硼脅迫下煙草葉片轉(zhuǎn)錄組分析

王瀟然， 李笑語， 孫慧， 于海東， 石永春

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，鄭州 450002）

硼元素是植物細(xì)胞壁中重要的微量元素之一，與植物碳、氮代謝及核酸合成等眾多生物學(xué)過程緊密相關(guān)[1]。硼含量的變化可能改變膜結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而將外界信號(hào)通過細(xì)胞壁-細(xì)質(zhì)膜-細(xì)胞骨架路徑傳遞到胞內(nèi)；同時(shí)，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)的硼元素與相關(guān)蛋白結(jié)合影響部分轉(zhuǎn)錄因子活性，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)內(nèi)源基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控[2]。

Ali 等[3]發(fā)現(xiàn)，高硼含量影響煙草對(duì)氮素的吸收，可能是由于硼改變了H+-ATPase 活性，影響跨膜質(zhì)子的運(yùn)輸，最終導(dǎo)致與質(zhì)子共轉(zhuǎn)運(yùn)的氮素吸收受到抑制。硼含量的改變導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)第二信使的Ca2+信號(hào)發(fā)生顯著變化，并通過調(diào)節(jié)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平和NAD(P)H 氧化酶活性影響細(xì)胞代謝過程[4]。因此，土壤中適宜的硼含量是煙葉品質(zhì)和產(chǎn)量的重要保證。研究表明，最適于煙草生長的土壤有效硼含量為0.5~1.0 mg·kg-1[5]。在我國干旱或半干旱植煙地區(qū)，土壤中硼含量多高于2.0 mg·kg-1，易造成嚴(yán)重的硼脅迫現(xiàn)象[6]。在西南煙區(qū)，重慶長江沿岸和湘西地區(qū)土壤中有效硼含量均高于煙草正常需硼量[7-8]。由于煙草對(duì)硼元素的敏感性較高，即使在缺硼地區(qū)，也容易因過量施用硼肥而導(dǎo)致短期的硼脅迫[9]。研究表明，硼脅迫會(huì)導(dǎo)致花椰菜蒸騰速率和光合速率下降[10]；白樺葉片淀粉和己糖（葡萄糖和果糖）含量降低[11]；向日葵[12]、小麥和大麥[13]根中總氮含量減少，硝酸還原酶活性下降；花生葉片中總氮和蛋白質(zhì)含量下降[14]；抑制茶樹對(duì)磷的吸收[15]。

對(duì)煙苗進(jìn)行無土栽培時(shí)，發(fā)現(xiàn)用200 mg·L-1的硼酸處理2 周即可導(dǎo)致硼脅迫現(xiàn)象，其株高僅為對(duì)照的70.00%，葉長為對(duì)照的80.93%，葉尖和葉緣出現(xiàn)變黃、干枯等現(xiàn)象[9]。但煙葉硼脅迫的臨界值和煙葉對(duì)長期硼脅迫的響應(yīng)機(jī)制都未見報(bào)道。煙葉是煙草的收獲器官，因此，為深入研究煙草對(duì)硼脅迫的響應(yīng)機(jī)理，本文通過高通量測(cè)序技術(shù)，結(jié)合生理和分子檢測(cè)技術(shù)，對(duì)煙草響應(yīng)硼脅迫的相關(guān)基因進(jìn)行初步篩選，為深入理解煙草對(duì)硼脅迫的響應(yīng)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

將栽培煙草‘K326’（Nicotiana tabccumcv.K326）種子鋪于濕潤的濾紙，萌發(fā)后轉(zhuǎn)移至滅菌的煙草專用基質(zhì)上，24 ℃、16 h 光/8 h 暗環(huán)境育苗至8葉期開始進(jìn)行硼脅迫處理。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將8 葉期煙草移入蛭石中，分別以含硼量為0、0.05、1.00、2.00、3.00 mmol·L-1的Hoagland 培養(yǎng)液澆灌，分別命名為T0、T0.05、T1、T2、T3。處理4 周，處理期間每隔3 d 澆100 mL 處理液，每次澆灌處理液之前用5 倍蛭石體積的去離子水沖淋，以確保處理水平的一致性。脅迫結(jié)束后，將第9 或第10 片葉去除葉緣和葉脈，液氮速凍后存于-80 ℃冰箱備用。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1形態(tài)學(xué)指標(biāo)測(cè)定 葉長、葉寬和根長用軟尺測(cè)量，根體積用排水法測(cè)定，根系面積用甲烯藍(lán)法[16]測(cè)定。

1.3.2生理指標(biāo)檢測(cè) 利用比色法[17]測(cè)定葉綠素含量。脯氨酸含量按照Chakrabarty 等[18]的方法進(jìn)行檢測(cè)?？偺呛坎捎幂焱╗17]定量檢測(cè)。使用蔗糖/葡萄糖/果糖試劑盒（德國拜發(fā)，E0139 041）分析果糖、葡萄糖和蔗糖含量。依據(jù)鄒琦[17]的方法測(cè)定淀粉含量。依據(jù)Van 等[19]的方法檢測(cè)纖維素含量。果膠含量按照比色法[20]進(jìn)行測(cè)定。蛋白質(zhì)含量按照Bradford 等[21]的方法測(cè)定，H2O2含量按照Liu 等[22]的方法進(jìn)行檢測(cè)。硼含量采用楊潔等[23]的方法用安捷倫ICP-OES 光譜儀測(cè)定。

1.3.3抗氧化酶活性測(cè)定 過氧化氫酶（catalase，CAT）活性采用紫外吸收法，過氧化物酶（peroxidase，POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）采用硝基四氮唑藍(lán)還原法測(cè)定[17]；蔗糖合成酶（sucrose synthetase，SS）、蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate synthetase，SPS）活性的測(cè)定采用Pramanik等[24]的方法測(cè)定。

1.4 高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)分析

將T0.05和T2處理后凍存的煙草葉片送到壹基因公司測(cè)序，每個(gè)處理3 次重復(fù)。提取樣品總RNA 并使用DNase Ⅰ消化，然后用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA；打斷后合成一鏈cDNA 和二鏈cDNA，回收加接頭，再進(jìn)行PCR 擴(kuò)增建庫；質(zhì)檢合格后用Illumina HiSeqTM4000 測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。將獲得的原始序列（raw reads）進(jìn)行質(zhì)控（quality control，QC）后過濾得到分析數(shù)據(jù)（clean reads），用SOAPaligner/SOAP2 與參考序列進(jìn)行比對(duì)，而后利用R語言DESeq數(shù)據(jù)包篩選差異表達(dá)的基因（differentially expressed genes，DEGs），篩選標(biāo)準(zhǔn)為|log2Ratio|≥1 且FDR（false discovery rate）≤0.05。利用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（https://www.genome.jp/kegg/）和The Gene Ontology Resource（http://geneontology.org/）數(shù)據(jù)庫對(duì)差異基因進(jìn)行注釋，利用R 語言完成GO 和KEGG pathway顯著性富集分析。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

隨機(jī)選取部分差異表達(dá)基因?qū)ι鲜鰞龃娴臉悠愤M(jìn)行熒光定量PCR 檢測(cè)，以actin為內(nèi)參，參照TB Green?Premix Ex Taq? Ⅱ (TliRNaseH Plus，TaKaRa 公司)試劑盒的說明書配制反應(yīng)體系。所用引物如表1所示。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 21.0 和Excel 2010 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 硼脅迫對(duì)煙草生長的影響

為明確硼脅迫對(duì)煙葉生長的影響，以煙草栽培種‘K326’為試驗(yàn)材料，在8 葉期連續(xù)4 周進(jìn)行不同水平的硼處理，結(jié)果（圖1）表明，處理4周后，與T0相比，硼脅迫處理均導(dǎo)致煙株矮小，葉片變小，且對(duì)煙葉生長的抑制作用隨硼用量的增加而加重。其中，T0.05的葉片略小但生長狀態(tài)最好，T1處理出現(xiàn)葉緣輕微焦枯現(xiàn)象；T2處理葉緣出現(xiàn)明顯焦枯現(xiàn)象；T3處理則更嚴(yán)重。分析不同處理下煙葉的葉長和葉寬，結(jié)果（圖2）表明，處理組第10葉的葉長和葉寬均顯著低于對(duì)照，且表現(xiàn)為隨硼含量的增加而減少，其中T2和T3處理又極顯著低于T0.05和T1處理；而T0.05與T1處理、T2與T3處理間差異不顯著。因此，后續(xù)試驗(yàn)及分析均以2.00 mmol·L-1（T2處理）進(jìn)行硼脅迫處理。

圖1 不同硼處理下煙草的生長Fig. 1 Growth of tobacco in different treatments

圖2 不同處理下煙草的葉片形態(tài)Fig. 2 Morphological indexes of tobacco leaves in different treatments

2.2 硼脅迫對(duì)煙葉內(nèi)主要成分的影響

為進(jìn)一步分析硼脅迫抑制煙葉生長的原因，對(duì)T0和T2處理煙草相同葉位葉片的硼含量及其生理指標(biāo)和酶活性進(jìn)行了對(duì)比分析（表2~4）。結(jié)果表明，硼脅迫4 周后，硼主要積累在煙葉中，T2處理葉片中的硼含量是T0的7.256 倍；莖和根中的硼含量分別為T0的1.353 和1.554 倍（表2）。硼脅迫處理葉片中的可溶性總糖含量極顯著降低，僅為T0的57.7%；葡萄糖和果糖含量變化較小，但蔗糖含量顯著降低，僅為T0的38.4%；淀粉含量顯著下降，為T0的48.7%；葉綠素及類胡蘿卜素含量與T0差異不顯著；作為細(xì)胞壁主要組成成分的纖維素和果膠，硼脅迫處理后分別降至T0的64.0%和65.9%；硼脅迫極顯著提高了煙葉中脯氨酸、蛋白質(zhì)和H2O2含量，分別為T0的1.582、1.421、5.198倍（表3）。酶活性檢測(cè)顯示（表4），T2處理葉片中SOD 活性極顯著低于T0；POD 活性極顯著高于T0；SPS 活性顯著高于T0；SS 活性與T0差異不顯著。

表2 不同處理下煙株各器官的硼含量Table 2 Boron contents in different tissues of tobacco under different treatments （mg·g-1 DW）

表3 不同處理下煙草葉片的生理指標(biāo)Table 3 Physiological indexes of tobacco leaves under different treatments （mg·g-1 FW）

表4 不同處理煙草葉片的酶活性Table 4 Enzyme activities in tobacco leaves of different treatments（U·g-1）

2.3 硼脅迫對(duì)煙草葉片中碳代謝的影響

形態(tài)及生理指標(biāo)檢測(cè)證實(shí)，高水平硼脅迫影響煙葉的物質(zhì)代謝及生長發(fā)育，但煙草的正常生長又需要硼，因此，為篩選響應(yīng)高濃度硼脅迫的基因及代謝通路，本研究以T0.05（常規(guī)Hoagland培養(yǎng)液）為對(duì)照，T2為處理對(duì)煙葉樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，共獲得差異表達(dá)基因389 個(gè)。對(duì)上述基因進(jìn)行KEGG富集分析，獲得顯著富集的前20個(gè)途徑，硼脅迫主要影響煙草次生代謝物的合成、苯丙烷類合成、植物和病原菌互作、苯丙氨酸代謝，植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、淀粉和蔗糖代謝、芪類和姜醇代謝、黃酮類合成、氨基糖和核苷酸糖代謝、亞麻酸和甘油磷脂代謝等途徑（圖3）。

圖3 硼脅迫響應(yīng)基因KEGG富集分析Fig. 3 KEGG enrichment analysis of DEGs responding to boron toxicity

在淀粉和蔗糖代謝途徑中，硼脅迫處理后，煙葉中內(nèi)切葡聚糖酶11（LOC104086800）和18（LOC104216009）、β-淀粉酶3（LOC104239567）、果膠酯酶（LOC104118953）、α, α-海藻糖磷酸合酶11 同型X1（LOC104236587）、β-D-木糖苷酶2（LOC104210063）顯著上調(diào)；內(nèi)切葡聚糖酶6 類（LOC104116779、 LOC104215840）、海藻糖酶（LOC107800135）、β-葡糖苷酶13 類同型X1（LOC104110715）、β-D-木糖苷酶5（LOC104228982）、蠶豆氰苷水解酶（LOC104218490）、半乳糖醛酸轉(zhuǎn)移酶類1（LOC104087120）、果膠酯酶抑制子51 同型X1（LOC104117285）顯著下調(diào)（表5）。其中，上調(diào)的磷酸海藻糖合酶催化合成海藻糖，下調(diào)的海藻糖酶降解海藻糖，這可能導(dǎo)致煙葉中海藻糖的積累。由于海藻糖參與植物的抗病信號(hào)途徑[25]，這一現(xiàn)象可能暗示硼參與煙草抗病信號(hào)調(diào)控。另外，上調(diào)的內(nèi)切葡聚糖酶和果膠酯酶分別催化纖維素和果膠的分解；果膠酯酶抑制子51 同型X1的下調(diào)則進(jìn)一步促進(jìn)了果膠的水解。β-D-木糖苷酶參與木聚糖的分解，不同種類β-D-木糖苷酶的表達(dá)水平變化可能暗示木聚糖的分解在不同的組織中受到的影響不同。

表5 響應(yīng)硼脅迫的淀粉和蔗糖代謝途徑相關(guān)基因Table 5 Genes related to starch and sucrose metabolic pathways responding to boron toxicity

2.4 硼脅迫對(duì)煙葉脂類代謝的影響

脂類是煙葉中重要的香氣來源和組成成分，KEGG 分析表明，硼脅迫導(dǎo)致脂類代謝途徑相關(guān)基因的表達(dá)豐度發(fā)生波動(dòng)（表6）。其中涉及脂肪酸合成的乙酰CoA 羧化酶1 類（LOC104089343）、3- 酮二氫鞘氨醇還原酶類同型 X2（LOC1042 45391）均顯著下調(diào)，表明脂肪酸的合成受到抑制；參與脂肪酸降解的過氧化物酶體中的?；鵆oA 氧化酶2（LOC104119660）顯著上調(diào)，表明硼脅迫可能促進(jìn)脂肪酸的降解；而參與脂肪酸延長的3-酮酯酰CoA 合酶6（LOC104214086、LOC104094697）、3- 酮酯酰CoA 合酶19 類（LOC104228778、 LOC104218838）、長鏈?；鵆oA合成酶2（LOC104110787）顯著下調(diào)，暗示硼脅迫可能抑制長鏈脂肪酸的合成；但涉及不飽和脂肪酸合成的長鏈烯酰CoA 還原酶類（LOC104114213）顯著上調(diào)，推測(cè)硼脅迫可能影響某些長鏈不飽和脂肪酸的含量。

表6 響應(yīng)硼脅迫的脂肪酸代謝途徑相關(guān)基因Table 6 Fatty acid metabolic related genes that responding to boron toxicity

2.5 硼脅迫影響煙葉的抗逆能力

硼脅迫導(dǎo)致煙葉中脯氨酸含量和酶活性發(fā)生變化，由此表明硼脅迫可能影響煙草的抗逆性。由表7 可知，硼脅迫后，除抗病蛋白R(shí)PP13（LOC104234903）基因顯著下調(diào)外，堿性發(fā)病相關(guān)蛋白PR1（LOC104235161）、抗病蛋白（LOC104116631）、抗病蛋白R(shí)PM1 類（LOC104233182）的表達(dá)顯著上調(diào)；富含半胱氨酸的受體類蛋白激酶3（LOC104216132）、響應(yīng)脅迫的G 類植物凝集素S-受體類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激 酶 At4g27290 同 型 X1（LOC104217774、LOC104241125、 LOC104246103）的表達(dá)水平上調(diào)，僅G 類植物凝集素S-受體類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶At5g24080 同型X1（LOC104096948）表達(dá)下調(diào)；富含脯氨酸的受體類蛋白激酶PERK9（LOC104103311）表達(dá)水平上調(diào)；響應(yīng)脅迫的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶激酶1 類（LOC104236563、LOC104091723）表達(dá)水平上調(diào)；PTI1 類酪氨酸蛋白激酶At3g15890 類（LOC104223256）、ZmPK1 類受體類蛋白激酶（LOC104084644）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶同型X2（LOC104216857）的表達(dá)水平上調(diào)；響應(yīng)脅迫的多聚半乳糖醛酸酶抑制劑類（LOC104112558） 、 轉(zhuǎn) 錄 因 子 PIF1 類（LOC104093573）、參與抗病途徑的TIFY8（LOC104239595）的表達(dá)水平上調(diào)，呼吸爆發(fā)氧化酶蛋白E類（LOC104111058）的表達(dá)下調(diào)。

表7 響應(yīng)硼毒害的生物脅迫應(yīng)答基因Table 7 Genes responding to boron toxicity

2.6 硼脅迫影響煙葉的激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

激素是調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的重要信號(hào)之一。轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，硼脅迫造成多個(gè)激素信號(hào)通路改變（表8）。響應(yīng)乙烯（ethylene）信號(hào)途徑的乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子ERF003（LOC104096661）和乙烯受體蛋白（LOC107784797）表達(dá)水平上調(diào)，表明硼脅迫激活乙烯信號(hào)途徑。硼脅迫處理后，煙葉中的生長素（IAA）受體蛋白TIR1（LOC104085449）表達(dá)水平顯著下調(diào)；而抑制生長素信號(hào)的生長素響應(yīng)蛋白IAA26（LOC104100899）和生長素響應(yīng)因子ARF9（LOC104243881）表達(dá)水平上調(diào)，表明生長素信號(hào)途徑被顯著抑制，從而影響煙葉生長。響應(yīng)茉莉酸（jasmonic acid，JA）信號(hào)途徑的TIFY8蛋白（LOC104239595）和響應(yīng)水楊酸（salicylic acid，SA）信號(hào)途徑的轉(zhuǎn)錄因子 TGA2.1（LOC107782457）的表達(dá)水平均上調(diào)，它們都能激活堿性PR1 蛋白（LOC104235161），從而增強(qiáng)煙葉抗病性。負(fù)調(diào)控脫落酸（abscisic acid，ABA）信號(hào)的蛋白磷酸酶PP2C 37（LOC104086506）表達(dá)水平下調(diào)；響應(yīng)ABA 的轉(zhuǎn)錄因子PIF1（LOC104093573）表達(dá)水平上調(diào)，推測(cè)硼脅迫促進(jìn)了ABA信號(hào)途徑。

表8 響應(yīng)硼脅迫的植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因Table 8 Genes related to hormone signal transduction in plants responding to boron toxicity

2.7 熒光定量PCR驗(yàn)證分析

為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性，隨機(jī)選取8個(gè)差異基因（表1）進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，而后將驗(yàn)證基因T2/T0.05的相對(duì)表達(dá)倍數(shù)取Log2，與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比對(duì)線性關(guān)系，結(jié)果（圖4）顯示，二者間存在良好的線性關(guān)系（R2=0.872 6），表明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)真實(shí)可靠。

圖4 差異表達(dá)基因qRT-PCR驗(yàn)證Fig. 4 Validation of transcript abundance of differentially expressed genes based on qRT-PCR

3 討論

硼脅迫影響植物生長發(fā)育已經(jīng)被廣泛報(bào)道，在棉花、小麥等作物中均有發(fā)現(xiàn)[26-27]；在煙草中，硼脅迫影響煙株的農(nóng)藝性狀，并導(dǎo)致凈光合速率、POD 活性、干物質(zhì)量及經(jīng)濟(jì)效益均顯著降低[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，硼脅迫導(dǎo)致煙株矮小，煙葉變小變厚；且發(fā)現(xiàn)硼主要積累于煙葉中，硼毒害造成煙葉中可溶性總糖含量顯著降低，僅為對(duì)照的57.7%，其中蔗糖含量僅為對(duì)照的38.4%；淀粉、纖維素和果膠的含量也顯著降低。組學(xué)分析顯示，負(fù)責(zé)降解淀粉的β-淀粉酶3（LOC104239567）和纖維素的內(nèi)切葡聚糖酶11（LOC104086800）、18（LOC104216009）均上調(diào)表達(dá)，與生理檢測(cè)結(jié)果趨勢(shì)一致。Massod 等[29]對(duì)小麥進(jìn)行高硼脅迫6 周后，也發(fā)現(xiàn)葉片中總糖和蔗糖含量顯著降低，認(rèn)為這是由于礦質(zhì)元素紊亂造成的碳代謝抑制。高硼處理鳳梨也導(dǎo)致葉片中礦質(zhì)元素紊亂，總糖和淀粉含量降低[30]。長期高硼脅迫導(dǎo)致煙草的總糖含量降低是否也與礦質(zhì)元素紊亂有關(guān)，且影響了哪些礦質(zhì)元素，還有待進(jìn)一步的研究。

在大豆中發(fā)現(xiàn)硼脅迫導(dǎo)致脂肪酸總量降低，尤其是軟脂酸顯著降低[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，硼脅迫造成煙草脂肪酸從頭合成途徑的關(guān)鍵酶乙酰CoA羧化酶表達(dá)水平下調(diào)，而脂肪酸β-氧化途徑的?；鵆oA 氧化酶表達(dá)水平上調(diào)，參與脂肪酸延長途徑的3-酮酯酰CoA合酶和長鏈?；鵆oA合成酶表達(dá)水平下調(diào)，表明硼脅迫可能在促進(jìn)脂肪酸降解的同時(shí)，又抑制了脂肪酸、尤其是長鏈脂肪酸的合成，進(jìn)而導(dǎo)致煙葉中脂肪酸含量降低。脂肪酸是脂類物質(zhì)合成的原料，其含量降低將導(dǎo)致煙葉油分減少，品質(zhì)下降。同時(shí)，脂肪酸是合成細(xì)胞膜的主要成分之一，其合成受阻可能干擾細(xì)胞的正常分裂。

氮素代謝直接關(guān)系煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)。番茄受硼脅迫后葉片中谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性升高，蛋白質(zhì)含量隨硼脅迫強(qiáng)度的升高而增加[32]。大豆[31]種子、擬南芥[33]和玉米[34]葉中的蛋白質(zhì)也隨著硼脅迫強(qiáng)度的增加而增加。本研究發(fā)現(xiàn)，硼脅迫后煙葉中蛋白質(zhì)含量顯著增加。盡管組學(xué)分析未檢測(cè)到氮素代謝相關(guān)基因的表達(dá)變化，但其他作物在硼脅迫后蛋白含量增加，由此推斷硼脅迫可能在加速糖類分解代謝的同時(shí)，促進(jìn)了糖類碳骨架向蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)換。

硼與植物的抗病性密切相關(guān)[35]。植物的抗病能力通常借助抗氧化酶活性的提高、啟動(dòng)超敏反應(yīng)、增強(qiáng)防御基因表達(dá)等體現(xiàn)[36]。Rezaee 等[37]發(fā)現(xiàn)，0.1 mmol·L-1硼處理洋桔梗24 h 后，洋桔梗中的SOD、過氧化氫酶（catalase，CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性增強(qiáng)，其中CAT 尤其顯著。Kayihan 等[33]將擬南芥在含有3.0 mmol·L-1硼的MS 培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d，其葉片中GR、DHAR和APX基因的表達(dá)水平顯著增加，表明激活了AsA-GSH 循環(huán)，提高了擬南芥抗氧化能力和抗病性。本研究發(fā)現(xiàn)，硼脅迫處理煙株4周，不僅顯著增強(qiáng)了煙葉POD 活性，還在植物抗病機(jī)制信號(hào)途徑中，上調(diào)了發(fā)病相關(guān)蛋白PR1、抗病蛋白R(shí)PM1 以及響應(yīng)脅迫的大量受體類蛋白激酶基因的表達(dá)，如富含半胱氨酸的受體類蛋白激酶3、G類植物凝集素S-受體類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[38]、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶激酶[39]等關(guān)鍵生物脅迫應(yīng)答基因的表達(dá)水平，因此，硼元素可能具有提升植物耐受生物脅迫的能力。盡管如此，但高硼積累通常引發(fā)煙草代謝紊亂，使其產(chǎn)量及品質(zhì)下降。因此，探索科學(xué)合理的硼肥施用方案，可實(shí)現(xiàn)在穩(wěn)產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的同時(shí)，提升煙株抗病性，在煙草乃至其他作物栽培過程中具有重要應(yīng)用價(jià)值。

植物生長受多種激素信號(hào)系統(tǒng)的綜合調(diào)控。Eggert 等[40]研究了油菜幼苗受短期（7 d）低硼處理（2.0 mg B·kg-1土）后葉片中的激素變化，發(fā)現(xiàn)隨硼水平的增加，葉片中IAA 和ABA 含量降低，GA含量增加，SA 含量無顯著變化。對(duì)玉米葉面噴施萘乙酸（naphthlcetic acid，NAA）和IAA，可有效降低硼脅迫對(duì)葉片造成的氧化脅迫[35]。由此推測(cè)，激素信號(hào)途徑可能是硼脅迫抑制植物生長的主要途徑，尤其是IAA信號(hào)途徑。本研究發(fā)現(xiàn)，硼脅迫處理4 周后，煙葉中多個(gè)激素信號(hào)途徑相關(guān)基因表達(dá)發(fā)生變化。其中IAA 受體TIR1的表達(dá)水平顯著下調(diào)；SA 信號(hào)途徑中的TGA表達(dá)水平上調(diào)；乙烯信號(hào)途徑中的乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子ERF 和乙烯受體蛋白的表達(dá)水平上調(diào)，暗示硼脅迫還可能激活煙葉中SA 和乙烯信號(hào)途徑。硼脅迫導(dǎo)致負(fù)調(diào)控ABA 信號(hào)的蛋白磷酸酶基因PP2C-37的表達(dá)水平下調(diào)，響應(yīng)ABA的轉(zhuǎn)錄因子基因PIF1的表達(dá)水平上調(diào)[41]，推測(cè)硼脅迫促進(jìn)了ABA 信號(hào)途徑信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。由于SA 和ABA 信號(hào)途徑與植物的抗病和抗逆響應(yīng)機(jī)制密切相關(guān)[34]，通過檢測(cè)SA 信號(hào)途徑中的TGA、ABA 信號(hào)途徑中的PP2C 和抗病蛋白PR1 的表達(dá)變化，可為硼在煙葉抗病或抗逆機(jī)制中的應(yīng)用提供參考。