉比在一定程度上可以代表煙葉的變黃程度[28]，因此，對煙葉外觀質(zhì)量影響較大。綜上所述，不同成熟度鮮煙素質(zhì)指標(biāo)與烤后煙葉品質(zhì)間關(guān)系密切，本研究篩選出5 個對烤后煙葉品質(zhì)影響較大的鮮煙素質(zhì)指標(biāo)，為煙葉成熟度判斷標(biāo)準(zhǔn)的選擇和烤后煙葉品質(zhì)的提升提供了理論依據(jù)，對煙葉的適時采收、提高烤后煙葉品質(zhì)具有重要意義。