復(fù)方氨酚溴敏膠囊中對(duì)氨基酚的檢查

曾金亮，周雅麗，龐發(fā)根，梁智淵，劉 敏，殷 果，李玉蘭，王曉煒

(深圳市藥品檢驗(yàn)研究院，廣東 深圳 518057)

復(fù)方氨酚溴敏膠囊由馬來(lái)酸氯苯那敏、鹽酸溴己新、咖啡因、對(duì)乙酰氨基酚和鹽酸去氧腎上腺素組成，主要緩解因普通流感引起的感冒癥狀。對(duì)氨基酚為合成過(guò)程中乙酰化不完全或儲(chǔ)存過(guò)程受潮水解產(chǎn)生[1]，毒性大，可引起腎損傷，且具有基因毒性，可致畸[2]，本研究旨在建立HPLC法對(duì)復(fù)方氨酚溴敏膠囊中對(duì)氨基酚進(jìn)行檢查。

1 儀器與試藥

Waters e2695-2998高效液相色譜儀，梅特勒XSE205DU電子天平，默克Purospher RP8(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱。對(duì)氨基酚、鹽酸溴己新、馬來(lái)酸溴苯那敏、對(duì)乙酰氨基酚、咖啡因和鹽酸去氧腎上腺素和N-(2琥珀酰)-去氧腎上腺素等對(duì)照品。默克的色譜純甲醇和乙腈，上海凌峰的高氯酸鈉試劑，實(shí)驗(yàn)室超純水。樣品為某廠家成品制劑。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜方法與系統(tǒng)適用性

C8柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，100 mmol/L高氯酸鈉(含0.1%高氯酸)作A相，乙腈作B相，1.0 mL/min流速，230 nm波長(zhǎng)，20 μL進(jìn)樣量，甲醇-水(4∶6)作溶劑。梯度方法如表1所示。

表1 液相梯度方法Table 1 The liquid-phase gradient method

取對(duì)氨基酚對(duì)照品 4.88 mg→50.00 mL，精取2 mL→20.00 mL(含0.3032 g膠囊內(nèi)容物)，作為系統(tǒng)適用性溶液，色譜分析得理論板數(shù)按對(duì)氨基酚峰計(jì)算為7709，與前后相鄰雜質(zhì)峰分離度分別為14.8和7.2，系統(tǒng)適用性良好，見圖1。

圖1 系統(tǒng)適用性圖譜Fig.1 System suitability chromatogram

2.2 線性與范圍

取對(duì)氨基酚對(duì)照品49.70 mg→500.00 mL，按表2配制得到相當(dāng)于100%，50%，10%，5%，1%濃度的對(duì)氨基酚線性溶液，進(jìn)行分析，詳見表2、圖2。

圖2 線性擬合圖Fig.2 Linear fit to fig

表2 線性溶液配制及色譜分析結(jié)果Table 2 Results of linear solution preparation and chromatographic analysis

圖2可見，線性擬合方程為y=66077x-27765，r2=0.999，表明在該色譜條件下，對(duì)氨基酚的濃度在0.994～99.4 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 專屬性試驗(yàn)

分別配制下列溶液，稀釋劑：甲醇-水(4∶6)；酸破壞樣品：0.3040 g膠囊內(nèi)容物→25.00 mL，加0.1 mol/L鹽酸溶液5 mL，室溫下放置1 h，再加0.1 mol/L氫氧化鈉溶液5 mL；堿破壞樣品：0.3068 g膠囊內(nèi)容物→25.00 mL棕色容量瓶中，加0.1 mol/L氫氧化鈉溶液5 mL，室溫下放至1 h，再加0.1 mol/L鹽酸溶液5 mL；氧化破壞樣品：0.3060 g膠囊內(nèi)容物→25.00 mL，加30%過(guò)氧化氫溶液5 mL，在室溫放置1 h；高溫破壞樣品：0.3065 g膠囊內(nèi)容物→25.00 mL容量瓶，加稀釋劑5.00 mL溶解，于105 ℃烘箱中放置24 h，上述破壞溶液最后均需加稀釋劑稀釋至刻度，色譜分析結(jié)果見圖3～圖7。

圖3 稀釋劑圖譜Fig.3 Diluent chromatogram

圖4 酸破壞圖譜Fig.4 Acid damage chromatogram

圖5 堿破壞圖譜Fig.5 Alkadli damage chromatogram

圖6 氧化破壞圖譜Fig.6 Oxidative damage chromatogram

圖7 高溫破壞圖譜Fig.7 High temperature damage chromatogram

經(jīng)酸、堿、高溫和氧化破壞樣品，色譜分析結(jié)果顯示對(duì)氨基酚出峰位置兩邊均無(wú)明顯雜質(zhì)峰，對(duì)對(duì)氨基酚檢測(cè)均無(wú)影響，表明該方法專屬性好。

2.4 檢測(cè)限和定量限

取濃度為0.994 μg/mL的線性對(duì)照品溶液5.00 mL→200 mL(濃度約為0.025 μg/mL)，作為檢測(cè)限溶液，色譜分析結(jié)果S/N=3，故檢測(cè)限為0.025 μg/mL；在藥品檢驗(yàn)色譜分析中，將信噪比S/N=10作為定量限的量度，S/N=3作為檢測(cè)限的量度，故由檢測(cè)限濃度折算定量限為0.025÷3×10=0.083 μg/mL。色譜圖詳見圖8。

圖8 檢測(cè)限圖譜Fig.8 Detection limit chromatogram

2.5 回收率試驗(yàn)

分別精取對(duì)氨基酚對(duì)照品18.08 mg、18.55 mg→100.00 mL(儲(chǔ)備液)，分別精取2 mL→20.00 mL(作為對(duì)照品溶液)，并按表3精取第一份儲(chǔ)備液置含約0.3032 g輔料棕色容量瓶中，濃度相當(dāng)于上述溶液的80%，100%，120%的回收率溶液，分析及計(jì)算結(jié)果見表3、表4。

表3 回收率溶液配配制表Table 3 Distribution list of recovery solutions

表4 對(duì)氨基酚回收率結(jié)果Table 4 Parataminophen recovery results

回收率色譜分析計(jì)算結(jié)果顯示，對(duì)氨基酚的低、中、高三個(gè)水平濃度的平均回收率(n=9)為101.2%，RSD為0.6%，表明回收率試驗(yàn)結(jié)果良好，方法準(zhǔn)確度良好。

2.6 精密度試驗(yàn)

取10%線性溶液連續(xù)6次進(jìn)樣，結(jié)果見表5，RSD為0.3%，說(shuō)明儀器精密度良好。

表5 精密度結(jié)果Table 5 Precision results

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精取20.60 mg對(duì)氨基酚對(duì)照品→200.00 mL，分別精密量取2 mL→20.00 mL(6份，每份約含0.3050 g內(nèi)容物)，試驗(yàn)結(jié)果如表6所示，試驗(yàn)結(jié)果表明重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果良好。

表6 重復(fù)性結(jié)果Table 6 Repeatability results

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取對(duì)氨基酚對(duì)照品9.97 mg→100.00 mL(儲(chǔ)備液1)，精取2 mL儲(chǔ)備液1→20.00 mL，在室溫環(huán)境中，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、20 h、24 h進(jìn)樣；結(jié)果如表7所示，試驗(yàn)結(jié)果表明對(duì)氨基酚在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

表7 穩(wěn)定性結(jié)果Table 7 Stability results

2.9 濾膜相容性試驗(yàn)

取穩(wěn)定性試驗(yàn)項(xiàng)下儲(chǔ)備液1，按穩(wěn)定性項(xiàng)下方法配制加標(biāo)樣品溶液，在其他條件不變情況下，分別棄去0 mL，1 mL，2 mL，3 mL，4 mL，5 mL后濾液作為供試品溶液；同時(shí)，在其他條件不變情況下，制備經(jīng)離心10000 r 15 min所得上清液作為對(duì)照供試品溶液，結(jié)果如表8所示，試驗(yàn)結(jié)果表明方法濾膜相容性良好。

表8 濾膜相容性結(jié)果Table 8 Filter membrane compatibility results

表9 對(duì)氨基酚測(cè)定結(jié)果Table 9 Results of p-aminophen determination

2.10 樣品測(cè)定

取復(fù)方氨酚秀敏膠囊20粒，精密稱定，計(jì)算平均裝量，取內(nèi)容物混勻，分別精密稱取0.3056 g、0.3068 g(含對(duì)乙酰氨基酚約250 mg)→25.00 mL；同法制備0.01 mg/mL對(duì)氨基酚的對(duì)照品溶液；依法測(cè)定，記錄譜圖，結(jié)果見9。

檢測(cè)結(jié)果顯示，樣品均未檢出對(duì)氨基酚雜質(zhì)，說(shuō)明樣品中對(duì)氨基酚含量極低，作為參考，遠(yuǎn)低于藥典對(duì)乙酰氨基酚片劑項(xiàng)下規(guī)定的0.1%。

3 結(jié) 論

通過(guò)沃特世高效液相色譜儀掃3D圖譜(200～300 nm)，發(fā)現(xiàn)對(duì)氨基酚最大吸收在230 nm波長(zhǎng)處，故選定230 nm作為此次研究的檢測(cè)波長(zhǎng)，根據(jù)藥典要求對(duì)該方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，考察系統(tǒng)適用性，結(jié)果顯示對(duì)氨基酚與相鄰雜質(zhì)峰分離效果好；考察酸、堿、高溫和氧化等對(duì)樣品進(jìn)行破壞，均未有明顯影響對(duì)氨基酚檢測(cè)的雜質(zhì)峰，各破壞均對(duì)對(duì)氨基酚的檢測(cè)無(wú)干擾，表明方法專屬性強(qiáng)；且方法儀器精密度良好，重復(fù)性測(cè)定結(jié)果良好，說(shuō)明該方法可用于復(fù)方氨酚溴敏膠囊中的雜質(zhì)對(duì)氨基酚的檢測(cè)，高效可行。對(duì)氨基酚作為對(duì)人有影響的毒性物質(zhì)[3]，在生產(chǎn)過(guò)程中難以避免地產(chǎn)生，有研究表明，對(duì)水生環(huán)境也有長(zhǎng)遠(yuǎn)的影響[4]，在藥檢領(lǐng)域當(dāng)予以關(guān)注[5-7]，因此建立方法對(duì)該雜質(zhì)的檢測(cè)是非常必要的，藥典2020年版[8]對(duì)乙酰氨基酚片中也對(duì)該雜質(zhì)進(jìn)行了控制，本文參考各研究[9-12]，建立HPLC法檢測(cè)復(fù)方氨酚溴敏膠囊中的對(duì)氨基酚，為復(fù)方氨酚溴敏膠囊質(zhì)量控制的研究提供參考。