響應(yīng)曲面法優(yōu)選蜜百合的炮制工藝研究

郭志俊，高 波，2

(1 華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司，廣東 深圳 518110；2 安徽華潤(rùn)金蟾藥業(yè)股份有限公司，安徽 淮北 235000)

百合為百合科植物卷丹LiliumlancocifoliumThunb.、百合LiliumbrowniiF·E·Brownvar.viridulumBaker或細(xì)葉百合LiliumpumilumDC.的干燥肉質(zhì)鱗葉，具有養(yǎng)陰潤(rùn)肺，清心安神的功效，臨床多用于陰虛燥咳，勞嗽咳血，虛煩驚悸，失眠多夢(mèng)，精神恍惚[1]。百合藥材中含有酚酸甘油酯、甾體皂苷、多糖、多酚、生物堿等多種類化學(xué)成分[2-7]，其中，酚酸甘油脂類成分具有抗腫瘤、抗氧化、抗增殖、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[8-9]，王百合苷B為百合中主要的酚酸甘油脂類成分之一。

蜜百合為百合臨床常用的主要炮制品之一，百合經(jīng)蜜制后，能增強(qiáng)其潤(rùn)肺止咳的功效。《中國(guó)藥典》2020年版收載蜜百合的炮制方法無(wú)具體的工藝參數(shù)規(guī)定，目前，蜜百合的實(shí)際加工生產(chǎn)中多憑老藥工經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行炮制，導(dǎo)致蜜百合批間質(zhì)量差異較大，影響臨床療效。本試驗(yàn)以王百合苷B含量和蜜百合飲片性狀為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用響應(yīng)曲面法對(duì)蜜百合的炮制工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為蜜百合的炮制工藝和質(zhì)量的控制提供依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀 器

Thermo U3000型高效液相色譜儀，賽默飛世爾科技公司；XPE26型電子分析天平，梅特勒-托利多；MS204S型電子分析天平，梅特勒-托利多；KQ-500DE型超聲清洗機(jī)，昆山市超聲儀器有限公司；CY25型中藥炒藥機(jī)，溫州鼎力醫(yī)療器械有限公司。

1.2 試 劑

王百合苷B對(duì)照品(批號(hào)：230039-201901、純度≥98%)，上海鴻永生物科技有限公司；乙腈、甲醇均為色譜純，其他試劑為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Inertsustain AQ C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；以乙腈-0.1%磷酸溶液(19∶81)為流動(dòng)相等度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為312 nm；進(jìn)樣量10 μL，見圖1。

圖1 對(duì)照品王百合苷B(A)及蜜百合供試品(B)HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of regaloside B (A)and sample solution of honey fried lily (B)

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取王百合苷B對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含120 μg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取本品粉末(過三號(hào)篩)1.0 g，精密稱定，精密加入80%乙醇25 mL，稱定重量，回流提取30 min，放冷，再稱定重量，用80%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 蜜百合炮制工藝單因素考察

2.4.1 蜜水加入先后順序的考察

取凈百合飲片200 g，平行2份，一份置熱鍋內(nèi)，用文火(鍋溫140 ℃)炒干，噴淋蜜水(煉蜜約10 g，煉蜜∶水=1∶4)；另一份淋入蜜水(煉蜜約10 g，煉蜜∶水=1∶4)，拌勻，悶透，置熱鍋內(nèi)，用文火(140 ℃)炒至不粘手時(shí)，取出，晾涼。按照上述測(cè)定方法測(cè)定2份蜜百合中王百合苷B含量，結(jié)果前者含量為0.27%、后者含量為0.26%，表明兩種方法所制得蜜百合飲片中王百合苷B含量基本一致，綜合考慮炮制工藝的方便易操作性，選擇先加蜜水后炒制的方法開展后續(xù)蜜百合炮制工藝研究。

2.4.2 蜜水比例的選擇

取凈百合飲片200 g，平行5份，加入煉蜜水(煉蜜約10 g)，其中煉蜜與水的比例分別為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6，拌勻，潤(rùn)透，置140 ℃的炒鍋內(nèi)炒至不粘手時(shí)，取出，晾涼。按照上述測(cè)定方法測(cè)定5份蜜百合中王百合苷B含量，結(jié)果見圖2，表明隨著蜜水比例的增加，蜜百合飲片中王百合苷B的含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。同時(shí)，當(dāng)煉蜜與水比例低于1∶4時(shí)，存在拌不勻、潤(rùn)不透現(xiàn)象，當(dāng)高于1∶5時(shí)，又出現(xiàn)潤(rùn)制太過現(xiàn)象，綜合王百合苷B和潤(rùn)制程度考慮，暫定蜜水比例為1∶4。

圖2 不同蜜水比對(duì)王百合苷B含量的影響Fig.2 The effect of different ratio of honey and water on the content of regaloside B

2.4.3 炒制溫度的選擇

取凈百合飲片200 g，平行5份，加入煉蜜水(煉蜜約10 g，煉蜜∶水=1∶4)，拌勻，潤(rùn)透，分別置于100 ℃、120 ℃、140 ℃、160 ℃、180 ℃的炒鍋內(nèi)炒至不粘手時(shí)，取出，晾涼。按照上述測(cè)定方法測(cè)定5份蜜百合中王百合苷B含量，結(jié)果見圖3，表明隨著炒制溫度的增加，蜜百合飲片中王百合苷B的含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。同時(shí)，在蜜炙過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)炒制溫度過高時(shí)，可使蜜百合飲片表面變?yōu)榧t色，其中160 ℃炒制14 min，180 ℃炒制10 min均可致蜜百合飲片表面變?yōu)榧t色或紅褐色。綜合蜜百合飲片外觀性狀和王百合苷B含量結(jié)果，暫定蜜百合的炒制溫度為140 ℃。

圖3 不同炒制溫度對(duì)王百合苷B含量的影響Fig.3 The effect of different frying temperature on the content of regaloside B

2.4.4 炒制時(shí)間的選擇

取凈百合飲片200 g，平行6份，加入煉蜜水(煉蜜約10 g，煉蜜∶水=1∶4)，拌勻，潤(rùn)透，置于140 ℃的炒鍋內(nèi)，分別炒制10 min、12 min、14 min、16 min、18 min、20 min，取出，晾涼。按照上述測(cè)定方法檢測(cè)6份蜜百合飲片性狀及王百合苷B含量，結(jié)果見表1。表明隨著炒制時(shí)間的增加，蜜百合飲片中王百合苷B的含量先微增后降低，且隨著炒制時(shí)間的增加，蜜百合飲片的顏色逐漸加深，從黃白色到紅色。結(jié)合性狀和王百合苷B含量，暫定蜜百合的最佳炒制時(shí)間為14 min。

表1 不同炒制時(shí)間蜜百合飲片檢測(cè)結(jié)果Table 1 Results of honey fried lily at different frying time

2.5 響應(yīng)面法優(yōu)選蜜百合炮制工藝

2.5.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，優(yōu)選蜜百合的最佳炮制工藝。采用Design Expert 12軟件BoxBehnken試驗(yàn)的三因素三水平設(shè)計(jì)原理，以蜜水比(A)、炒制溫度(B)、炒制時(shí)間(C)三個(gè)因素為自變量，以蜜百合中王百合苷B含量(X1)和性狀(X2)的綜合評(píng)分為因變量，采用加權(quán)評(píng)分法優(yōu)選蜜百合的炮制工藝。設(shè)定滿分為100，含量和性狀權(quán)重系數(shù)均為0.5，綜合評(píng)分(Y)=X1/X1max×50+X2/X2max×50。共設(shè)定17組試驗(yàn)點(diǎn)，因素水平見表2，試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)曲面試驗(yàn)因素水平Table 2 Factor and level in response surface methodology

表3 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Response surface experiment design and results

以綜合評(píng)分為效應(yīng)值，通過Design Expert12軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合分析，擬合出蜜水比(A)、炒制溫度(B)、炒制時(shí)間(C)與綜合評(píng)分(Y)的多項(xiàng)回歸方程為Y=97.85-0.11A-3.56B-2.76C+1.67AB+7.06AC-3.71BC-6.65A2-8.64B2-5.05C2。該模型的方差分析結(jié)果及顯著性檢驗(yàn)見表4。

表4 響應(yīng)曲面回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of response surface method regression model

由表4可知，本模型P<0.001，具有極顯著性意義，結(jié)果中B、C為顯著項(xiàng)，A為不顯著項(xiàng)；在交互項(xiàng)中，AC為高度顯著項(xiàng)，BC為顯著項(xiàng)，AB為不顯著項(xiàng)?？偰Ｐ头匠滔嚓P(guān)系數(shù)R2=0.9501，表明實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值有很好的擬合度，且失擬項(xiàng)不顯著(P=0.1080)，表明其它因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響比較小，回歸方程的模擬良好，實(shí)驗(yàn)誤差相對(duì)較小。可采用該方法對(duì)百合的蜜炙工藝進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。

2.5.2 響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化

根據(jù)上述回歸方程，繪制各影響因素交互作用的三維響應(yīng)曲面圖，見圖4。響應(yīng)面圖的陡峭程度可直接反映各因素交互作用的強(qiáng)弱，C與A、B交互作用顯著，曲面較陡，A與B交互作用較弱，曲面相對(duì)平緩。運(yùn)用Design Expert 12軟件求解回歸方程，得到蜜百合的最佳炮制工藝為：蜜水比例為1∶3.77，炒制溫度為137.08 ℃，炒制時(shí)間為12.49 min。考慮到實(shí)際可操作性及設(shè)備的控制精度，將工藝參數(shù)調(diào)整為蜜水比例為1∶3.8，炒制溫度為137 ℃，炒制時(shí)間為12.5 min。

圖4 影響因素與綜合評(píng)分的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface diagram of influencing factors and comprehensive score

2.5.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

取凈百合飲片200 g，平行3份，按上述優(yōu)化后的炮制工藝制備蜜百合，測(cè)得王百合苷B含量和性狀的綜合評(píng)分均值為98.45，與模型預(yù)測(cè)值98.65接近，表明該炮制工藝穩(wěn)定可行。

3 討論與分析

3.1 練蜜加入先后順序考察

蜜炙時(shí)，通常有兩種操作方法，即“藥材先拌蜜后炒法”和“先炒藥材后加入蜜法”，前者操作方便，適用范圍較廣，便于工業(yè)化生產(chǎn)，后者多適用于質(zhì)地致密、堅(jiān)硬，煉蜜不易被吸收的藥材。通過研究發(fā)現(xiàn)兩種方法均可制備蜜百合飲片，且兩種方法制備的蜜百合飲片質(zhì)量基本一致。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲酸-水、乙腈-磷酸-水等流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用磷酸時(shí)王百合苷B色譜峰分離度、對(duì)稱性均良好，且保留時(shí)間適中。通過紫外全波長(zhǎng)掃描確定了王百合苷B在312 nm 處吸收較好，峰型適中，基線平穩(wěn)，故確定檢測(cè)波長(zhǎng)為312 nm。通過流速(0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min)、柱溫(20 ℃、25 ℃、30 ℃)的考察，發(fā)現(xiàn)不同流速、不同柱溫對(duì)王百合苷B色譜峰影響不大，故色譜條件中未對(duì)流速和柱溫進(jìn)行進(jìn)一步規(guī)定。

3.3 蜜炙過程中王百合苷B含量變化

在蜜百合飲片炮制過程中，隨著炒制溫度的增加或炒制時(shí)間的延長(zhǎng)，蜜百合中王百合苷B含量均存在先增加后降低的趨勢(shì)?？赡茉蚴窃谂谥七m中情況下，蜜百合經(jīng)加熱炒制后有效成分更易溶出，使王百合苷B含量增加；當(dāng)炮制太過情況下，因長(zhǎng)時(shí)間高溫炒制，導(dǎo)致王百合苷B成分分解而使之含量降低。

3.4 蜜百合炮制過程中的顏色變化

百合藥材表面顏色為黃白色至淡棕黃色，經(jīng)蜜炙后，蜜百合表面顏色加深，變?yōu)樽攸S色，且偶見有焦斑。研究中發(fā)現(xiàn)，蜜炙時(shí)若炒制溫度過高或炒制時(shí)間過長(zhǎng)，蜜百合飲片表面均易變?yōu)榧t色至紅褐色，可能是百合中的多酚類化學(xué)成分因高溫或長(zhǎng)時(shí)間加熱發(fā)生了氧化反應(yīng)。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)選擇蜜百合飲片外在的性狀和內(nèi)在的含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)、響應(yīng)曲面法試驗(yàn)，量化了蜜百合飲片的炮制工藝參數(shù)，避免老藥工經(jīng)驗(yàn)炮制存在批間或每鍋質(zhì)量波動(dòng)情況，保證了蜜百合飲片的質(zhì)量和臨床療效的穩(wěn)定。同時(shí)，也為蜜百合工業(yè)化、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。但中藥化學(xué)成分復(fù)雜，活性單體成分眾多，老中醫(yī)多認(rèn)為中藥是“多成分多靶點(diǎn)協(xié)同起作用”，僅采用王百合苷B含量對(duì)百合整體質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)是否合理，還需進(jìn)一步研究。