大豆SWEET 基因在莢粒發(fā)育過(guò)程中與逆境脅迫下的表達(dá)

柯博洋， 李文龍， 張彩英*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071001； 2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河北 保定 071001）

光合作用產(chǎn)生的糖類(lèi)物質(zhì)不僅是植物重要的碳源和能量貯存形式，而且是重要的信號(hào)傳遞分子，在植物生長(zhǎng)發(fā)育及抵御各種生物與非生物脅迫中發(fā)揮著重要作用[1-2]。然而，糖類(lèi)物質(zhì)在葉片中合成以后必需經(jīng)過(guò)韌皮部的運(yùn)輸才能到達(dá)其他組織部位或器官進(jìn)而發(fā)揮功能。由于糖類(lèi)物質(zhì)不能獨(dú)立地實(shí)現(xiàn)跨膜運(yùn)輸，因而需要糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[3-4]。

SWEET（sugars will eventually be exported transporters）是一類(lèi)重要的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，一般含有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域[5]。辛紅佳等[6]利用擬南芥SWEET1 /2 /3突變體證實(shí)，SWEET基因具有調(diào)控角果生長(zhǎng)發(fā)育的功能。Li 等[7]發(fā)現(xiàn)，水稻基因組有21 個(gè)SWEET基因，其中7個(gè)參與種子發(fā)育，SWEET基因突變后可造成植株花粉活力下降、穎果和種子發(fā)育不良。Hu等[8]發(fā)現(xiàn)，黃瓜基因組有17個(gè)SWEET基因，其在不同組織、器官中的表達(dá)存在較大差別，如CsSWEET3與CsSWEET15在莖中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，CsSWEET1、CsSWEET9和CsSWEET10等在雄花中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，CsSWEET7a和CsSWEET7b等在果實(shí)中優(yōu)勢(shì)表達(dá)。Qin 等[9]發(fā)現(xiàn)，小麥基因組有105 個(gè)SWEET基因，其中59%的基因在干旱、高溫以及鹽脅迫處理后表達(dá)量發(fā)生改變。Li 等[10]發(fā)現(xiàn)，甘薯IbSWEET10在尖孢鐮刀菌侵染后上調(diào)表達(dá)，過(guò)表達(dá)IbSWEET10可提高甘薯抗病性。由此可見(jiàn)，糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)于植物正常生長(zhǎng)發(fā)育以及抗病和抗逆具有重要意義。

與其他植物相比，目前關(guān)于大豆SWEET基因的研究較少，且主要集中在功能基因挖掘方面。Wang等[11]發(fā)現(xiàn)，GmSWEET10a（Glyma.15G049200）和GmSWEET10b（Glyma.08G183500）通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)蔗糖和己糖來(lái)影響種子大小及油分含量。Zhang等[12]在15 號(hào)染色體定位到油分含量數(shù)量性狀基因座（quantitative trait locus,QTL），該QTL 區(qū)間含有1個(gè)SWEET基因（GmSWEET39），進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，GmSWEET39在大豆種皮優(yōu)勢(shì)表達(dá)，且通過(guò)控制糖類(lèi)物質(zhì)從種皮向種胚的運(yùn)輸影響油分含量。Miao 等[13]測(cè)定了382 份大豆品種資源的油脂及其組分含量，經(jīng)群體進(jìn)化與關(guān)聯(lián)分析獲得油脂含量顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，并在其連鎖不平衡范圍內(nèi)尋找到1 個(gè)SWEET基因（GmSWEET39），進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，GmSWEET39在大豆籽粒高表達(dá)，且與油脂含量顯著正相關(guān)，轉(zhuǎn)化GmSWEET39優(yōu)勢(shì)單倍型可顯著提高轉(zhuǎn)基因擬南芥和大豆毛狀根的油脂含量。Patil 等[14]在2015 年利用已測(cè)序大豆品種‘Williams82’基因組序列（Wm82.a1.v1 版本）預(yù)測(cè)出52 個(gè)SWEET基因，但隨著測(cè)序技術(shù)和基因組組裝質(zhì)量的提高，目前‘Williams82’基因組已更新到Wm82.a4.v1 版本[15]，且野生大豆基因組也已公布[16]，因此，利用最新公布基因組分析栽培大豆和野生大豆SWEET基因，并研究其在大豆生長(zhǎng)發(fā)育尤其是豆莢和籽粒發(fā)育以及抵御生物和非生物脅迫中的作用意義重大。

鑒于此，本研究利用栽培大豆‘Williams82’和野生大豆‘W05’最新基因組數(shù)據(jù)分析SWEET基因，并利用栽培大豆豆莢和籽粒不同發(fā)育時(shí)期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，以及接種花葉病毒不同時(shí)間的葉片轉(zhuǎn)錄組和低磷脅迫處理不同時(shí)間的根系轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析SWEET基因表達(dá)量，篩選參與豆莢和籽粒發(fā)育以及抗病和耐低磷的候選基因，為利用SWEET基因提高豆莢和籽粒產(chǎn)量以及抗病、抗逆能力奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

不同栽培大豆品種（小莢品種‘KN7’和大莢品種‘C813’）豆莢5 個(gè)不同發(fā)育時(shí)期（PT1~PT5，分別為開(kāi)花后5、7、9、12、17 d）轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[17]；不同栽培大豆品種（‘Z92116’和‘QH30’）籽粒5個(gè)不同發(fā)育時(shí)期（ST1~ST5，分別為開(kāi)花后 24、31、38、45、52 d）轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[18]；不同大豆品種（抗病品種‘QH30’和感病品種‘Z92116’）接種花葉病毒（soybean mosaic virus，SMV）SC7 株系7 個(gè)不同時(shí)間（0、3、10、24、120、240、336 h）葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[19]；不同大豆品種（耐低磷品種‘ZH15’和不耐低磷品種‘NMH’）低磷脅迫處理5個(gè)不同時(shí)間（0、7、28、49、70 d）根系轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[20]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1栽培大豆與野生大豆SWEET基因鑒定首先從NCBI 網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載最新版的blast-2.13.0+，然后從大豆公共數(shù)據(jù)庫(kù)Soybase網(wǎng)站（https://www.soybase.org/）下載栽培大豆‘Williams82’最新版本基因組（Wm82.a4.v1）[15]和野生大豆‘W05’基因組（W05.a1.v1）[16]CDS（coding sequence）序列，并以上述CDS 序列為基礎(chǔ)分別建立栽培大豆和野生大豆核酸數(shù)據(jù)庫(kù)；隨后以擬南芥AtSWEET11 氨基酸序列為查詢(xún)序列，利用Tblastn 分別在上述2 個(gè)核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中搜尋匹配閾值小于1e-5 的核酸序列，進(jìn)而獲得栽培大豆和野生大豆基因組中的SWEET基因。

1.2.2栽培大豆與野生大豆SWEET基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建 首先在栽培大豆‘Williams82’和野生大豆‘W05’基因組CDS 序列中查找上述SWEET基因序列，并單獨(dú)提取上述序列，進(jìn)而獲得包含SWEET基因序列的fasta 文件；然后將該fasta 格式文件進(jìn)行mafft 比對(duì)，并使用MEGA 剪切掉匹配性較差的區(qū)段，將結(jié)果保存為fas 文件；隨后使用fasttree 軟件構(gòu)建栽培大豆與野生大豆SWEET基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，并利用iqtree 軟件進(jìn)行可視化調(diào)整，將最終結(jié)果保存為pdf 格式輸出。

1.2.3栽培大豆SWEET基因在豆莢不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)分析 利用2 個(gè)鮮莢大小不同品種（小莢品種‘KN7’和大莢品種‘C813’）開(kāi)花后5個(gè)不同豆莢發(fā)育時(shí)期（PT1~PT5）的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[17]，分析SWEET基因的表達(dá)情況，并依據(jù)基因表達(dá)模式進(jìn)行分組，篩選影響豆莢發(fā)育的SWEET基因，采用HemI熱圖軟件對(duì)基因表達(dá)量進(jìn)行作圖。

1.2.4栽培大豆SWEET基因在種子不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)分析 利用2 個(gè)不同品種（‘Z92116’和‘QH30’）籽粒5個(gè)不同發(fā)育時(shí)期（ST1~ST5）的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[18]分析SWEET基因表達(dá)情況，并依據(jù)基因表達(dá)模式對(duì)基因進(jìn)行分組，篩選影響籽粒發(fā)育的SWEET基因，采用HemI熱圖軟件作圖。

1.2.5SWEET基因在大豆葉片接種SMV 不同時(shí)間表達(dá)分析 利用抗感SMV特性不同的2個(gè)栽培大豆品種（抗病品種‘QH30’和感病品種‘Z92116’）接種大豆花葉病毒SC7 株系（黃淮海大豆生態(tài)區(qū)SMV 主要流行株系）7 個(gè)不同時(shí)間的葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[19]分析SWEET基因表達(dá)情況，并依據(jù)基因表達(dá)模式對(duì)其進(jìn)行分組，篩選可能參與大豆抗花葉病毒反應(yīng)的SWEET基因，采用HemI 熱圖軟件作圖。

1.2.6SWEET基因在大豆根系低磷處理不同時(shí)間表達(dá)分析 利用耐低磷大豆品種‘ZH15’和不耐低磷品種‘NMH’低磷處理5個(gè)不同時(shí)間的根系轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[20]分析SWEET基因表達(dá)情況，并依據(jù)基因表達(dá)模式對(duì)其進(jìn)行分組，篩選可能參與大豆耐低磷反應(yīng)的SWEET基因，采用HemI 熱圖軟件作圖。

1.2.7SWEET基因在不同大豆品種資源間的SNP 分析 利用Soybase 網(wǎng)站公布的1 556 份大豆品種資源重測(cè)序數(shù)據(jù)[21]，分析SWEET基因內(nèi)部的非同義突變單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP），并根據(jù)SNP 突變位置以及基因編碼蛋白的序列，在NCBI 網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）分析突變位點(diǎn)是否位于基因編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。

2 結(jié)果與分析

2.1 栽培大豆與野生大豆基因組SWEET 基因分析

2.1.1栽培大豆基因組SWEET基因分析 為提供栽培大豆SWEET基因最新信息，利用‘Williams82’最新版本基因組（Wm82.a4.v1）分析SWEET基因，獲得其基因ID、起始和終止物理位置以及編碼區(qū)長(zhǎng)度等信息，共獲得48個(gè)SWEET基因（表1），其編碼蛋白長(zhǎng)度在174~354 個(gè)氨基酸，位于15 條染色體（2、3、4、5、6、8、9、12、13、14、15、17、18、19和20號(hào)染色體），以8號(hào)和6號(hào)染色體分布的SWEET基因數(shù)量最多。并且發(fā)現(xiàn)，上述48個(gè)SWEET基因中有43 個(gè)可與已報(bào)道[14]預(yù)測(cè)的SWEET基因進(jìn)行對(duì)應(yīng)，但基因的物理位置以及部分基因的長(zhǎng)度因‘Williams82’基因組版本更新而發(fā)生改變，其中一些基因的編碼蛋白長(zhǎng)度也發(fā)生變化，故本研究重新預(yù)測(cè)的SWEET基因結(jié)果將為今后克隆這些基因、分析基因表達(dá)以及研究其生物學(xué)功能提供參考。

表1 栽培大豆基因組48個(gè)SWEET基因信息Table 1 Information of 48 SWEET genes in cultivated soybean genome

2.1.2野生大豆基因組SWEET基因分析 為挖掘利用野生大豆SWEET基因，利用野生大豆‘W05’基因組分析SWEET基因，獲得其基因ID、起始和終止物理位置以及編碼區(qū)長(zhǎng)度等信息，共獲得51 個(gè)SWEET基因（表2），其編碼蛋白長(zhǎng)度在84~392 個(gè)氨基酸，位于16 條染色體（2、3、4、5、6、8、9、11、12、13、14、15、17、18、19和20號(hào)染色體），并以8號(hào)、6號(hào)和4號(hào)染色體分布的SWEET基因數(shù)量較多。

表2 野生大豆基因組51個(gè)SWEET基因信息Table 2 Information of 51 SWEET genes in wild soybean genome

2.1.3栽培與野生大豆SWEET基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析 為進(jìn)一步分析上述48 個(gè)栽培大豆SWEET基因和51 個(gè)野生大豆SWEET基因之間的關(guān)系，對(duì)這99 個(gè)SWEET基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果（圖1）發(fā)現(xiàn)，99 個(gè)基因可分為3 個(gè)亞組，其中第Ⅰ亞組包含16 個(gè)基因，第Ⅱ亞組包含26 個(gè)基因，第Ⅲ亞組包含57 個(gè)基因；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，除野生大豆W05.11g030581和W05.u055442等個(gè)別基因外，其余基因均可在野生大豆與栽培大豆之間形成“兩兩配對(duì)”關(guān)系，如野生大豆W05.03g007786和栽培大豆Glyma.03G209600、野生大豆W05.19g050127和栽培大豆Glyma.19G009800等，這些“配對(duì)”基因間相似性更高，為利用野生大豆SWEET基因提供了依據(jù)，也為今后研究SWEET基因從野生大豆到栽培大豆的進(jìn)化奠定了基礎(chǔ)。

圖1 栽培大豆與野生大豆SWEET基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 1 Phylogenetic tree of SWEET genes in cultivated and wild soybeans

2.2 栽培大豆SWEET基因表達(dá)分析

2.2.1豆莢不同發(fā)育時(shí)期SWEET基因表達(dá)分析 通過(guò)分析SWEET基因在2個(gè)大豆品種5個(gè)豆莢發(fā)育時(shí)期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖2），有16個(gè)基因在豆莢表達(dá)，根據(jù)其表達(dá)情況可將這16 個(gè)基因分為3 類(lèi)。第1 類(lèi)基因的表達(dá)量（以PT1時(shí)期為對(duì)照）隨豆莢發(fā)育在2個(gè)品種中均至少有1個(gè)時(shí)期呈現(xiàn)增加，如Glyma.06G122200、Glyma.14G159900和Glyma.14G160100等，其中Glyma.06G122200在2 個(gè)品種的PT2、PT3、PT4和PT5時(shí)期的表達(dá)量均高于PT1時(shí)期，Glyma.06G166800在‘KN7’的PT4和PT5時(shí)期以及‘C813’的PT3、PT4和PT5時(shí)期的表達(dá)量均高于PT1時(shí)期，說(shuō)明這些基因的高表達(dá)對(duì)不同類(lèi)型品種豆莢發(fā)育具有重要意義。

圖2 豆莢不同發(fā)育時(shí)期SWEET基因表達(dá)分析Fig. 2 Expressions of SWEET genes in different soybean pod developmental stages

第2 類(lèi)基因的表達(dá)量只隨其中1 個(gè)品種豆莢發(fā)育出現(xiàn)上升，如Glyma.05G122200、Glyma.08G077200和Glyma.19G009900等，其中Glyma.05G122200在‘KN7’的PT2和PT3時(shí)期表達(dá)量高于PT1時(shí)期，Glyma.08G077200在‘KN7’的PT2、PT3和PT4時(shí)期表達(dá)量高于PT1時(shí)期，說(shuō)明這些基因的高表達(dá)只與特定品種的豆莢發(fā)育有關(guān)。第3 類(lèi)基因的表達(dá)隨豆莢發(fā)育沒(méi)有發(fā)生明顯改變，如Glyma.05G202700、Glyma.08G010000、Glyma.13G169700和Glyma.15G211800。

2.2.2籽粒不同發(fā)育時(shí)期SWEET基因表達(dá)分析 通過(guò)分析SWEET基因在2個(gè)大豆品種5個(gè)籽粒發(fā)育時(shí)期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖3），有12個(gè)基因在籽粒表達(dá)，并且根據(jù)其表達(dá)情況可將其分為3 類(lèi)。第1 類(lèi)基因的表達(dá)量（以ST1時(shí)期為對(duì)照）隨籽粒發(fā)育在2個(gè)品種中均至少有1個(gè)時(shí)期呈現(xiàn)增加，如Glyma.08G025100、Glyma.13G041300和Glyma.14G120300，其中Glyma.13G041300在2個(gè)品種的ST2、ST3、ST4和ST5時(shí)期表達(dá)量均高于ST1時(shí)期，Glyma.08G025100和Glyma.14G120300的表達(dá)量在‘Z92116’的ST4和ST5時(shí)期以及‘QH30’的ST5時(shí)期高于ST1時(shí)期，說(shuō)明這類(lèi)基因的高表達(dá)對(duì)不同類(lèi)型品種籽粒發(fā)育具有重要意義。

圖3 籽粒不同發(fā)育時(shí)期SWEET基因表達(dá)分析Fig. 3 Expressions of SWEET genes in different soybean seed developmental stages

第2類(lèi)基因的表達(dá)只隨其中1個(gè)品種的籽粒發(fā)育出現(xiàn)上升，其中Glyma.04G198400在‘QH30’的ST3和ST4時(shí)期表達(dá)量高于ST1時(shí)期，Glyma.04G198600在‘Z92116’的ST5時(shí)期表達(dá)量高于ST1時(shí)期，說(shuō)明這類(lèi)基因的高表達(dá)只與特定品種籽粒發(fā)育有關(guān)。第3 類(lèi)基因的表達(dá)隨籽粒發(fā)育沒(méi)有明顯變化，如Glyma.04G198500、Glyma.06G122200、Glyma.08G183500和Glyma.15G049200等。

2.2.3接種SMV不同時(shí)間SWEET基因表達(dá)分析通過(guò)分析SWEET基因在不同抗感SMV 大豆品種葉片中的表達(dá)量，結(jié)果（圖4）發(fā)現(xiàn)，不同基因?qū)臃NSMV 的響應(yīng)存在較大差別，表明有些SWEET基因參與大豆對(duì)SMV 的抗性反應(yīng)，但也有些基因可能不參與大豆抵抗SMV 侵染過(guò)程；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，即使是響應(yīng)SMV 接種的SWEET基因，其響應(yīng)時(shí)間和響應(yīng)模式也存在較大差別，說(shuō)明不同SWEET基因在參與大豆抗SMV 反應(yīng)中發(fā)揮的功能可能不同。

圖4 大豆SWEET基因在葉片接種SMV不同時(shí)間的表達(dá)Fig. 4 Expressions of SWEET genes in soybean leaves at different time-points after SMV inoculation

根據(jù)SWEET基因?qū)Υ蠖谷~片接種SMV后的表達(dá)模式將其劃分為3 類(lèi)，其中，第1 類(lèi)屬于在抗病品種葉片高水平表達(dá)的SWEET基因，如Glyma.08G009900和Glyma.13G264400，Glyma.08G009900在抗病品種‘QH30’接種SMV后3、10、24、120、240 和336 h 的表達(dá)量均高于接種前，而感病品種中的表達(dá)量在SMV 接種前后沒(méi)有發(fā)生明顯改變，表明這類(lèi)基因的高表達(dá)可能與大豆抗花葉病毒病相關(guān)。第2 類(lèi)基因在抗感品種‘Z92116’葉片均較高水平表達(dá)，如Glyma.04G198600和Glyma.12G234500，其中Glyma.04G198600在‘QH30’接種SMV 后的120和336 h表達(dá)量高于接種前，而在‘Z92116’接種SMV 后的3、120和336 h表達(dá)量高于接種前，表明這些基因的高表達(dá)對(duì)于不同大豆品種抵御SMV 侵染具有一定作用。第3類(lèi)基因在大豆接種SMV 前后表達(dá)量沒(méi)有發(fā)生明顯改變，如Glyma.15G211800，說(shuō)明其可能不參與大豆抗花葉病毒。

2.2.4低磷脅迫不同時(shí)間根系SWEET基因表達(dá)分析 對(duì)SWEET基因在不同大豆品種低磷處理根系中的表達(dá)量進(jìn)行分析（圖5）發(fā)現(xiàn)，按照基因表達(dá)情況可將其分為3類(lèi)。與脅迫前相比，第1類(lèi)基因的表達(dá)量在耐低磷和不耐低磷品種根系均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，如Glyma.04G198400、Glyma.14G160100和Glyma.15G211800，其中Glyma.04G198400在耐低磷品種‘ZH15’低磷處理28 和49 d 時(shí)表達(dá)量較高，在不耐低磷品種‘NMH’低磷處理7 d時(shí)表達(dá)量較高；第2 類(lèi)基因的表達(dá)量?jī)H在其中1 個(gè)品種的根系中存在上升趨勢(shì)，如Glyma.04G238100和Glyma.12G 234500；第3 類(lèi)基因的表達(dá)量在低磷處理前后大豆根系中沒(méi)有發(fā)生明顯改變，表明其可能不參與大豆抵抗低磷逆境脅迫。

圖5 大豆SWEET基因在低磷脅迫處理不同時(shí)間根系的表達(dá)Fig. 5 Expressions of SWEET genes in soybean roots at different time-points after low phosphorus stress

2.3 栽培大豆SWEET基因SNP等位變異分析

利用Soybase網(wǎng)站公布的1 556份大豆品種資源重測(cè)序數(shù)據(jù)[21]，分析栽培大豆48個(gè)SWEET基因內(nèi)部的SNP，結(jié)果（表3）發(fā)現(xiàn)，43 個(gè)基因總共存在220 個(gè)非同義突變SNPs（除Glyma.06g122200、Glyma.08g010000、Glyma.08g025100、Glyma.17g090800和Glyma.18g301100外），其中以Glyma.06G200800中的非同義突變SNPs 數(shù)量最多（29 個(gè)），其次為Glyma.20G082700（18 個(gè)）；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，有103 個(gè)SNPs 位于33 個(gè)SWEET基因的保守結(jié)構(gòu)域（除Glyma.05G202700、Glyma.06G167000和Glyma.08G360400等10 個(gè)基因外），可能影響基因的生物學(xué)功能，這些SNPs 對(duì)揭示SWEET基因生物學(xué)功能具有重要意義。

表3 栽培大豆SWEET基因非同義突變SNP分析Table 3 Nonsynonymous SNP of cultivated soybean SWEET genes

3 討論

目前，關(guān)于SWEET基因在提高植物果實(shí)和籽粒產(chǎn)量以及抗病、抗逆等方面的研究已有報(bào)道[22-26]。大豆是世界重要糧油作物，既可采摘鮮莢食用又可收獲成熟籽粒，在各國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有不可替代的地位[27]。本研究利用大豆公共數(shù)據(jù)庫(kù)公布的最新版本栽培大豆與野生大豆基因組數(shù)據(jù)分析SWEET基因，同時(shí)結(jié)合栽培大豆轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析SWEET基因在豆莢和籽粒不同發(fā)育時(shí)期以及葉片花葉病毒侵染和根系低磷脅迫處理下的表達(dá)，明確SWEET基因在上述幾種情況下的表達(dá)模式，篩選可能參與大豆莢果與種子發(fā)育以及抗病抗逆候選基因，為進(jìn)一步發(fā)掘利用SWEET基因，提高菜用和粒用大豆產(chǎn)量以及抗病抗逆能力提供依據(jù)。

有關(guān)SWEET基因在大豆豆莢和種子發(fā)育中的功能目前報(bào)道較少。Hooker 等[28]研究SWEET基因在大豆葉片的表達(dá)以篩選在籽粒蛋白質(zhì)合成和積累過(guò)程中的候選基因。Wang 等[29]研究發(fā)現(xiàn)，GmSWEET15a和GmSWEET15b在大豆子葉期的胚乳中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，與胚乳向胚胎運(yùn)輸糖類(lèi)物質(zhì)有關(guān)，基因的雙突變引起胚胎發(fā)育遲緩及種子敗育。Patil 等[14]利用‘Williams82’最早版本基因組預(yù)測(cè)出52 個(gè)大豆SWEET基因（GmSWEET1~GmSWEET52），位于15 條染色體。本研究中，利用‘Williams82’最新版本基因組預(yù)測(cè)出48 個(gè)SWEET基因，也位于15 條染色體。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，本研究中有43 個(gè)SWEET基因可對(duì)應(yīng)到Patil 等[14]預(yù)測(cè)的GmSWEETs，有5 個(gè)SWEET基因?qū)儆谛骂A(yù)測(cè)的基因，分別 為Glyma.03G065500、Glyma.05G202600、Glyma.06G200800、Glyma.08G360500和Glyma.20G082700；而Patil 等[14]預(yù)測(cè)的GmSWEETs中有9 個(gè)在‘Williams82’最新版本基因組中沒(méi)有找到。Wang 等[29]曾利用37 個(gè)大豆SWEET基因與擬南芥和水稻SWEET基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，其中Glyma.08G360500也不能對(duì)應(yīng)到Patil 等[14]預(yù)測(cè)的GmSWEETs中，與本研究結(jié)果一致。Hooker等[28]在研究大豆SWEET基因時(shí)發(fā)現(xiàn)，Patil 等[14]預(yù)測(cè)的GmSWEET3、GmSWEET18和GmSWEET27在‘Williams82’第二版本基因組（Wm82.a2.v1）中找不到對(duì)應(yīng)的基因ID，本研究中這3 個(gè)基因在‘Williams82’最新版本基因組（Wm82.a4.v1）中也找不到對(duì)應(yīng)的ID，可見(jiàn)不同版本預(yù)測(cè)結(jié)果存在一定差別。分析原因，一方面可能是由于不同版本的‘Williams82’基因組測(cè)序和組裝技術(shù)不同；另一方面也可能與不同版本‘Williams82’基因組測(cè)序所用材料差別有關(guān)[15,30]。

關(guān)于大豆SWEET基因在不同組織器官的表達(dá)，Patil 等[14]利用‘Williams82’轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析其預(yù)測(cè)的52 個(gè)SWEET基因發(fā)現(xiàn)，有23 個(gè)基因在各組織器官的表達(dá)量非常低，而GmSWEET21和GmSWEET24在各組織器官的表達(dá)量較高，并且發(fā)現(xiàn)很多SWEET基因在花和種子形成及發(fā)育過(guò)程中呈現(xiàn)高表達(dá)，暗示其在大豆生殖生長(zhǎng)階段具有重要功能。在本研究中，對(duì)4 個(gè)大豆品種豆莢和籽粒發(fā)育的5 個(gè)時(shí)期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，與籽粒發(fā)育ST1時(shí)期（開(kāi)花后24 d）相比，Glyma.08G025100、Glyma.13G041300和Glyma.14G120300等基因的表達(dá)量隨籽粒發(fā)育進(jìn)程而增加；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，與豆莢發(fā)育PT1時(shí)期（開(kāi)花后5 d）相比，Glyma.06G122200和Glyma.14G159900等基因的表達(dá)量隨豆莢發(fā)育進(jìn)程而增加。進(jìn)一步比較本研究和Patil等[14]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二者存在一定程度的一致性，如有些SWEET基因在本研究的4 個(gè)品種以及Patil 等[14]研究的Williams82 豆莢和籽粒不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量都非常低，如Glyma.02G088400（GmSWEET1）、Glyma.05G036500（GmSWEET9）、Glyma.13G002700（GmSWEET32）、Glyma.19G009800（GmSWEET47）和Glyma.19G232200（GmSWEET49）等，說(shuō)明這些基因可能參與其他組織器官發(fā)育過(guò)程或參與某些特定條件下的糖類(lèi)運(yùn)輸；還有一些SWEET基因在豆莢或籽粒不同發(fā)育時(shí)期始終保持較高水平的表達(dá)量，如Glyma.08G183500（GmSWEET24）等。更重要的是，有些SWEET基因隨豆莢或籽粒發(fā)育進(jìn)程呈現(xiàn)增加，可作為進(jìn)一步研究的重要候選基因。另外，本研究比較在豆莢和籽粒中隨發(fā)育進(jìn)程而表達(dá)量增加的基因發(fā)現(xiàn)，二者不盡相同，說(shuō)明在大豆豆莢發(fā)育和籽粒發(fā)育過(guò)程中可能存在不同的糖類(lèi)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)鞍住?/p>

目前，SWEET基因是否參與大豆抗花葉病毒尚不明確。孫玥[31]利用花葉病毒JLCC 株系接種‘吉大豆1 號(hào)’14 d 后發(fā)現(xiàn)，葉片出現(xiàn)花葉，并伴隨葉緣下卷、頂部葉片皺縮以及植株矮化；經(jīng)檢測(cè)在接種14 d 后，有33 個(gè)SWEET基因上調(diào)表達(dá)，19個(gè)下調(diào)表達(dá)，說(shuō)明SWEET基因?qū)MV侵染的響應(yīng)不同。本研究利用黃淮海生態(tài)區(qū)SMV流行株系SC7接種抗病品種‘QH30’和感病品種‘Z92116’，分析SWEET基因在不同接種時(shí)間表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，不同基因?qū)臃NSC7的響應(yīng)存在差別。孫玥[31]研究發(fā)現(xiàn)，‘吉大豆1號(hào)’在接種JLCC株系14 d出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)的基因有GmSWEET6、GmSWEET9和GmSWEET20，下調(diào)表達(dá)的基因有GmSWEET4、GmSWEET12和GmSWEET17等。本研究分析SC7 株系接種336 h的SWEET基因表達(dá)發(fā)現(xiàn)，Glyma.04G198600（GmSWEET6）在抗病和感病品種中均上調(diào)表達(dá)，與孫玥[31]研究結(jié)果一致；重要的是，本研究發(fā)現(xiàn)該基因在抗病品種中的表達(dá)量明顯高于感病品種，表明其可能在大豆抵抗SMV 侵染過(guò)程中發(fā)揮重要功能。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)，Glyma.08G009900（GmSWEET20）在抗病品種‘QH30’接種SC7 株系3 h 出現(xiàn)第1 次表達(dá)高峰，說(shuō)明該基因能夠快速響應(yīng)SC7 病毒侵染，隨后在接種10、24、120 和240 h呈現(xiàn)下降，但在接種336 h 表達(dá)量再次出現(xiàn)高峰，而在感病品種‘Z92116’中的表達(dá)量在接種前后沒(méi)有明顯變化，說(shuō)明Glyma.08G009900可能在大豆抗SC7 侵染早期及中后期發(fā)揮重要作用。孫玥[31]研究表明，Glyma.08G009900基因在感JLCC株系的‘吉大豆1 號(hào)’接種336 h 的表達(dá)量也出現(xiàn)上調(diào)，表明其可能同時(shí)響應(yīng)JLCC株系。本研究發(fā)現(xiàn)了一些新的可能參與大豆抗病的基因，如Glyma.13G264400和Glyma.06G166800，為進(jìn)一步研究SWEET基因在大豆抗SMV 過(guò)程中的功能奠定了基礎(chǔ)。

有關(guān)大豆SWEET基因如何響應(yīng)外界低磷逆境目前尚無(wú)報(bào)道。陳阿[32]分析大豆SWEET基因在低磷處理?xiàng)l件下對(duì)菌根接種的響應(yīng)發(fā)現(xiàn)，在低磷脅迫條件下，GmSWEET6和GmSWEET15在叢枝菌根接種后誘導(dǎo)表達(dá)，表明其可能與大豆通過(guò)叢枝菌根途徑提高耐低磷能力有關(guān)，但在不接種叢枝菌根的情況下，上述2 個(gè)基因在低磷處理的大豆根系基本不表達(dá)。本研究通過(guò)分析SWEET基因在低磷處理大豆根系的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，G1yma.04G198600（GmSWEET6）和G1yma.06G166800（GmSWEET15）在耐低磷和不耐低磷品種根系的表達(dá)量都非常低，這與陳阿[32]研究中有關(guān)這2 個(gè)基因在不接種菌根情況下的結(jié)果一致，說(shuō)明這2個(gè)基因不能直接通過(guò)大豆根系響應(yīng)低磷脅迫，而是通過(guò)菌根的形式來(lái)響應(yīng)低磷脅迫。本研究獲得了在大豆根系中響應(yīng)外界低磷脅迫處理的SWEET基因，如Glyma.04G198400、Glyma.14G160100和Glyma.15G211800等，為研究該類(lèi)基因在大豆抵御外界環(huán)境低磷逆境中的作用奠定了基礎(chǔ)。