基于GC-MS 及化學(xué)計(jì)量學(xué)分析蘘荷鮮、干品不同部位揮發(fā)油成分

楊明宇，李蒙禹，黃 哲，楊本蓉，孫慶文，楊 燁

（貴州中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025）

蘘荷Zingiber mioga(Thunb.) Rosc.源于姜科姜屬植物，別名苴蒪、嘉草、蓮花姜，是一種藥食兼用的植物資源，其根、莖、花、葉均可供藥用，味辛、性溫，具有解毒消腫、活血調(diào)經(jīng)、祛痰止咳等功效，主治跌打損傷、月經(jīng)不調(diào)、咳嗽、氣喘等癥[1]。蘘荷中除含有黃酮、多糖類化學(xué)成分還含有多種氨基酸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其具有抗氧化、抗腫瘤、預(yù)防心血管疾病等多種藥理活性[2-6]。目前，蘘荷國(guó)內(nèi)外研究包含提取工藝優(yōu)化、抗菌、抗氧化等，且大部分涉及其揮發(fā)油成分的藥效價(jià)值研究，表明揮發(fā)性成分是蘘荷發(fā)揮藥效作用的主要成分之一[7-14]。然而蘘荷的揮發(fā)性成分在鮮、干品中和不同部位中的含量差異尚未明確，不利于蘘荷揮發(fā)性成分的開發(fā)利用，故進(jìn)一步對(duì)蘘荷鮮、干品不同部位中的揮發(fā)性成分進(jìn)行差異分析十分必要。

化學(xué)計(jì)量學(xué)可以優(yōu)化化學(xué)量測(cè)過程，并從化學(xué)量測(cè)數(shù)據(jù)中最大限度地提取有用的化學(xué)信息，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析方法廣泛應(yīng)用于化學(xué)分析、生物鑒定、物證考察等方面，基于其多元統(tǒng)計(jì)算法（主成分分析、聚類分析、判別分析等），能描述多因素、多變量之間復(fù)雜的相互關(guān)系，普遍應(yīng)用于中藥的化學(xué)分析中[15-16]。

本研究基于氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用分析法，鑒定鮮、干品蘘荷的地上莖葉和地下塊莖中的揮發(fā)油成分，并利用化學(xué)計(jì)量方法來統(tǒng)計(jì)其鮮、干品不同部位所含揮發(fā)性成分的種類、數(shù)量及含量差異，探討其鮮、干品不同部位所含共有成分和特有成分的藥效價(jià)值，以期為蘘荷揮發(fā)性成分的開發(fā)利用及其質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料

1.1 試藥

實(shí)驗(yàn)樣品采集于貴州省苗族侗族自治州劍河縣觀么鄉(xiāng)，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院孫慶文教授鑒定為姜科姜屬植物蘘荷Zingiber mioga（Thunb.）Rosc.全草。

1.2 儀器與試劑

HP6890A/5975C 型 GC-MS 聯(lián)用儀（美國(guó)安捷倫科技公司）；GZX-GF101-2-S-II 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海賀德實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；98-I-B 型電子調(diào)溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）；HPD-YAZD-5 型純水蒸餾器（常州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司）。

無水硫酸鈉（批號(hào)：20100308，重慶茂業(yè)化學(xué)試劑有限公司）；正己烷（批號(hào)：20180108，天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水為重蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 干品蘘荷制備

取凈制后的蘘荷樣品，于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中35 ℃烘干，粉碎后備用。

2.2 揮發(fā)油提取

根據(jù)2020 年版《中國(guó)藥典》（四部）通則2204“揮發(fā)油測(cè)定法-甲法”提取樣品揮發(fā)油[16]，精確稱取蘘荷鮮品莖葉、鮮品塊莖、干品莖葉、干品塊莖樣品各100 g，置于揮發(fā)油提取器中，加水適量，浸泡過夜，加入3.00 mL 正己烷，冷凝回流提取12 h 后，靜置1 h，得到有特殊氣味黃色的油狀體3.00 mL（含正己烷），加適量無水硫酸鈉干燥后作為供試品備用。

2.3 GC-MS 檢測(cè)

2.3.1 GC-MS 色譜條件 氣相色譜：色譜柱為HP-5MS（60 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細(xì)管柱，初始溫度52 ℃（保留2 min），以6 ℃/min 升溫至310 ℃（保留7 min），運(yùn)行時(shí)間為52 min；氣化室溫度為250 ℃；載氣為高純He（99.999%）；柱前壓為16.94 psi；載氣流量為1.0 mL/min；分流比為10 : 1；溶劑延遲時(shí)間為6.0 min。質(zhì)譜：離子源為EI 源；離子源溫度為230 ℃；四極桿溫度為150 ℃；電子能量為70 eV；發(fā)射電流為34.6 μA；倍增器電壓為1 671 V；接口溫度為280 ℃；質(zhì)量范圍為29 ～ 500 amu；進(jìn)樣體積為2 μL。

2.3.2 數(shù)據(jù)處理 經(jīng)分析比較，確定篩選后的GC-MS 色譜條件對(duì)色譜峰能達(dá)到較好的分離。所得色譜和質(zhì)譜信息經(jīng)質(zhì)譜計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)（NIST2017、Wiley275）檢索及核對(duì)得到標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖，采用峰面積歸一法測(cè)定各化學(xué)成分在揮發(fā)油中的相對(duì)含量。

2.4 蘘荷揮發(fā)油成分分析

2.4.1 鮮、干品不同部位揮發(fā)油成分分析 所得的色譜和質(zhì)譜信息經(jīng)質(zhì)譜計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及核對(duì)Nist 2017 和Wiley 275 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖，并用峰面積歸一法測(cè)定各化學(xué)成分在揮發(fā)油中的相對(duì)百分含量，得到總離子流圖（圖1）、成分及相對(duì)含量（表1、表2），通過圖1 對(duì)比蘘荷莖葉與塊莖可知，蘘荷干品中的揮發(fā)油成分明顯多于鮮品。由表1、表2 可知，從鮮、干品蘘荷中檢測(cè)出144 個(gè)化合物，包含了烴類、醇類、醛類、酮類、酯類、酚類及其他，其中，鮮品蘘荷有58 個(gè)，莖葉含32 個(gè)，塊莖含42 個(gè)，兩者的相對(duì)含量分別占總相對(duì)含量92.704%和91.279%，二者共有化合物有16 個(gè)；干品蘘荷中有86 個(gè)，莖葉含54個(gè)，塊莖含61 個(gè)，兩者的相對(duì)含量分別占總相對(duì)含量91.526%、96.892%，其共有化合物有29 個(gè)，在檢測(cè)中有部分化合物未被確證，其相對(duì)含量詳見表3。

圖1 鮮、干品蘘荷不同部位揮發(fā)油總離子流圖Fig.1 Total ion flow diagram of volatile oil from different parts of fresh and dried Zingiber mioga

表2 蘘荷干品揮發(fā)性成分GC-MS 分析Tab.2 GC-MS analysis of volatile components of dried Zingiber mioga

表3 蘘荷鮮、干品不同部位揮發(fā)油成分的相對(duì)百分含量及數(shù)量Tab.3 Relative percentages and amounts of volatile oil components in different parts of fresh and dried Zingiber mioga

2.4.2 共有成分分析 蘘荷鮮品莖葉、鮮品塊莖、干品莖葉與干品塊莖四個(gè)不同部位之間的共有成分有7 個(gè)，分別為α-蒎烯、檜烯、β-蒎烯、α-水芹烯、4-異丙基甲苯、4-萜烯醇、異丙基環(huán)己烯酮，其在不同部位中的相對(duì)含量總和存在顯著差異，分別為13.119%、61.246%、2.817%、55.875%，以7 個(gè)共有成分在不同部位中的相對(duì)含量為指標(biāo)，運(yùn)用SPSS 26.0 軟件驗(yàn)證數(shù)據(jù)，其中，鮮品莖葉P= 0.032，鮮品塊莖P= 0.663，干品莖葉P= 0.343，干品塊莖P= 0.358，數(shù)據(jù)滿足正態(tài)性（P＞0.01）后進(jìn)行單樣本T 檢驗(yàn)，結(jié)果顯示P＜0.01，表明鮮、干品不同部位之間的揮發(fā)性成分相對(duì)含量確有顯著差異。利用Origin 2021 軟件作7 個(gè)共有成分的百分含量堆積圖（圖2），圖中顯示7 個(gè)共有成分均在蘘荷塊莖中含量最高，其中檜烯、α-水芹烯的相對(duì)含量在干品塊莖中最高，其余5 個(gè)共有成分在鮮品塊莖中相對(duì)含量較高。

圖2 蘘荷鮮、干品不同部位揮發(fā)油共有成分堆積圖Fig.2 Pileup of volatile oil components in different parts of fresh and dried Zingiber mioga

分析莖葉及塊莖中共有成分的含量差異發(fā)現(xiàn)，鮮品莖葉與干品莖葉共有成分15 個(gè)，其中，二十二烷、六氫法尼基丙酮、β-蒎烯、隱海松二烯4 個(gè)成分經(jīng)干燥后相對(duì)含量增多，其余共有成分干燥后相對(duì)含量均明顯減少；鮮品塊莖與干品塊莖共有成分28 個(gè)，其中的12 個(gè)共有成分經(jīng)干燥后相對(duì)含量增加，尤以3-異丙基-6-亞甲基-1-環(huán)己烯、檜烯2 個(gè)成分含量增加最為顯著，其余共有成分的含量經(jīng)干燥后均減少，見圖3。

圖3 蘘荷鮮、干品莖葉及塊莖揮發(fā)油中共有化合物含量比較Fig.3 Comparison of the content of co-occurring compounds in the volatile oil of fresh and dried stems and leaves and tubers of Zingiber mioga

2.4.3 特有成分分析 除蘘荷鮮、干品不同部位揮發(fā)油中的共有成分外，鮮品莖葉中含有特有成分6種，占其揮發(fā)油成分總量的9.519%，其中，醛類2 種（1.224%），酯類3 種（6.685%），醇類1 種（1.610%），主要特有成分為亞油酸甲酯（4.615%），α-反式-倍半環(huán)己醇（1.610%），亞麻酸甲酯（1.485%）；鮮品塊莖中含有特有成分3 種，僅占其揮發(fā)油成分總量的0.196%，其中，醇類2 種（0.158%），酮類1 種（0.038%），主要特有成分為香葉基-芳樟醇（1.127%）；干品莖葉中含有特有成分12 種，占其揮發(fā)油成分總量的6.599%，其中，烴類4 種（2.714%），醇類3 種（2.506%），酮類3 種（0.907%），醛類苯乙醛（0.086%），酚類香芹酚（0.151%），酯類乙酸桃金娘烯酯（0.235%），主要特有成分為棕櫚醇（1.338%）、β-欖香烯（1.189%）、α-甜沒藥烯（1.078%）；干品塊莖含有特有成分10 種，占其揮發(fā)油成分總量的2.678%，特有烴類2 種（0.406%），醇類6 種（1.615%），醛類2 種（0.113%），以及其他1 種（0.544%），其中鮮品塊莖所含特有成分的數(shù)量及含量均較低，其所含特有成分含量小于1%。

2.5 化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

2.5.1 聚類分析(CA) 基于GC-MS 獲得的鮮、干品蘘荷不同部位的揮發(fā)性成分含量數(shù)據(jù)，將其導(dǎo)入微生信平臺(tái)（http://www.bioinformatics.com.cn），采用歐氏距離法制作聚類熱圖（顏色由藍(lán)到紅代表含量由低到高）見圖4，聚類分析結(jié)果將鮮品莖葉、干品莖葉、鮮品塊莖、干品塊莖分為兩類，其中，鮮品塊莖及干品塊莖先聚為Ⅰ類，后與鮮品莖葉聚為Ⅰ類，該類別中含量高的色塊較為接近且其所含高含量成分大部分相同，如：α-蒎烯、檜烯、β-蒎烯、4-異丙基甲苯、3-異丙基-6-亞甲基-1-環(huán)己烯、γ-松油烯、4-萜烯醇等；干品莖葉單獨(dú)為Ⅱ類，該類成分中總體含量較高的為烷烴類，如：二十三烷、正二十四烷、二十五烷、二十六烷、二十七烷、二十八烷、二十九烷、三十烷、三十一烷、三十二烷、正三十三烷等，故聚類結(jié)果表明鮮、干品蘘荷不同部位的揮發(fā)性成分在GC-MS 指紋圖譜上存在差異。

2.5.2 主成分分析(PCA) 利用多元統(tǒng)計(jì)軟件SIMCA 14.1 對(duì)鮮、干品蘘荷不同部位的揮發(fā)油含量進(jìn)行PCA 計(jì)算，篩選出蘘荷不同部位之間方差貢獻(xiàn)最大的兩個(gè)主成分為PC1（累積方差貢獻(xiàn)率為49.49%）、PC2（累積方差貢獻(xiàn)率為29.80%），兩主成分方差貢獻(xiàn)率之和為79.29%，表明兩主成分能很好的解釋蘘荷藥材所含的揮發(fā)油成分特征，做PCA評(píng)分圖及不同部位中PC1、PC2 分值圖（見圖5），圖中結(jié)果顯示鮮品塊莖及干品塊莖先聚為Ⅰ類，以貢獻(xiàn)率較大的PC1 分值區(qū)分，鮮品莖葉與鮮品塊莖及干品塊莖得分更近，三者聚為Ⅰ類，而干品莖葉在PC1 的得分中與其余三者差異較大，故單獨(dú)聚為Ⅱ類，該結(jié)果與聚類熱圖分析結(jié)果一致。

圖5 PCA 評(píng)分圖及不同部位中PC1、PC2 分值圖Fig.5 PCA score diagram and PC1, PC2 score diagram in different parts

2.5.3 偏最小二乘判別分析 (PLS-DA) 在SIMCA 14.1 軟件中計(jì)算蘘荷揮發(fā)油成分在鮮品莖葉、鮮品塊莖、干品莖葉、干品塊莖所含成分含量的變量重要性投影值（VIP 值）（見圖6），VIP 值的大小表示該成分對(duì)不同部位的貢獻(xiàn)程度，一般而言，VIP＞1，說明其對(duì)模型有顯著貢獻(xiàn)[17]，鮮品莖葉中VIP＞1 的成分有17 個(gè)，其中已知成分有12 個(gè)（見圖6A）；干品莖葉中VIP＞1 的成分有38 個(gè)，其中已知成分有37 個(gè)（見圖6B）；鮮品塊莖中VIP＞1 的成分有14 個(gè)，已知成分14 個(gè)（見圖6C）；干品塊莖中VIP＞1 的成分有22 個(gè)，已知成分21 個(gè)（見圖6D）。

圖6 不同部位偏最小二乘判別分析的VIP 值Fig.6 VIP values of partial least squares discriminant analysis in different parts

從鮮、干品蘘荷揮發(fā)油成分的VIP 值來看，干品所含的揮發(fā)油成分貢獻(xiàn)值較高；從蘘荷不同部位揮發(fā)油成分的VIP 值來看，其莖葉所含成分的貢獻(xiàn)度值大于塊莖，總體VIP 值排序?yàn)楦善非o葉＞干品塊莖＞鮮品莖葉＞鮮品塊莖。

3 討論

《中華本草》及《中藥大辭典》[1,18]上記載蘘荷鮮用可治舌口瘡爛、雜物瞇目不出，干用主治失聲喉痹，表明蘘荷鮮、干品具有一定的藥效差異，同時(shí)蘘荷不同部位之間的藥效作用也存在較大差異，如蘘荷葉具有溫瘧寒熱功效；蘘荷花主治肺寒咳嗽；蘘荷根莖主治療跌打損傷等[19-22]，而本研究結(jié)果顯示蘘荷鮮、干品不同部位提取揮發(fā)油成分的含量確有顯著差異，揮發(fā)油成分又是蘘荷的主要藥效成分之一，故這可能是蘘荷鮮、干用及其不同部位之間存在藥效差異的原因。

此外，在不同部位揮發(fā)油共有成分分析中發(fā)現(xiàn)，4-萜烯醇、β-蒎烯具有較強(qiáng)的生物活性及藥效價(jià)值[23-24]；對(duì)各部位特有成分進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，鮮品莖葉中含有的特有成分亞油酸甲酯（4.615%）具有一定的抗炎作用及殺螨活性[25-26]；鮮品塊莖中特有成分香葉基-芳樟醇（1.127%）常被林業(yè)用做防治害蟲[27]；干品莖葉中特有成分棕櫚醇（1.338%）能作為熱能儲(chǔ)存的相變材料[28]，β-欖香烯（1.189%）則具有多種抗癌作用[29]，表明蘘荷不同部位均有一定的藥效價(jià)值，其中，干品莖葉中所含特有成分?jǐn)?shù)量排在首位（12 個(gè)），且大部分成分都具有較高的藥效活性[30]。

聚類熱圖按照蘘荷各部位揮發(fā)油成分含量之間的相似性進(jìn)行分組歸類，顯示干品莖葉的色塊較深，與其他三者相似性較差，單獨(dú)聚為一類；主成分分析時(shí)干品莖葉的方差得分區(qū)別與其他三者，單獨(dú)聚為一類；二者分析結(jié)果一致，但CA 和PCA 只是將多變量的蘘荷揮發(fā)油含量數(shù)據(jù)進(jìn)行相似度分類、降維處理來解釋多變量之間的關(guān)系。為進(jìn)一步探索蘘荷鮮、干品不同部位之間的含量差異，本文應(yīng)用偏最小二乘判別分析，利用各部位的成分含量的VIP 值進(jìn)行篩選及排名，排名結(jié)果顯示干品莖葉中所含VIP ＞1，貢獻(xiàn)度高的成分較多，區(qū)別于其余三者，這與CA 及PCA 分析結(jié)果一致，三種方法所得結(jié)果互相印證。但所得判別分析結(jié)果與GC-MS 計(jì)算相對(duì)含量大小結(jié)果不一致，原因可能是GC-MS 鑒定所得的含量?jī)H代表了不同部位中成分含量的高低，與其在蘘荷揮發(fā)油中的貢獻(xiàn)度大小沒有直接關(guān)聯(lián)，而判別分析的VIP值則能明確反映該成分含量對(duì)該部位的貢獻(xiàn)值。結(jié)合三種化學(xué)計(jì)量學(xué)方法及特有成分分析結(jié)果，初步表明本研究中蘘荷干品莖葉的藥效價(jià)值可能更高。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果可為蘘荷揮發(fā)油成分的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供參考，并為后期深入開發(fā)利用蘘荷揮發(fā)性資源提供理論依據(jù)。同時(shí)因GC-MS 圖譜中還存在部分尚未明確的成分，部分未明確成分的含量在鮮、干品不同部位的揮發(fā)油成分中占比較高，在PLS-DA 分析中的VIP 值也不低，故后續(xù)可結(jié)合更多高分辨分析方法進(jìn)行鑒定。此外，本研究對(duì)蘘荷的干燥方式僅為低溫干燥，后續(xù)可考慮結(jié)合更多蘘荷干燥方式對(duì)其干品所含揮發(fā)油成分的變化進(jìn)行考察。