萊克多巴胺膠體金免疫層析試紙條的研制及性能測(cè)試*

張 燕，江迎春，李浩天，王 慧，郭 寧，楊爽爽，肖欣欣，劉闖軍

(1 黃淮學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，河南 駐馬店 463000；2 黃淮學(xué)院醫(yī)學(xué)院，河南 駐馬店 463000)

萊克多巴胺(Ractopamine，RAC)是由美國(guó)制藥公司研究出的一種人工合成的β-腎上腺受體激動(dòng)劑(俗稱(chēng)β-興奮劑)類(lèi)化合物[1]。在臨床上主要用于治療肌肉萎縮癥和充血性心力衰竭癥，也是治療支氣管哮喘的有效試劑。其具有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成的作用，國(guó)外也稱(chēng)其為蛋白質(zhì)再分配劑。這一類(lèi)物質(zhì)進(jìn)入牲畜體內(nèi)后通過(guò)改變其體內(nèi)的代謝路徑，從而抑制動(dòng)物體內(nèi)脂肪的形成并且可以促進(jìn)動(dòng)物骨骼肌蛋白質(zhì)的合成，提高“瘦肉率”[2]。RAC由于其毒性小、代謝快的特點(diǎn)，成為鹽酸克倫特羅的一種替代品，被稱(chēng)為第二代“瘦肉精”[3-4]。萊克多巴胺的毒性遠(yuǎn)低于具有相同功能的其它瘦肉精添加物。常規(guī)劑量的瘦肉精類(lèi)藥物可在機(jī)體內(nèi)被代謝并排出體外，不會(huì)對(duì)機(jī)體造成傷害。但過(guò)量食用含有RAC殘留的肉類(lèi)尤其是動(dòng)物內(nèi)臟時(shí)，將會(huì)導(dǎo)致人體中毒，臨床表現(xiàn)為呼吸困難、四肢麻痹、頭暈、惡心嘔吐、心律失常、腹痛等癥狀，重者可引發(fā)高血壓、心臟病甚至死亡[5]。各個(gè)國(guó)家對(duì)待萊克多巴胺的立場(chǎng)不盡相同，美國(guó)、日本、巴西、墨西哥、日本等國(guó)家和地區(qū)是允許在牲畜飼料中添加萊克多巴胺，而中國(guó)、俄羅斯和歐盟等國(guó)家和地區(qū)是禁止在養(yǎng)殖領(lǐng)域使用萊克多巴胺。我國(guó)在1997年3月就禁止在牲畜飼料中添加“瘦肉精”，并且于2002年將“瘦肉精”列為禁用藥品。2011年12月5日起在中國(guó)境內(nèi)禁止生產(chǎn)和銷(xiāo)售萊克多巴胺[6-7]。但是仍有不法商家違規(guī)使用，因此對(duì)市場(chǎng)肉品中萊克多巴胺殘留檢測(cè)極具價(jià)值。

萊克多巴胺殘留檢測(cè)的主要方法有高效液相色譜法(HPLC)、氣-質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)[8]、酶聯(lián)免疫層析吸附法(ELISA)[9]以及膠體金免疫層析法(GICA)[10]等。色譜法具有檢測(cè)靈敏度高、分離效率高、準(zhǔn)確度高及使用樣品量少等優(yōu)點(diǎn)，但是需要價(jià)格昂貴的大型儀器，專(zhuān)業(yè)的實(shí)驗(yàn)室和檢測(cè)人員，且檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，不能夠滿(mǎn)足快速檢測(cè)的要求[11]。

膠體金免疫層析法是近年來(lái)發(fā)展的一種快速檢測(cè)方法，具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本低、現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)快速等優(yōu)點(diǎn)[12]，膠體金試紙條非常適合市場(chǎng)監(jiān)督部門(mén)現(xiàn)場(chǎng)抽檢初篩以及商販對(duì)肉品自檢。本文主要對(duì)萊克多巴胺膠體金免疫層析試紙條的制作工藝進(jìn)行了優(yōu)化，通過(guò)實(shí)驗(yàn)選擇出一種最合適的方案，使其靈敏度、特異性、穩(wěn)定性以及經(jīng)濟(jì)成本達(dá)到最優(yōu)。高靈敏度、特異性明顯、穩(wěn)定性好的試紙條對(duì)實(shí)際檢測(cè)工作具有重要的意義。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

MF00401萊克多巴胺抗體、M21083003羊抗鼠lgG抗體，杭州隆基生物技術(shù)有限公司；X042110A萊克多巴胺抗原，上海士鋒生物科技有限公司；膠體金(40 nm)，長(zhǎng)沙美牛生物科技有限公司；牛血清蛋白(BSA)，MP生物醫(yī)療公司；液體生物防腐劑，北京萊寶科技有限公司；JJ120/JJ140硝酸纖維素膜，杭州普睿博生物科技有限公司；CN140硝酸纖維素膜，德國(guó)Sartorius公司；Z70/SB06玻璃纖維膜、CH37吸水紙、PVC背襯板，上海金標(biāo)生物科技有限公司；3β-腎上腺素受體激動(dòng)劑(色譜純)，壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；PBS緩沖溶液，上海泰坦科技股份有限公司；其它試劑為分析純。

HM3035 XYZ三維劃膜噴金儀、ZQ4200數(shù)控感應(yīng)斬切機(jī)，CTS300B數(shù)控裁條機(jī)，上海金標(biāo)生物科技有限公司；VM-500S小型渦旋混合器，寧波市鄞州群安實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；Centrifuge 5418R冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；101-00BS電熱鼓風(fēng)式恒溫干燥箱，上海力辰邦西儀器科技公司。

1.2 膠體金-RAC抗體偶聯(lián)物的制備

移取1 mL膠體金溶液于1.5 mL離心管中，用0.1 mol/L的HCl或0.1 mol/L的K2CO3調(diào)節(jié)膠體金的pH為最佳pH，使用小型渦旋混合器搖勻。加入稀釋為0.5 mg/mL的萊克多巴胺抗體最佳量，在小型渦旋混合器搖3～5 min，然后在4 ℃環(huán)境下靜置孵育30 min。在孵育完成的溶液中加入終濃度為1%的10% BSA溶液，混勻后，在4 ℃環(huán)境中封閉30 min。然后將溶液放置在冷凍離心機(jī)中，調(diào)節(jié)溫度為4 ℃，轉(zhuǎn)速12000 r/min離心30 min。離心結(jié)束后用注射器移除上清液，然后用配制的重懸液進(jìn)行3次洗滌，最后一次離心后用重懸液復(fù)溶至原溶液體積的1/10，此即為所得膠體金溶液。本實(shí)驗(yàn)選擇1%BSA+10%海藻糖+0.5%PEG2000+0.25%吐溫-20作為重懸液配方，為了提高試紙條保存時(shí)間，在重懸液中加入0.1%生物防腐劑。

1.3 膠體金免疫層析試紙條的制備

1.3.1 硝酸纖維素膜的包被

分別以RAC抗原和羊抗鼠 lgG抗體為硝酸纖維素膜(NC膜)上的檢測(cè)線(T線)和質(zhì)控線(C線)的包被物。使用XYZ三維劃膜噴金儀均勻平行的在NC膜上劃出兩條粗細(xì)適中線。放于恒溫干燥箱中37 ℃烘干2 h，待用。

1.3.2 樣品墊、結(jié)合墊預(yù)處理

使用數(shù)控感應(yīng)斬切機(jī)將型號(hào)為Z70的玻璃纖維膜裁剪到尺寸為100 mm×9 mm的長(zhǎng)條，將長(zhǎng)條浸泡到結(jié)合墊處理液中2 h，陰涼處晾1 h，放入37 ℃恒溫干燥箱烘干3 h，裝入密封袋備用。將型號(hào)為SB06的玻璃纖維膜裁成尺寸為100 mm×18 mm長(zhǎng)條，按照同樣操作用樣品墊處理液浸泡烘干。

1.3.3 試紙條的組裝

使用XYZ三維劃膜噴金儀將制備好的膠體金溶液均勻噴到結(jié)合墊上，在烘箱中烘干2 h。如圖1所示，在PVC背襯板上按照NC膜、吸水紙、噴金后結(jié)合墊、樣品墊的順序依次粘貼，并且在接連處需要重疊1 mm。將粘貼好的板子用數(shù)控裁條機(jī)裁切成3 mm寬的試紙條，裝殼后密封干燥保存。

圖1 試紙條粘板示意圖Fig.1 Schematic diagram of test strip

1.4 試紙條性能測(cè)試

制備的試紙條需要在陰性樣本和不同濃度的陽(yáng)性樣本中測(cè)試，檢測(cè)制備的試紙條其靈敏度、穩(wěn)定性以及長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存后其穩(wěn)定性情況。滴加80 μL樣本到試紙條加樣口，在五分鐘內(nèi)觀察其T、C線顯色情況。如圖2所示，如果T線顯色、C線顯色為陰性；如果C線顯色、T線不顯色為陽(yáng)性；如果C線顯色，T線顯色相對(duì)較弱，則為弱陽(yáng)性；如果C線不顯色，則產(chǎn)品無(wú)效。

圖2 膠體金免疫層析試紙條結(jié)果說(shuō)明示意圖Fig.2 Schematic illustration of colloidal gold immunochromatographic strip results

2 結(jié)果與討論

2.1 膠體金免疫層析試紙條的優(yōu)化

2.1.1 最佳pH確定

移取1 mL膠體金溶液于2.0 mL離心管中，用0.1 mol/L的K2CO3調(diào)節(jié)膠體金的pH值為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，加入K2CO3量分別為2 μL、6 μL、10 μL、16 μL、22 μL和32 μL。然后均加入稀釋為0.5 mg/mL的萊克多巴胺抗體8 μL，使用小型渦旋混合器充分搖勻后，低溫孵育30 min，加入10 μL 10%NaCl溶液，混合均勻后，低溫靜置2 h。觀察到各管中膠體金顏色發(fā)生明顯變化，當(dāng)pH≥6時(shí)溶液顏色為酒紅色且無(wú)聚沉現(xiàn)象，因此pH=6(加6 μL 0.1 mol/L的 K2CO3)為最佳pH。

2.1.2 最佳抗體標(biāo)記量的確定

取5支1.5 mL離心管各加入1 mL膠體金，調(diào)節(jié)pH為最適值，分別加入稀釋為0.5 mg/mL的萊克多巴胺抗體2 μL、4 μL、8 μL、12 μL和16 μL，其它條件不變，按步驟制備金標(biāo)液，做成試紙條進(jìn)行測(cè)試，找到顯色明顯的最低抗體使用量。通過(guò)觀察可以看出隨著抗體量增加T、C線顏色逐漸加深，抗體量達(dá)到4 μg時(shí)顏色幾乎不變且兩條線顏色亮度均勻，因此選擇4 μg作為最佳抗體量。

2.1.3 NC膜材料的篩選

在免疫層析檢測(cè)中，包被在硝酸纖維素膜上的蛋白質(zhì)作為待測(cè)樣本的捕獲試劑，NC膜需要具備良好的吸附效果，NC膜的性能對(duì)于試紙條的性能好壞有很大的影響，因此選擇合適型號(hào)的NC膜至關(guān)重要。本文對(duì)比了國(guó)內(nèi)外三種型號(hào)的NC膜(JJ-120、JJ-140、CN140)，通過(guò)對(duì)T線和C線的顯色情況進(jìn)行觀察，最終選擇JJ120型號(hào)的NC膜。

2.1.4 抗原、二抗固定量的選擇

通過(guò)篩選，選擇使用上海士鋒生物科技有限公司生產(chǎn)的萊克多巴胺抗原和杭州隆基生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的羊抗鼠lgG抗體，分別用含15%蔗糖的PBS緩沖溶液稀釋至濃度為0.5、0.8、1.0 mg/mL，為了使T、C線變寬，各加入終濃度為3%的甲醇溶液。按照表1交叉組合方式使用XYZ三維噴金劃線儀進(jìn)行劃線并制備成相應(yīng)試紙條，使用陰性提取液跑板，觀察顯色情況。在保證試紙條靈敏度的前提下，陰性樣品的檢測(cè)線(T線)和質(zhì)控線(C線)的顏色均勻且深淺一致。最終選擇T線濃度為0.8 mg/mL，C線濃度為1.0 mg/mL的固定量。

表1 抗原、二抗不同包被量的選擇Table 1 Selection of different coating amounts of antigen and secondary antibody

2.2 性能測(cè)試

2.2.1 靈敏度

將3β-腎上腺素受體激動(dòng)劑標(biāo)椎品稀釋1 ng/mL、2 ng/mL、3 ng/mL、5 ng/mL、8 ng/mL和10 ng/mL，各滴加80 μL于試紙條上，3～5 min內(nèi)觀察顯色情況，用三重蒸餾水作為陰性樣本。相對(duì)陰性樣本T線顏色明顯變淡則為弱陽(yáng)性，T線顏色消失則為陽(yáng)性，T線消失時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度為檢出限。如圖3所示，研制的試紙條在1 ng/mL時(shí)T線顏色明顯變淡，在2 ng/mL時(shí)T線消失，因此本試紙條的檢出限為2 ng/mL。

圖3 試紙條靈敏度測(cè)試Fig.3 Sensitivity test of strip

2.2.2 特異性

在制備的試紙條上分別滴加2 ng/mL 3β-腎上腺素受體激動(dòng)劑標(biāo)準(zhǔn)品、100 ng/mL磺胺標(biāo)準(zhǔn)品、100 ng/mL黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品和100 ng/mL嗎啡標(biāo)準(zhǔn)品。2 ng/mL 3β-腎上腺素受體激動(dòng)劑標(biāo)準(zhǔn)品T線消失，而其它幾種100 ng/mL濃度標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)果與陰性樣本測(cè)試結(jié)果無(wú)異。我們制作的萊克多巴胺膠體金試紙條對(duì)RAC特異性符合檢測(cè)要求，與其他藥品無(wú)交叉反應(yīng)。

2.2.3 穩(wěn)定性

將試紙條干燥情況下室溫保存，每二十天取出使用陰性樣本和2 ng/mL的陽(yáng)性標(biāo)品測(cè)試。觀察到待測(cè)試紙條在保質(zhì)期內(nèi)其外觀和準(zhǔn)確性均末發(fā)生變化，陰性和陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果都比較理想。該試紙條在密封干燥狀態(tài)下可保存12個(gè)月。

3 結(jié) 論

影響萊克多巴胺膠體金試紙條質(zhì)量的因素有很多，如膠體金顆粒大小、溶液pH、膠體金標(biāo)記抗體量、NC膜類(lèi)型、抗原和抗體包被量等。本實(shí)驗(yàn)的主要任務(wù)就是優(yōu)化萊克多巴胺膠體金試紙條的制作工藝，通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)對(duì)比，確定金標(biāo)液制備的最佳pH為6，最佳標(biāo)記抗體量為4 μg。對(duì)NC膜上抗原和抗體包被量進(jìn)行優(yōu)化選擇，最終選擇T線濃度為0.8 mg/mL，C線濃度為1.0 mg/mL。按照上述條件，對(duì)優(yōu)化后的試紙條的靈敏度、特異性、穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證。通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，萊克多巴胺試紙條檢出限在2 ng/mL，可憑肉眼在3～5 min 內(nèi)判定結(jié)果，特異性反應(yīng)達(dá)到要求，在將近一年的室溫儲(chǔ)存后，可以正常實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)制作出的試紙條達(dá)到定性檢測(cè)水平，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，作為一種快速篩查手段，具有重要的社會(huì)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。