經典名方一貫煎紅外指紋圖譜研究

賈 豪,張維方,雷敬衛(wèi)*,李瑩瑩,楊春靜,謝彩俠,龔海燕,丁心雨,姚天意

1. 河南中醫(yī)藥大學藥學院,河南 鄭州 450046 2. 河南中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院,河南 鄭州 430003 3. 河南省中藥質量控制與評價工程技術中心,河南 鄭州 450046 4. 漯河醫(yī)學高等?？茖W校,河南 漯河 462002

引 言

經典名方一貫煎是臨床上首選的滋陰疏肝方劑,被國家中醫(yī)藥管理局收錄于《古代經典名方目錄(第一批)》,有醫(yī)家稱其為“涵養(yǎng)肝陰無上良方”[1]。一貫煎出自清代《續(xù)名醫(yī)類案》,為名醫(yī)魏之琇所創(chuàng),由生地黃、北沙參、麥冬、當歸、枸杞子、川楝子6味藥組成,具有滋養(yǎng)肝腎、疏肝理氣之效,臨床上廣泛應用于慢性肝病、胃病、干燥綜合征、糖尿病、干眼癥、耳鳴等證屬肝腎陰虛,肝郁氣滯者[2]。

一貫煎水煎液臨床療效顯著,但關于其水煎液的質量分析研究少有報道。紅外光譜技術具有靈敏度高、特征性強、檢測快速、無損等特點[3],既能反映藥材內部所有復雜成分峰的疊加,又能反映藥材所含不同成分及其比例,故可全面體現(xiàn)藥材的質量[4]。隨著紅外光譜技術的發(fā)展,其分辨率及圖譜識別能力均有了新的突破,已成為中藥快速鑒別及質量評價的一種有效手段[5]。化學模式識別分析可以數(shù)字化地表達光譜信息[6],從而可以更加客觀地反映中藥的質量信息,達到全面控制中藥質量的目的[7],兩者結合能更加客觀地評價中藥的質量。

本研究參照發(fā)布的經典名方開發(fā)技術指導原則,收集不同產地藥材飲片,制備15批一貫煎基準樣品凍干粉,建立該基準樣品和藥材飲片的紅外指紋圖譜并對其進行化學模式識別方法分析,為一貫煎基準樣品凍干粉的質量標準的建立與完善提供實驗依據(jù),為一貫煎制劑的研發(fā)與工業(yè)生產提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

傅里葉變換紅外分光光度計為Spectrum100型(美國Pekin Elmer公司);紅外分析軟件為Spectrum for window3.02軟件;粉末壓片機為FW-4A型(天津市拓普儀器有限公司);FW-100型高速萬能粉碎機(北京科偉永興儀器有限公司);101-3AB型點熱恒溫鼓風干燥箱(北京中興偉業(yè)儀器有限公司);ME204E/OL型萬分之一天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司);溴化鉀(光譜純,天津市科密歐化學試劑有限公司);無水乙醇(分析純,天津市致遠化學試劑有限公司);瑪瑙研缽。

1.2 藥材飲片

一貫煎中6味藥材飲片均源自道地產地或主產區(qū)產地,均經河南中醫(yī)藥大學陳隨清教授鑒定,詳見表1。均符合2020年版《中華人民共和國藥典》(一部)相關項下規(guī)定。

表1 一貫煎飲片來源Table 1 Sources of tablets

2 結果與討論

2.1 傳統(tǒng)湯劑基準樣品制備

采用隨機數(shù)表法對一貫煎飲片進行隨機配組,結果見表2,按照經典名方目錄折算劑量,生地黃11.19 g、當歸5.6 g、北沙參5.6 g、枸杞11.19 g、麥冬5.6 g、川楝子7.46 g,在黑砂鍋中煎煮。一煎加8倍量水,浸泡30 min,電陶爐武火(1 400 W)煎煮5 min,轉文火(300 W)煎煮30 min;二煎加水量為一煎的三分之二,武火(1 400 W)煎煮5 min,轉文火(300 W)煎煮25 min。合并兩次煎煮液,調整體積至200 mL,湯劑含藥量0.233 2 g·mL-1即得一貫煎水煎液;精密移取10 mL上述水煎液于西林瓶中,將其-20 ℃冷凍48 h,置于真空冷凍干燥機中,凍干溫度-60 ℃,真空度10(±5)Pa,干燥72 h,即得一貫煎基準樣品凍干粉。

表2 15批基準樣品組方樣品信息Table 2 Sample information for the 15 batches of baseline sample formulations

2.2 飲片粉末、單煎液凍干粉以及陰性凍干粉樣品制備

單味飲片粉碎后過九號篩,備用。按照2.1項下基準樣品制備方法,分別制備單生地黃、單當歸、單枸杞、單麥冬、單北沙參、單川楝子的凍干粉和缺生地黃、缺當歸、缺枸杞、缺麥冬、缺北沙參、缺川楝子的陰性凍干粉。

2.3 紅外光譜采集

取樣品2 mg與120 mg KBr置于瑪瑙研缽研磨均勻,取適量混合均勻的樣品置于專用壓片模具中,用8 MPa的壓力壓制30 s,壓成均勻半透明的薄片,取出,置紅外光譜儀中采集各樣品紅外光譜圖。光譜范圍4 000～450 cm-1,每張光譜掃描次數(shù)16次·s-1,光譜分辨率為4 cm-1,掃描速度0.2 cm·S-1,掃描時扣除CO2和H2O,室溫20～25 ℃,相對濕度25%～35%[5]。

2.4 數(shù)據(jù)處理

各樣品采集的紅外原始光譜采用Spectrum for window3.02軟件進行處理,分別進行基線校正、歸一化處理并計算紅外光譜相對峰高。以紅外指紋圖譜的相對峰高為原始數(shù)據(jù)使用SPSS19.0、SIMCA 14.1軟件進行聚類分析、主成分分析及正交偏最小二乘法-判別分析。

2.5 不同批次一貫煎基準樣品紅外光譜分析

不同批次一貫煎湯劑基準樣品按照2.3項下壓制樣品片并掃描其紅外光譜。從不同批次一貫煎基準樣品紅外光譜圖可看出,其紅外光譜指紋圖譜峰形、峰位、峰高基本相似,不同批次基準樣品中含有相同的化學成分,所含的特征峰、形狀基本一致,有個別特征峰的高度突出,指紋區(qū)存在一定差異,如圖1所示。

圖1 15批一貫煎傳統(tǒng)湯劑紅外光譜疊加圖Fig.1 Infrared spectral overlay of 15 batches of Yiguanjian traditional tonics

圖2 15批一貫煎湯劑吸光度平均圖Fig.2 Average absorbance profiles of 15 batches of Yiguanjian tonics

如圖3所示,川楝子飲片紅外光譜2 854和1 746 cm-1波段處有明顯強吸收峰,單川楝子湯劑紅外光譜2 854 cm-1波段處強峰消失,1 746 cm-1波段處峰強減弱,考慮是川楝子飲片經水煎煮后脂類成分減少(2 854和1 746 cm-1為脂類成分特征吸收峰[9]),缺川楝子陰性對照傳統(tǒng)湯劑紅外光譜2 854和1 746 cm-1波段處強峰消失,一貫煎傳統(tǒng)湯劑基準樣品紅外光譜2 854和1 746 cm-1波段處也無明顯強峰,考慮是川楝子與其他五味藥配伍煎煮過程中化學成分發(fā)生變化,脂類糖苷類成分減少。

圖3 川楝子傳統(tǒng)湯劑紅外光譜陰性對比圖譜Fig.3 Melia toosendan Sieb.et Zucc. traditional soup infrared spectrum negative comparison spectrum

如圖4所示,當歸飲片紅外光譜1 760和993 cm-1波段處有明顯吸收強峰,單當歸湯劑紅外光譜1 760 cm-1波段處強峰消失,993 cm-1波段處有明顯強峰,考慮是當歸煎煮后脂類成分減少,缺當歸陰性對照傳統(tǒng)湯劑紅外光譜1 760和993 cm-1波段處強峰消失,一貫煎傳統(tǒng)湯劑基準樣品紅外光譜1 760和993 cm-1波段處也無明顯強峰,考慮是當歸與其他五味藥配伍煎煮過程中化學成分發(fā)生變化,糖類成分減少。

圖4 當歸傳統(tǒng)湯劑紅外光譜陰性對比圖譜Fig.4 Infrared spectral negative comparison profile of Angelicae Sinensis Radix traditional tonics

如圖5所示,枸杞飲片、單枸杞湯劑基準樣品、一貫煎傳統(tǒng)湯劑基準樣品紅外光譜868、822、779 cm-1波段處有明顯強峰(糖骨架伸縮振動吸收峰),缺枸杞陰性對照傳統(tǒng)湯劑紅外光譜868、822、779 cm-1處強峰消失,表明枸杞中含有大量糖類成分,且一貫煎湯劑中的糖類成分多為枸杞貢獻。

圖5 枸杞傳統(tǒng)湯劑紅外光譜陰性對比圖譜Fig.5 Infrared spectral negative comparison spectrum of Lyciumbarbarum L. traditional tonics

如圖6所示,麥冬飲片和單麥冬湯劑基準樣品紅外光譜1 131、930和815 cm-1波段處有明顯強峰,缺麥冬陰性對照傳統(tǒng)湯劑紅外光譜1 131、930和815 cm-1處吸收峰變弱,一貫煎傳統(tǒng)湯劑基準樣品紅外光譜1 131和930 cm-1波段處有吸收峰稍有變強,815 cm-1處吸收峰明顯變強,此處為糖環(huán)骨架伸縮振動吸收峰,表明麥冬中含有大量糖苷類成分,且一貫煎湯劑中的糖苷類成分部分為麥冬貢獻。

圖6 麥冬傳統(tǒng)湯劑紅外光譜陰性對比圖譜Fig.6 Infrared spectral negative comparative profile of Ophiopogonis Radix traditional tonics

如圖7所示,北沙參飲片和單北沙參湯劑基準樣品紅外光譜1 158、1 082和1 019 cm-1波段處有階梯狀吸收強峰(淀粉特征吸收峰1 200～950 cm-1),缺北沙參陰性對照傳統(tǒng)湯劑紅外光譜1 158、1 082和1 019 cm-1處吸收峰明顯變弱,一貫煎傳統(tǒng)湯劑基準樣品紅外光譜1 158、1 082和1 019 cm-1處有吸收峰稍有變強,表明北沙參中含有大量糖類成分,且一貫煎湯劑中的糖類成分部分為北沙參貢獻。

圖7 北沙參傳統(tǒng)湯劑紅外光譜陰性對比圖譜Fig.7 Glehniae Radix traditional soup infrared spectra negative comparative profile

如圖8所示,生地黃和單生地黃湯劑基準樣品紅外光譜1 148 cm-1波斷處有明顯強峰,缺生地黃陰性對照傳統(tǒng)湯劑紅外光譜1 148 cm-1處吸收峰變弱,一貫煎傳統(tǒng)湯劑基準樣品紅外光譜1 148 cm-1處吸收峰稍有變強,表明生地黃中含有大量糖類成分,且一貫煎湯劑中的糖類成分部分為生地黃貢獻。

圖8 生地黃傳統(tǒng)湯劑紅外光譜陰性對比圖譜Fig.8 Infrared spectral negative comparison spectrum of Rehmanniae Radix traditional tonics

2.6 聚類分析

運用Spectrum for window3.02軟件將采集的紅外原始光譜圖由透過率T%轉換成吸光度A,進行自動基線校正,自動平滑處理。選擇3 500～3 200 cm-1波段范圍內的最高峰的吸光度歸一化處理[5],計算14個特征峰的峰高,結果見表3。以15批一貫煎湯劑基準樣品的14個特征峰的相對峰高為原始數(shù)據(jù),將數(shù)據(jù)輸入SPSS19.0軟件,采用組間連接法,以平方Euclidean距離為分類依據(jù),橫坐標為組間距離,縱坐標為樣品編號,對樣品進行系統(tǒng)聚類分析[9],結果見圖9。當組間距離=10時,S1、S2、S15聚為一類,S9、S11、S12、S13、S14聚為一類,S3、S4、S5、S6、S7、S8、S10聚為一類,表明不同批次一貫煎湯劑內部質量存在一定差異。

圖9 一貫煎湯劑紅外聚類分析樹狀圖Fig.9 Tree diagram of infrared cluster analysis of Yiguanjian tonics

表3 一貫煎湯劑紅外指紋圖譜共有峰相對峰高(n=6)Table 3 Relative peak heights of shared peaks in infrared fingerprinting of Yiguanjinan tonics (n=6)

續(xù)表3

2.7 主成分分析

主成分分析是在盡可能保持原有數(shù)據(jù)信息的前提下,通過降維處理達到簡化指標的目的,目前已被廣泛用于數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析[5]。以15批一貫煎傳統(tǒng)湯劑基準樣品的14個共有峰相對峰高為原始數(shù)據(jù),運用SPSS19.0軟件標準化處理進行主成分分析,主成分特征值及方差貢獻率見表4,因前三個因子累計方差貢獻率為87.207%>85%[5],充分代表了一貫煎傳統(tǒng)湯劑基準樣品14個共有峰的基本特征和主要信息,故選取其中特征值大于1的前三個主成分(特征值分別為8.115、2.437、1.657)作為主成分1、主成分2、主成分3。由圖10可見前3個因子斜率陡峭,后趨于平緩,可將前3個因子作為主成分。

圖10 主成分碎石圖Fig.10 Principal component gravel map

表4 主成分特征值與累積方差貢獻率表Table 4 Table of eigenvalues and cumulative variance contribution of principal components

運用SIMCA 14.1軟件繪制主成分得分圖,結果見圖11,15批一貫煎基準樣品沿PCI軸明顯區(qū)分開,S1、S2、S15聚為一類,S4、S9、S11、S12、S13、S14聚為一類,S3、S5、S6、S7、S8、S10聚為一類,除S4以外,該結果與聚類分析結果一致。根據(jù)變量離原點的距離判定變量對主成分的權重影響,離原點越遠則表明該變量對主成分的影響權重越大[8,10]。由載荷散點圖(圖12)分析得到1 104、1 142、1 412、1 260、868 cm-1波段峰對主成分1的貢獻率較大;777、2936、923、1 721、818、637 cm-1波段峰對主成分2的貢獻較大。

圖11 一貫煎傳統(tǒng)湯劑基準樣品紅外主成分散點圖Fig.11 Infrared principal component scatter plot of Yiguanjian traditional soup benchmark sample

圖12 一貫煎傳統(tǒng)湯劑基準樣品紅外主成分載荷圖Fig.12 Infrared principal component loadings of Yiguanjian traditional soup benchmark samples

依據(jù)SPSS19.0軟件計算3個主成分的得分,以各主成分的方差貢獻率為權重,對主成分得分和對應的權重進行加權平均,計算綜合得分(Y綜),其中Y綜=(57.964×PC1+17.410×PC2+11.832×PC3)/87.207(其中PC1、PC2、PC3分別代表主成分1、2、3的得分),結果見表5。其中綜合得分情況可反映一貫煎湯劑的質量,分數(shù)越高,則質量越好[11]。由表5可知,批次3一貫煎湯劑質量最佳,批次1一貫煎湯劑質量最次。結合主成分得分排序表5、主成分散點圖11和聚類分析圖9可知綜合得分比較靠前的一貫煎湯劑S3、S5、S6、S7、S8、S10為一類,S4、S9、S11、S12、S13、S14為一類,綜合得分排序靠后的批次聚為一類(S1、S2、S15)。

表5 一貫煎湯劑紅外主成分得分及排序表Table 5 Infrared principal component scores and ranking table for Yiguanjian tonics

2.8 正交偏最小二判別分析

圖13 傳統(tǒng)湯劑紅外OPLS-DA散點圖Fig.13 Infrared OPLS-DA scatter plot for traditional soup

圖14 一貫煎傳統(tǒng)湯劑OPLS-DA模型的200次響應排序檢驗Fig.14 200 response ranking test for the OPLS-DA model for Yiguanjian traditional tonics

為進一步篩選出導致15批傳統(tǒng)湯劑基準樣品產生差異的成分,通過提取OPLS-DA模型中14個變量的重要值(variable importance in projection,VIP),以VIP>1[13]為標準,篩選出777、637、923、2 936、1 260、1 412和1 630 cm-1波段(圖15)可能是導致樣品之間產生差異的主要原因,具有一定的標志性作用,該結果與PCA載荷圖中尋找的重要性權重變量基本一致。

圖15 一貫煎傳統(tǒng)湯劑紅外的OPLS-DA的VIP值圖Fig.15 VIP value plot of OPLS-DA for Yiguanjian traditional soup IR

本研究建立了15批一貫煎基準樣品的紅外指紋圖譜,標定了14個共有峰,并結合單味飲片粉末、單味飲片單煎液和缺味藥陰性紅外圖譜,發(fā)現(xiàn)868、822和779 cm-1波段糖骨架伸縮振動吸收峰,多為枸杞所貢獻,815 cm-1處少數(shù)為麥冬所貢獻;川楝子單煎液1 746 cm-1波段處可溶性脂類糖苷成分吸收峰明顯,但與其他五味藥合并煎煮之后此處吸收峰被覆蓋,一貫煎復方中此處吸收峰并不明顯;生地黃單煎液在1 148 cm-1波段處、沙參單煎液在1 158、1 082和1 019 cm-1波段處、當歸單煎液在993 cm-1波段處均有對糖苷類成分的貢獻,表明復方與飲片有較好的關聯(lián)性。

從HCA結果來看,在不同批次的一貫煎基準樣品中的化學成分含量存在一定的差異,S1、S2、S15聚為一類,S9、S11、S12、S13、S14聚為一類,S3、S4、S5、S6、S7、S8、S10聚為一類。隨后進行了無監(jiān)督的PCA,該分類結果與聚類分析一致,也進一步驗證了聚類分析的結果。結合主成分得分排序表5、主成分散點圖11和聚類分析圖9可知綜合得分比較靠前的批次一貫煎湯劑S3、S5、S6、S7、S8、S10為一類,S4、S9、S11、S12、S13、S14為一類,綜合得分排序靠后的批次聚為一類(S1、S2、S15)。在對一貫煎進行一致性評價的同時進行了差異性評價,通過VIP法篩選出了對樣品組分影響較大的波段,篩選出777、637、923、2 936、1 260、1 412和1 630 cm-1波段為差異主要貢獻波段,提示在今后該經典名方的生產過程中應重點關注糖苷類成分、酸類成分的變化,進而保證一貫煎的質量,以便更好地對一貫煎傳統(tǒng)湯劑進行質量控制。

3 結 論

采集15批一貫煎傳統(tǒng)湯劑基準樣品、單味飲片粉末、單煎液凍干粉及陰性凍干粉紅外指紋圖譜,尋找各單味藥在復方中的主要貢獻成分類別,綜合得分排序結果與聚類分析、主成分分析結果一致,表明不同批次一貫煎傳統(tǒng)湯劑內部質量存在一定差異,最終篩選出 777、637、923、2 936、1 260、1 412和1 630 cm-1波段為差異主要貢獻波段。本實驗所建立的一貫煎傳統(tǒng)湯劑基準樣品紅外指紋圖譜方法簡單、準確度高,可用于該經典名方的快速鑒別研究。