氫氣和氧氣共存下三氯乙烯高效降解菌Pseudomonas putida HO1的分離鑒定與降解特性

薛 晨,李 翠,劉明慧,余錦濤,歐陽葳葳,劉 慧

(中國地質(zhì)大學(xué)(武漢)環(huán)境學(xué)院,湖北 武漢 430078)

三氯乙烯 (trichloroethylene,TCE) 是一種優(yōu)良的有機(jī)溶劑,廣泛應(yīng)用在機(jī)械、電子、農(nóng)藥等工業(yè)領(lǐng)域中,可用作制冷劑、金屬清潔劑、脫脂劑、洗滌劑和殺蟲劑等[1]。隨著現(xiàn)代工業(yè)的迅速發(fā)展,TCE被大量使用和不恰當(dāng)排放,由于其具有致癌、致畸、致突變效應(yīng),從而威脅著人類健康[2-3]。TCE可通過多種途徑進(jìn)入土壤和地下水中,而且具有較強(qiáng)的遷移性,使其成為地下環(huán)境中主要的有機(jī)污染物之一[4-5]。目前國內(nèi)外對(duì)于有機(jī)污染場(chǎng)地的修復(fù)方法有很多,而利用微生物代謝降解有機(jī)污染物具有成本低廉、高效無害且無二次污染的特點(diǎn),成為氯代烴污染場(chǎng)地的主要修復(fù)方法之一[6]。

TCE可以通過厭氧還原脫氯[7]、直接好氧氧化[8]和好氧共代謝[9]等途徑被微生物降解。在厭氧還原脫氯的過程中,高氯代烴常作為電子受體,H2作為常用的電子供體,從放能脫鹵反應(yīng)中產(chǎn)生能量用于微生物生長(zhǎng)[7]。在厭氧條件下,已發(fā)現(xiàn)和分離鑒定的能夠還原脫氯TCE的微生物有很多。如Maymó-Gatell等[7]從環(huán)境中獲得了一株能將四氯乙烯(PCE) 完全脫氯為乙烯 (VC) 的細(xì)菌Dehalococcoidesethenogenes195,這些微生物已被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于土壤、地下水、河口沉積物等環(huán)境中。好氧氧化過程是在有氧條件下,O2作為電子受體,微生物利用TCE作為電子供體或碳源或依靠其他基質(zhì)生長(zhǎng)并代謝降解TCE[10]。O2是一種重要的電子受體,充足的O2供給可以促進(jìn)好氧微生物代謝,從而促進(jìn)污染物的好氧降解。如Dey等[8]和Mukherjee等[11]分別報(bào)道了以TCE作為唯一碳源的細(xì)菌Bacillussp.2479和Stenotrophomonasmaltophiliastrain PM102。許多微生物雖不能以TCE為直接碳源,但可在有氧條件下利用其他底物生長(zhǎng)而共代謝降解低氯代烴[12-14],如假單胞菌屬(Pseudomonas)、亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、分支桿菌屬(Mycobacterium)、黃色桿菌屬(Xanthobacter)等。由于各類菌屬是在不同環(huán)境中篩選出來的,其氯代烴降解性能也存在一定的差異。如:Chen[15]在含有甲苯為碳源的土壤中分離得到一株假單胞菌屬菌株P(guān)seudomonasputidaASA86,在甲苯雙加氧酶作用下降解TCE;Chen等[16]分離得到一株以苯酚為共代謝基質(zhì)的TCE高效好氧菌Pseudomonasputida。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),通過電化學(xué)體系向地下水環(huán)境中同時(shí)通入氫氣(H2)和氧氣(O2)顯著促進(jìn)了TCE的降解,并指示該環(huán)境中可能存在能利用H2和O2降解TCE的微生物[17]。為此,本文研究的目的是在H2/O2共存的TCE污染沉積物中分離純化能同時(shí)利用H2和O2且能降解TCE的特殊微生物,通過對(duì)該特殊微生物進(jìn)行分離與鑒定,研究其在H2/O2共存條件下對(duì)TCE的降解特性,考察其對(duì)TCE污染沉積物的強(qiáng)化修復(fù)的效果,為創(chuàng)建TCE污染地下環(huán)境修復(fù)新方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 沉積物樣品來源

本試驗(yàn)所用的沉積物來自天津某廢棄的化工廠,沉積物取樣深度約為5 m,此區(qū)域曾被高濃度的氯化溶劑污染。

1.2 H2/O2共存TCE污染沉積物體系中微生物的富集、分離與純化

圖1 微生物的富集培養(yǎng)裝置示意圖Fig.1 Microbial enrichment and cultivation device

1.3 菌株的形態(tài)觀察、碳源利用與物種鑒定

菌株的細(xì)胞形態(tài)采用掃描電子顯微鏡 (SEM,SU8010,日立公司,日本) 進(jìn)行觀察,并采用BIOLOG ECO-plateTM(1506,BIOLOG公司,美國)研究該菌株對(duì)31 種不同單一碳源(6個(gè)生化類)的利用情況[19]。

菌株的種類鑒定:使用DNA提取試劑盒(天根DP302離心柱型,TIANGEN公司,北京)依照廠家說明書步驟提取細(xì)菌DNA;采用細(xì)菌16S rRNA 通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和 1492R(5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行DNA擴(kuò)增,取菌種純化后的PCR產(chǎn)物,使用測(cè)序儀ABI3730-XL進(jìn)行DNA測(cè)序;使用NCBI Blast程序?qū)⑵唇雍蟮男蛄形募cNCBI 16S數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì),并利用MEGA 7.0軟件對(duì)序列進(jìn)行編輯,采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 H2/O2共存條件下TCE的降解動(dòng)力學(xué)和強(qiáng)化TCE污染沉積物的生物修復(fù)試驗(yàn)

將分離獲得的菌株用于不同H2、O2條件下TCE的降解動(dòng)力學(xué)試驗(yàn),試驗(yàn)裝置見本課題組發(fā)表的文獻(xiàn)[17]。試驗(yàn)采用220 mL玻璃瓶體系,混合培養(yǎng)基提前滅菌除氧后在厭氧手套箱 (COY,美國) 中加入玻璃瓶中,再加入5% 的菌懸液及TCE儲(chǔ)備液,在25 ℃、150 r/min下振蕩1 h后,測(cè)定樣品中TCE的初始濃度。未接種的螺口玻璃瓶作為對(duì)照,每組設(shè)兩個(gè)平行。提前在300 mL的聚四氟乙烯氣袋中分別裝入150 mL H2、150 mL O2、150 mL N2以及100 mL H2和50 mL O2的混合氣體,并將氣袋分別與玻璃瓶相連。試驗(yàn)裝置在25 ℃的旋轉(zhuǎn)激振器上以150 r/min的轉(zhuǎn)速搖動(dòng)。微生物強(qiáng)化TCE污染修復(fù)試驗(yàn)采用250 mL玻璃瓶體系,在螺口玻璃瓶中加入40 g場(chǎng)地沉積物、200 mL無菌水、5%的菌懸液及TCE儲(chǔ)備液,瓶外連接裝有100 mL H2和50 mL O2的300 mL聚四氟乙烯氣袋,培養(yǎng)條件同上。定期從玻璃瓶取樣口收集2 mL樣品,迅速取1 mL加入至42 mL的棕色瓶中(提前裝入40 mL的超純水),測(cè)定樣品中TCE及可能中間產(chǎn)物的濃度。

1.5 分析方法

樣品中TCE及可能中間產(chǎn)物的濃度依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)《水質(zhì)揮發(fā)性有機(jī)物的測(cè)定 吹掃捕集/氣相色譜-質(zhì)譜法》(HJ 639—2012)中方法,采用吹掃捕集-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(PT-GC-MS)(PT: Atomx,Teledyne Tekmar,美國;GC-MS:Thermo Fisher Scientific Inc.,美國)、Aligent DB-624毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×1.4 μm)進(jìn)行測(cè)定;樣品中溶解氫(DH)濃度采用DH儀(DH200,CLEAN,美國)進(jìn)行測(cè)定,采用非侵入式O2傳感器(FIBOX 3,Pre-Sens GmbH,德國)對(duì)瓶?jī)?nèi)溶解氧(DO)濃度進(jìn)行測(cè)量,氧氣傳感器貼片預(yù)先粘在玻璃瓶的內(nèi)壁上[17]。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株HO1的形態(tài)特征、碳源類型與鑒定結(jié)果

2.1.1 菌株HO1的形態(tài)特征

在持續(xù)通入H2、O2、CO2氣體的條件下,從氯代烴污染沉積物中分離得到一個(gè)菌株(編號(hào)為HO1),具有降解TCE的能力。該菌株在LB平板上的菌落表面光滑,不透明,有凸起,呈淺粉色,大部分菌落直徑在0.9～1.1 mm之間[圖2(a)]。掃描電鏡結(jié)果顯示,該菌株細(xì)胞呈桿狀,長(zhǎng)約1.5 μm,呈單細(xì)胞形態(tài),細(xì)胞表面光滑[圖2(b)和2(c)]。

圖2 菌株HO1菌落及細(xì)胞形態(tài)Fig.2 Colony and cell morphology of strain HO1

2.1.2 菌株HO1的碳源類型

菌株HO1能利用1506微孔板的以下化合物作為唯一碳源生長(zhǎng):D-木糖/戊醛糖、D-半乳糖醛酸、L-精氨酸、L-天門冬酰胺、L-絲氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸、γ-羥丁酸、2-羥基苯甲酸、4-羥基苯甲酸、吐溫 40、吐溫 80、D-蘋果酸、苯乙胺、丙酮酸甲酯和肝糖,見表1。

2.1.3 菌株HO1的鑒定

通過測(cè)序得到菌株HO1的16S rRNA基因序列,提交GenBank,并利用Blast進(jìn)行同源性序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)該菌株的16S rRNA基因序列與假單胞菌屬(Pseudomonas)成員高度同源,達(dá)到100%。與其關(guān)系最密切的菌株是土壤假單胞菌菌株P(guān)seudomonasputidastrain ATCC-17485(登錄號(hào)AF094739.1),故選取15 株假單胞菌屬菌株的16S rRNA部分基因序列通過MEGA7軟件以Neighbor-Joining計(jì)算方式構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,見圖3。

圖3 菌株HO1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain HO1

由圖3可知,菌株HO1與已報(bào)道的假單胞菌屬親源關(guān)系最近,與Blast同源性序列比對(duì)結(jié)果一致。因此,該菌株被鑒定為假單胞菌Pseudomonasputida,命名為PseudomonasputidaHO1。

2.2 菌株HO1在不同H2和O2條件下對(duì)TCE的降解動(dòng)力學(xué)過程

菌株HO1在不同H2和O2條件下對(duì)TCE的降解動(dòng)力學(xué)過程曲線,見圖4。

注:Ct為t時(shí)刻TCE的濃度;C0為TCE的初始濃度。圖4 菌株HO1在不同H2、O2條件下對(duì)TCE的降解 動(dòng)力學(xué)過程曲線Fig.4 Degradation kinetics curves of TCE by strain HO1 under different H2 and O2 conditions

由圖4(a)可知:菌株HO1在純N2條件下不能去除TCE,加入H2對(duì)TCE去除的影響不大,沒有產(chǎn)物的生成,而在加入O2條件下TCE濃度從反應(yīng)的第1天就開始快速下降,在反應(yīng)的前15 d內(nèi)降解率為66.6%,之后TCE的降解變緩并趨于停止;在H2/O2(體積比為2∶1)共存條件下,TCE濃度在反應(yīng)的前5 d下降較慢,表現(xiàn)出明顯的滯后期,說明該菌株最初不適應(yīng)這種H2/O2共存的條件,而經(jīng)過5 d的培養(yǎng)后TCE濃度開始較快地下降,30 d內(nèi)去除了51.7%(13.9 μM) 的TCE。針對(duì)上述兩種TCE發(fā)生降解的體系,在培養(yǎng)液中沒有檢測(cè)到順式二氯乙烯(cDCE) 或三氯乙醛等中間產(chǎn)物,推斷是直接好氧代謝。

為了定量對(duì)比菌株HO1對(duì)TCE的降解速率,通過對(duì)TCE的降解曲線進(jìn)行擬合,發(fā)現(xiàn)所試體系中TCE的降解過程符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型(相關(guān)系數(shù)R2>0.95),模擬結(jié)果與一級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)k值見圖4(b)所示。

由圖4(b)可知,在純O2和H2/O2共存的條件下,TCE降解的k值分別為(0.063 9±0.005 6) d-1和(0.047 5±0.004 9) d-1。

一般來說,假單胞菌屬的菌株更容易通過好氧降解進(jìn)行TCE轉(zhuǎn)化[20-23]。本課題組前期的研究結(jié)果表明,在H2/O2共存條件下沉積物中形成了特定的微生物群落,其中假單胞菌屬的一些物種是H2/O2共存條件下特有的[17]。試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn),不同試驗(yàn)組的氣體消耗情況存在明顯的區(qū)別。在H2/O2共存體系中,菌株HO1對(duì)氣體的利用率很高,每5 d氣袋中100 mL H2和50 mL O2完全消耗,所以每隔5 d在原氣袋中補(bǔ)充100 mL H2和50 mL O2[如圖4(a)中紫色圓圈所示]。該現(xiàn)象表明菌株HO1能同時(shí)利用H2和O2。為了進(jìn)一步弄清反應(yīng)體系中H2和O2的濃度狀況和菌株HO1對(duì)H2和O2的利用情況,本試驗(yàn)過程中監(jiān)測(cè)了反應(yīng)液中DH和DO濃度的變化情況,其監(jiān)測(cè)結(jié)果見圖5。

圖5 菌株HO1在不同H2和O2條件下反應(yīng)液中DH、 DO變化情況Fig.5 Changes of DH and DO in the reaction solution under different H2 and O2 conditions

由圖5可知:單獨(dú)供H2和O2的體系中一直維持較高濃度的DH和DO;而在H2/O2共存體系中DO濃度低于純O2體系,DH濃度始終在極低的水平,進(jìn)一步說明該菌能同時(shí)利用H2和O2。

氫氧化細(xì)菌(hydrogen-oxidizing bacteria) 是一類能夠利用H2作為電子供體、以O(shè)2作為電子受體并同化CO2的無機(jī)化能自養(yǎng)細(xì)菌[24]。李忠玲等[25]報(bào)道了一株具有促生作用的氫氧化細(xì)菌為熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens),該菌株能同時(shí)利用H2和O2作為能量供細(xì)胞生長(zhǎng)。本研究分離得到的PseudomonasputidaHO1與Pseudomonasfluorescens一樣,其能夠同時(shí)利用H2和O2,在H2/O2/CO2共存的條件下生長(zhǎng),本研究首次報(bào)道了假單胞菌種Pseudomonasputida能夠在利用H2和O2的同時(shí)降解TCE。

2.3 菌株HO1對(duì)TCE污染沉積物的強(qiáng)化修復(fù)效果

為了探究菌株HO1對(duì)TCE污染的強(qiáng)化修復(fù)能力,本研究將該菌株加入到采自污染場(chǎng)地的實(shí)際沉積物中,對(duì)比了未加菌TCE污染沉積物體系,檢測(cè)TCE的降解效果,其結(jié)果見圖6。

由圖6可知:在H2/O2共存體系中,原始沉積物中的土著菌群能夠代謝TCE,即在3次添加TCE(TCE的初始濃度為30 μmol/L)溶液時(shí),土著微生物需要6～19 d能夠?qū)⒓尤氲腡CE降解完全,期間生成14.98 μmol/L厭氧降解產(chǎn)物cDCE;當(dāng)加入菌株HO1時(shí),TCE的降解時(shí)間縮短至2～4 d,尤其是在第3次添加TCE后其降解速率更快,生成的cDCE在第13 d達(dá)到了最大濃度20.37 μmol/L,隨后cDCE濃度則快速下降至0 μmol/L;在滅菌沉積物組中,TCE的濃度有所減少但是始終沒有cDCE的產(chǎn)生,說明上述兩處體系中TCE的降解是微生物作用導(dǎo)致。

此外,圖6結(jié)果表明,H2/O2共存體系中加入和未加入菌株HO1的沉積物中TCE降解的第一步是將TCE還原脫氯成cDCE,但體系中未檢測(cè)到進(jìn)一步還原脫氯的中間產(chǎn)物。因此,推斷cDCE可能通過好氧途徑降解。

圖7為不同體系試驗(yàn)后的CO2檢測(cè)結(jié)果。

圖7 不同試驗(yàn)體系中CO2的GC-MS譜圖Fig.7 GC-MS spectra of CO2 in different experimental systems

由圖7可知:在滅菌沉積物組中幾乎沒有CO2的生成;而在加菌和未加菌的沉積物組中檢測(cè)到了CO2的生成,其峰面積分別為1 984 174 136和1 522 660 655。由此判斷,試驗(yàn)體系中的CO2主要來自沉積物中有機(jī)物(包括TCE)的好氧降解,而相對(duì)于未加菌試驗(yàn)體系,加了菌株HO1的試驗(yàn)體系中增加的CO2產(chǎn)生量暗示著TCE發(fā)生了好氧降解。基于以上分析可以推斷,菌株HO1降解TCE的途徑為:先將TCE厭氧脫氯至cDCE,然后再好氧降解為CO2。

2.4 菌株HO1的科學(xué)價(jià)值與應(yīng)用前景

本研究獲得的菌株P(guān)seudomonasputidaHO1為首次報(bào)道的一株能利用H2和O2生長(zhǎng)同時(shí)降解TCE的細(xì)菌,能夠在純O2環(huán)境中或H2/O2共存環(huán)境中將TCE最終降解為CO2,并且能夠利用H2作為電子供體,以O(shè)2為電子受體,CO2作為無機(jī)碳源合成自身有機(jī)物質(zhì),為細(xì)胞生長(zhǎng)提供能量。這表明該菌能夠在寡有機(jī)物的地下環(huán)境中利用H2和O2,同時(shí)參與環(huán)境中的TCE降解,對(duì)TCE污染地下環(huán)境的生物修復(fù)起著重要作用。通過電化學(xué)體系向地下環(huán)境中同時(shí)通入H2和O2能顯著促進(jìn)TCE的降解[17],加入特征微生物能有效強(qiáng)化TCE污染沉積物的修復(fù)效果。菌株HO1以H2為電子供體、O2為電子受體并降解TCE的方式為去除寡有機(jī)質(zhì)環(huán)境中的氯代污染物提供了一種有效的途徑。因此,該菌株不但對(duì)于認(rèn)識(shí)氫氧共存環(huán)境中氯代有機(jī)污染物的降解機(jī)制具有重要的科學(xué)價(jià)值,而且有望為強(qiáng)化寡有機(jī)物的地下環(huán)境中TCE污染的生物修復(fù)提供新思路。

3 結(jié) 論

1) 從受氯代烴污染的沉積物中富集、分離得到一株能利用H2和O2降解TCE的菌株P(guān)seudomonasputidaHO1。

2) 該菌株在純O2和H2/O2共存條件下對(duì)TCE的降解過程符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型,其TCE降解的一級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)k分別為(0.063 9±0.005 6) d-1和(0.047 5±0.004 9) d-1。

3) 將菌株HO1添加至污染場(chǎng)地沉積物中,在H2/O2共存條件下顯著促進(jìn)了TCE的降解速率,利用該菌株,通過通入H2/O2有望強(qiáng)化TCE污染地下環(huán)境的生物修復(fù)。

4) H2/O2共存條件下菌株HO1對(duì)TCE的降解途徑為:先將TCE脫氯為cDCE,然后再好氧降解為CO2。