小凹蛋白-1對RAW264.7巨噬細(xì)胞衰老相關(guān)分泌表型表達(dá)的抑制作用及其機(jī)制

李培，白玉芝，王晶，茹靜

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院老年科，北京100043

細(xì)胞衰老是動脈粥樣硬化（AS）進(jìn)展的病理生理基礎(chǔ)之一，AS斑塊內(nèi)有大量衰老表型的血管細(xì)胞，表現(xiàn)為細(xì)胞增殖減少、生長抑制和凋亡、DNA損傷增加和線粒體功能障礙。既往研究發(fā)現(xiàn)，在AS斑塊形成早期即可觀察到衰老表型巨噬細(xì)胞來源的泡沫細(xì)胞［1-2］，但衰老表型的巨噬細(xì)胞如何參與AS的機(jī)制尚不明確。衰老的巨噬細(xì)胞仍然是活細(xì)胞，衰老表型巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的促炎癥和基質(zhì)降解分子增多，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、組織因子（TF）、白介素-6（IL-6）、白介素-8（IL-8）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，被稱為巨噬細(xì)胞衰老相關(guān)分泌表型（SASP）［3］。小凹蛋白-1廣泛存在于血管細(xì)胞中，與細(xì)胞衰老關(guān)系密切，是衰老研究的熱點。我們的前期研究證實，巨噬細(xì)胞RAW264.7中的小凹蛋白-1在其衰老過程中起著重要的作用［4-5］，但其如何參與巨噬細(xì)胞衰老影響AS進(jìn)展的具體機(jī)制研究較少。2022年6月—2023年1月，本研究以oxLDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7建立細(xì)胞衰老模型，采用病毒感染技術(shù)特異性下調(diào)小凹蛋白-1在巨噬細(xì)胞的表達(dá)后，觀察巨噬細(xì)胞遷移能力及其衰老相關(guān)分泌表型的變化，以探討小凹蛋白-1對巨噬細(xì)胞RAW264.7分泌SASP的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7購自ATCC；oxLDL購自北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)；RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）購自美國Hyclone公司；細(xì)胞衰老特異性β-半乳糖苷酶檢測試劑盒、ELISA試劑盒、p38激動劑P79350購自Sigma公司；MMP2、MMP9、TF、p38、p-p38、actin多克隆抗體購自美國Abcam公司；細(xì)胞遷移實驗試劑盒購自Costar公司。

1.2 巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)及分組處理 采用前期研究方法篩選出下調(diào)小凹蛋白-1表達(dá)的細(xì)胞系［3］，在293FT中利用脂質(zhì)體2000試劑（Invitrogen）對慢病毒顆粒進(jìn)行包裝。將shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到包裝質(zhì)粒pCMV和包膜質(zhì)粒pHCMV-G上，Scramble shRNA作為對照（Ctrl shRNA）。48 h后，4 ℃將含有病毒顆粒的上清液2 000 r/min離心5 min。RAW 264.7細(xì)胞按5×105/孔接種在6孔板上（約70%融合）。12 h后，將0.5 mL含有慢病毒的培養(yǎng)上清液添加到含有8 mg/L聚凝胺的接種孔中。接種板在32 ℃、2 500 r/min離心1 h后繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后，將含3 mg/L嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)液加入到接種板中進(jìn)行篩選，第7天篩選穩(wěn)定的shRNA表達(dá)細(xì)胞系（Cav1 shRNA）。之后，選取Ctrl shRNA或Cav1 shRNA感染的巨噬細(xì)胞進(jìn)行實驗。分組一：兩種細(xì)胞分別用oxLDL（60 mg/L）處理或加入等量的PBS處理，分為Ctrl shRNA+ox-LDL組、Ctrl shRNA+PBS組、Cav1 shRNA+oxLDL組、Cav1 shRNA+PBS組。分組二：全部細(xì)胞根據(jù)處理方式不同分為無血清對照組（PBS）、oxLDL（60 mg/L）組、oxLDL（60 mg/L）+Ctrl shRNA組、oxLDL（60 mg/L）+Cav1 shRNA、oxLDL+Cav1 shRNA+p38激動劑P79350組。

1.3 細(xì)胞衰老鑒定 衰老細(xì)胞在pH 6.0時有高β-半乳糖苷酶活性，以X半乳糖甘酶（X-Gal）為底物催化下會生成深藍(lán)色產(chǎn)物。按實驗分組處理細(xì)胞后，室溫固定15 min，加入 1mL X-Gal染色工作液，37 ℃無CO2條件下孵育6 h，顯微鏡下觀察每孔標(biāo)本隨機(jī)選取5個視野，細(xì)胞質(zhì)藍(lán)染者為衰老細(xì)胞，計數(shù)衰老細(xì)胞占觀察細(xì)胞總數(shù)的百分比。

1.4 巨噬細(xì)胞遷移能力測定 采用24孔Transwell板（8 μm膜）檢測細(xì)胞遷移能力。細(xì)胞種入24孔Transwell上層小室，將含有10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基加入到下層小室中，放入37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育；待細(xì)胞貼壁后予oxLDL（60 mg/L）處理或加入等量的PBS處理24 h，然后小心吸取上室培養(yǎng)基，將小室取出并擦去未遷移過膜的細(xì)胞。將膜用4%多聚甲醛固定30 min，使用0.1%結(jié)晶紫在室溫染色30 min，然后將小室用PBS洗滌3次，置于光學(xué)顯微鏡下觀察穿膜細(xì)胞。隨機(jī)選取10個視野進(jìn)行計數(shù)，取平均值來評估細(xì)胞遷移能力。

1.5 細(xì)胞MMPs、TF、p38磷酸化蛋白表達(dá)水平檢測 采用Western blotting法。收集各組細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液，提取細(xì)胞蛋白，按照BCA試劑盒說明書操作測定蛋白質(zhì)濃度。按照SDS-PAGE操作說明書配置5%濃縮膠及10%或12%的分離膠進(jìn)行電泳，每孔上樣量30 μg，條件恒壓 80 V 30 min、120 V 70 min，電泳后切取相應(yīng)膠帶進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜前聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜甲醇浸泡15 min，轉(zhuǎn)膜條件為恒流200 mA 2 h，用5%牛奶（TBST配置）封閉6 h后，MMP2、MMP9蛋白（1∶ 1 000稀釋）、TF蛋白（1∶800稀釋）、p38（1∶1000稀釋）4 ℃孵育過夜。經(jīng) TBST洗滌3次，每次 10 min，加入HRP標(biāo)記的特異性二抗以1∶1 500稀釋，室溫下孵育2 h，加入ECL發(fā)光劑，于成像系統(tǒng)中觀察蛋白質(zhì)條帶。以actin為內(nèi)參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達(dá)量。

1.6 細(xì)胞上清液炎癥因子水平檢測 收集各組細(xì)胞上清液，具體步驟均按照ELISA試劑盒說明操作，檢測細(xì)胞上清液中炎癥因子IL-6、IL-8、TNF-α水平，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣本濃度。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 16統(tǒng)計軟件進(jìn)行資料分析。計量資料符合正態(tài)分布以表示，方差齊時多組間比較采用one-way ANOVA檢驗，兩兩比較采用post hoc Tukey檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組巨噬細(xì)胞衰老情況 巨噬細(xì)胞衰老百分比Ctrl shRNA+oxLDL組為（37.63% ± 1.24）%、Ctrl shRNA+PBS組為（6.23% ± 0.98）%，Cav1 shRNA+oxLDL組為（18.01% ± 1.86）%。oxLDL（60mg/L）刺激巨噬細(xì)胞24h 細(xì)胞衰老比例增加，下調(diào)小凹蛋白-1在巨噬細(xì)胞RAW264.7的表達(dá)后，衰老細(xì)胞陽性比例減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)差異（P均<0.05）。

2.2 各組細(xì)胞遷移能力 Ctrl shRNA+oxLDL組、Ctrl shRNA+PBS組、Cav1 shRNA+oxLDL組、Cav1 shRNA+PBS組細(xì)胞遷移個數(shù)分別為（453.7 ±17.64）、（110.82 ± 15.12）、（260.4 ± 14.61）、（120.23 ± 13.98）個。Cav1 shRNA+oxLDL組較Ctrl shRNA+oxLDL組遷移通過聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)減少（P<0.05），提示巨噬細(xì)胞遷移能力被抑制。

2.3 各組細(xì)胞MMPs、TF蛋白表達(dá) ox-LDL可上調(diào)巨噬細(xì)胞RAW264.7衰老相關(guān)表型的表達(dá)，促進(jìn)MMPs、TF的釋放；而病毒感染巨噬細(xì)胞RAW264.7下調(diào)小凹蛋白-1的表達(dá)可減輕上述效應(yīng)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均<0.05）。見表1。

表1 各組細(xì)胞MMP9、MMP2、TF蛋白表達(dá)水平比較（）

表1 各組細(xì)胞MMP9、MMP2、TF蛋白表達(dá)水平比較（）

注：與Ctrl shRNA+PBS組比較，aP <0.05；與Ctrl shRNA+oxLDL組比較，bP <0.05。

組別Ctrl shRNA+PBS組Ctrl shRNA+oxLDL組Cav1 shRNA+PBS組Cav1shRNA+oxLDL組TF 0.497 ± 0.062 1.007 ± 0.075 a 0.598 ± 0.092 0.712 ± 0.027b MMP9 0.522 ± 0.093 1.289 ± 0.157 a 0.675 ± 0.180 0.864 ± 0.165b MMP2 0.832 ± 0.154 1.803 ± 0.253 a 0.779 ± 0.074 1.275 ± 0.115b

2.4 各組細(xì)胞上清液IL-6、IL-8、TNF-α水平 ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞衰老后，上清液中IL-6、IL-8、TNF-α水平升高，而病毒感染巨噬細(xì)胞RAW264.7下調(diào)小凹蛋白-1的表達(dá)后，上清液中IL-6、IL-8、TNF-α水平下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均<0.05）。見表2。

表2 各組細(xì)胞上清液中IL-6、IL-8、TNF-α水平比較（pg/mL，）

表2 各組細(xì)胞上清液中IL-6、IL-8、TNF-α水平比較（pg/mL，）

注：與Ctrl shRNA+PBS組比較，aP <0.05；與Ctrl shRNA+oxLDL組比較，bP <0.05。

組別Ctrl shRNA+PBS組CtrlshRNA+oxLDL組Cav1 shRNA+PBS組Cav1shRNA+oxLD組TNF-α 18.32 ± 0.39 87.30 ± 0.51a 20.33 ± 0.15 21.03 ± 0.23b IL-6 98.76 ± 2.54 198.79 ± 10.17a 102.04 ± 2.39 147.10 ± 12.62b IL-8 96.34 ± 4.85 167.30 ± 9.23 a 98.20 ± 7.32 123.98 ± 5.78b

2.5 各組p38磷酸化蛋白表達(dá) 無血清對照組（PBS）、oxLDL（60 mg/L）組、oxLDL（60 mg/L）+Ctrl shRNA組、oxLDL（60 mg/L）+ Cav1 shRNA、oxLDL+Cav1 shRNA+p38激動劑P79350組p38磷酸化蛋白表達(dá)分別為0.492 ± 0.021、1.479 ± 0.132、1.516 ±0.149、0.785 ± 0.086、1.403 ± 0.207。oxLDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7衰老后，p38磷酸化蛋白增加，p38MAPK 信號通路被激活；而感染病毒下調(diào)RAW264.7細(xì)胞中小凹蛋白-1的表達(dá)后，p38磷酸化蛋白水平降低；用p38特異性激動劑P79350處理可以逆轉(zhuǎn)下調(diào)小凹蛋白-1后衰老相關(guān)分泌表型減少這一效應(yīng)。組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均<0.05）。提示小凹蛋白-1可能通過p38 MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控oxLDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞衰老相關(guān)分泌表型的表達(dá)。

3 討論

巨噬細(xì)胞是AS的主要參與者。衰老的巨噬細(xì)胞可能通過損害膽固醇流出和促進(jìn)炎癥反應(yīng)來影響AS的發(fā)展［6］。上述研究提示巨噬細(xì)胞衰老可能參與年齡相關(guān)的AS斑塊穩(wěn)定性，但具體機(jī)制尚不明確。小凹蛋白-1作為小凹的標(biāo)志性結(jié)構(gòu)蛋白，在血管細(xì)胞中廣泛表達(dá)，是許多信號分子的支架蛋白和負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白，如促分裂原活化蛋白激酶（MAPK），與AS發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［7］。既往研究發(fā)現(xiàn)，在基因敲除小凹蛋白-1缺乏的小鼠中，主動脈壁中的低密度脂蛋白浸潤減少，可以逆轉(zhuǎn)AS過程［8］。而另有研究證實，基因敲除小凹蛋白-1缺乏的小鼠平滑肌細(xì)胞的增殖及遷移增強，促進(jìn)新生內(nèi)膜的增生，促進(jìn)AS病變形成［9］。因此，小凹蛋白-1在AS中的作用尚不明確。既往多項研究證實，小凹蛋白-1與衰老密切相關(guān)。我們的前期研究結(jié)果亦顯示，下調(diào)小凹蛋白-1在巨噬細(xì)胞的表達(dá)，可以減少NADPH NOX 2亞型中p47phox調(diào)節(jié)亞基和細(xì)胞膜的結(jié)合，阻礙NOX2亞型作用的發(fā)揮，減少ROS產(chǎn)生，延緩細(xì)胞衰老。本研究顯示，下調(diào)小凹蛋白-1的表達(dá)可以減少巨噬細(xì)胞衰老，與前期結(jié)果一致。

血管壁中的衰老細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子、趨化因子、細(xì)胞基質(zhì)蛋白酶、生長因子等細(xì)胞衰老相關(guān)分泌表型可發(fā)揮多種促AS的作用，如血管重塑、斑塊形成和破裂。有證據(jù)表明，斑塊豐富的動脈含有各種典型的SASP成分，包括基質(zhì)金屬蛋白酶和多種炎癥因子。有研究發(fā)現(xiàn)，具有衰老標(biāo)志物的泡沫巨噬細(xì)胞與炎性細(xì)胞因子、趨化因子和金屬蛋白酶共存，通過SASP發(fā)揮致AS作用［10-11］。其中，巨噬細(xì)胞的浸潤和巨噬細(xì)胞MMPs的釋放與AS不穩(wěn)定性有關(guān)［12］。本研究為了檢測小凹蛋白-1表達(dá)對ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞衰老后炎癥因子的影響，通過檢測細(xì)胞MMP2、MMP9、TF蛋白表達(dá)以及細(xì)胞上清液中IL-6、IL-8、TNF-α水平，發(fā)現(xiàn) ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞衰老可上調(diào)SASP的表達(dá)，促進(jìn)MMPs釋放，巨噬細(xì)胞遷移能力增加；而采用病毒感染技術(shù)特異性下調(diào)小凹蛋白-1的表達(dá)后，細(xì)胞遷移能力減弱，炎癥介質(zhì)分泌減少。既往研究證實，MMPs是調(diào)控細(xì)胞遷移的關(guān)鍵酶［12］， MMPs表達(dá)受MAPK信號通路的調(diào)控［13］。小凹蛋白-1是否參與MAPKp38信號通路調(diào)控MMPs等衰老相關(guān)表型的表達(dá)目前尚不清楚。為了研究小凹蛋白-1與p38MAPK通路在這一過程中關(guān)系，在特異性下調(diào)小凹蛋白-1表達(dá)后，使用p38特異性激動劑P79350激活p38的磷酸化蛋白水平，可以逆轉(zhuǎn)下調(diào)小凹蛋白-1后衰老相關(guān)分泌表型的減少這一效應(yīng)。因此，結(jié)合本研究結(jié)果推測，下調(diào)小凹蛋白-1的表達(dá)可能抑制oxLDL激活的MAPK信號通路，進(jìn)而下調(diào)MMPs的表達(dá)，影響衰老巨噬細(xì)胞的遷移。因此，oxLDL可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞衰老，使p38MAPK活性增強，細(xì)胞遷移能力增加，促進(jìn)MMPs、TF、IL-8、IL-6等炎癥因子表達(dá)，而小凹蛋白-1在上述過程中起了重要的作用。

綜上，SASP作為細(xì)胞衰老的重要標(biāo)志，與細(xì)胞衰老及AS相關(guān)，小凹蛋白-1在oxLDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞SASP過程中起著重要的作用。下調(diào)小凹蛋白-1在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)，可以延緩細(xì)胞衰老，抑制p38MAPK活化及巨噬細(xì)胞SASP釋放，減弱巨噬細(xì)胞遷移能力，有望成為年齡相關(guān)性AS防治的新靶點。