黃梁木精油活性成分測定及其對全株玉米青貯有氧穩(wěn)定的影響

楊 丹, 吳 碩, 陳丹丹, 張 慶

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院, 廣東木本飼料工程技術(shù)研究中心, 廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點實驗室, 廣東 廣州 510642)

全株玉米(Zeamays)是一種重要的青貯飼料原料,擁有較高的營養(yǎng)價值,良好的適口性和消化率[1]。全株玉米青貯是反芻動物養(yǎng)殖過程中消耗最多的飼草產(chǎn)品,在畜牧養(yǎng)殖中占有重要地位[2]。然而,全株玉米青貯打開使用時極易發(fā)生有氧變敗,造成大量干物質(zhì)損失,甚至產(chǎn)生真菌毒素,滋生致病菌,導(dǎo)致動物的發(fā)病甚至死亡。我國全株玉米青貯管理水平低,極易面臨有氧變敗的問題[3]。

植物精油是在植物中提取的揮發(fā)性次生代謝產(chǎn)物,因其抗氧化、抑菌消炎、預(yù)防疾病、促進動物生長,防止飼料霉變等功效,在畜牧生產(chǎn)應(yīng)用廣泛[4-5]。植物精油在食品加工中常被用做天然防腐劑,能夠?qū)χ虏⌒源竽c桿菌和金黃色葡萄球菌等食源性致病菌起抑制作用[6]。同時,添加桉葉精油和迷迭香精油可以降低柱花草青貯pH值,抑制大腸桿菌,提高乳酸含量和蛋白質(zhì)保存,顯著改善了青貯飼料品質(zhì)[7]。添加山蒼子精油可以抑制霉菌,減緩青貯玉米中粗蛋白質(zhì)和氨基酸的損失[8]。植物精油抑菌效果良好,特別是對引起青貯有氧變敗的酵母菌和霉菌等真菌有良好的抑制作用,在提高全株玉米青貯有氧穩(wěn)定有潛在的應(yīng)用價值[9]。

黃梁木(Neolamarckiacadamba)是一種起源于熱帶和亞熱帶的常綠闊葉喬木,含有豐富的生物活性成分如黃酮、酚類、生物堿、萜類、皂苷、多糖及單寧等,具有抗菌消炎、降血糖、抗腹瀉、抗氧化及抗癌等功效,用途極為廣泛[10-11]。近年來,因其生長速度快,葉片蛋白質(zhì)含量高,且富含多種活性成分被廣泛用做木本飼料[12-13]。黃梁木葉自然青貯品質(zhì)pH值可達3.86～4.02,能夠有效抑制不良微生物,作為添加劑可以降低苜蓿、柱花草和全株玉米青貯中不良微生物的含量,提高青貯后牧草中蛋白質(zhì)的保存率[14]。

目前,大多數(shù)研究都集中黃梁木提取物的生物活性,據(jù)其他學(xué)者的研究報道[15],推測黃梁木中可能含有揮發(fā)性抑菌活性成分,能夠影響青貯中有氧穩(wěn)定,但關(guān)于黃梁木中揮發(fā)性活性成分的研究還較少。因此,本研究采用水蒸氣蒸餾法在黃梁木鮮葉中提取黃梁木精油,并通過氣相-質(zhì)譜聯(lián)用探究黃梁木精油主要成分及對全株玉米青貯有氧穩(wěn)定性的影響,為促進黃梁木在畜牧業(yè)中的應(yīng)用,減少飼料損失和提高全株玉米有氧穩(wěn)定性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及精油制備

本試驗所選用的華美糯玉米和黃梁木種植于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)啟林北試驗田。黃梁木精油以黃梁木葉片為原料,采用水蒸氣蒸餾法提取。黃梁木葉片冷凍粉碎后置于圓底燒瓶中,加入蒸餾水,蒸餾提取至無油狀物餾出為止(料液比1∶2,提取時長約3 h)。將蒸餾出的黃梁木精油以每分鐘6 000轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速離心10 min,除去上層蒸餾水,并用足量的無水Na2SO4干燥后置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗設(shè)計

本試驗于2022年6月乳熟期人工收割華美糯玉米,用粉碎機將采集材料粉碎成1～2 cm的小段,混合均勻后取1 kg全株玉米裝入青貯袋并用真空封口機密封。青貯70天后按照0.625(N1),1.25(N2),2.5(N4)和3.75(N6)mL·kg-1比例添加黃梁木精油,并設(shè)立空白對照組(CK)。不同處理組樣品混合均勻后裝入塑料桶,用一層聚乙烯塑料薄膜覆蓋桶,扎出氣孔,一共5個處理組,每組3個重復(fù),在室溫保存。在有氧暴露第0天和第7天對青貯飼料進行發(fā)酵特性、化學(xué)成分和有氧穩(wěn)定性分析。

1.3 測定指標

1.3.1有氧穩(wěn)定性測定 用溫度記錄儀(SMOWO MDL-1048A,上海天賀自動化儀表有限公司)監(jiān)測塑料桶樣品中心內(nèi)的溫度和環(huán)境溫度,設(shè)定每隔10 min記錄一次溫度。有氧穩(wěn)定性是指青貯溫度不高于環(huán)境溫度2℃的保存時間。

1.3.2微生物數(shù)量測定 根據(jù)Wang等[16]所述,分別在有氧暴露的第0天和第7天測定了青貯樣品的發(fā)酵特性和化學(xué)成分。將10 g的鮮樣加入90 mL無菌生理鹽水,搖晃混勻,將上清液從10-1梯度逐層稀釋至10-6倍,用平板計數(shù)法測定乳酸菌、大腸桿菌和酵母菌的數(shù)量。

1.3.3pH值及化學(xué)成分測定 取10 g鮮樣加入90 mL純水于4℃冰箱充分浸泡,24 h后取出用定性濾紙過濾,使用雷磁PHS-3C型pH計(上海市精密科學(xué)儀器有限公司)測定濾液pH值。采用蒽酮比色法測定可溶性碳水化合物含量[17]。取適量樣品,稱重記錄,置于65℃恒溫干燥箱烘干48 h,計算樣品烘干后的重量與烘干前的重量的百分比就是干物質(zhì)含量。稱取烘干后粉碎的樣品0.5 g,加入適量催化劑(硫酸銅與硫酸鉀按1∶5的比例配置)和濃硫酸于420℃消煮2 h,消煮完畢使用全自動凱氏定氮儀測定粗蛋白質(zhì)含量(Kjeltec8400,美國FOSS)。使用纖維分析儀(2000,英國Ringbio)分析中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量[18]。

1.3.4黃梁木精油成分分析 采用氣相-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)分析黃梁木精油的主要成分。從-80℃冰箱中取出樣品進行液氮研磨,渦旋混合均勻,每個樣本稱取約1 mL于頂空瓶中,加入飽和NaCl溶液和10 μL(50 μg·mL-1)內(nèi)標溶液,全自動頂空固相微萃取HS-SPME進行樣本萃取,以供GC-MS分析。HS-SPME萃取條件:在60℃恒溫條件下,震蕩5 min,120 μm DVB/CWR/PDMS萃取頭插入樣品頂空瓶,頂空萃取15 min,于250℃下解析5 min,然后進行GC-MS分離鑒定。色譜條件:DB-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm,Agilent J&W Scientific,Folsom,CA,USA),載氣為高純氦氣(純度不小于99.999%),恒流流速每分鐘1.2 mL,進樣口溫度250℃,不分流進樣,溶劑延遲3.5 min。程序升溫:40℃保持3.5 min,以每分鐘10℃升至100℃,再以每分鐘7℃升至180℃,最后以每分鐘25℃升至280℃,保持5 min。質(zhì)譜條件:電子轟擊離子源(EI),離子源溫度230℃,四級桿溫度150℃,質(zhì)譜接口溫度280℃,電子能量70 eV,掃描方式為選擇離子檢測模式(SIM),定性定量離子精準掃描(GB 23200.8-2016)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用Excel 2016對數(shù)據(jù)進行處理,SPSS 23.0對整理好的數(shù)據(jù)進行單因素方差分析,使用鄧肯極差法對各個樣本均值之間的差異多重比較,P<0.05為差異顯著。使用GraphPad Prism 8、Adobe Illustrator CC2018進行繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃梁木精油的主要成分

通過水蒸氣蒸餾法提取的黃梁木精油是一種淡黃色透明油狀液體,密度(1.19 g·mL-1)高于水。黃梁木精油經(jīng)GC-MS檢測的總離子流圖如圖1所示,一共分離鑒定出977種代謝物。主要化學(xué)成分名稱、相對含量和分類見表1和圖3。黃梁木精油成分復(fù)雜,含有多種化合物,其中種類較豐富的有萜類219種(22.4%),酯類156種(16.0%),酮98種(10.0%),醇97種(9.9%),雜環(huán)化合物97種(9.9%),醛76種(7.7%),烴類75種(7.6%)和芳烴類74種(7.5%)。相對含量較高的化學(xué)成分是1,5-二甲基-2,6-雙(亞甲基)-環(huán)辛烷(34.15%),N-苯基-甲酰胺(23.20%),甲酸芳樟酯(12.09%),(1α,4α,4aα,5aα)-4,4a,5,5a-四氫-6,6-二甲基-1,4-甲基-1H-環(huán)丙[d]噠嗪(7.09%),1-甲基-4-硝基-苯(2.32%),4-甲基-苯甲酸(2.19%),L-香30芹醇(1.98%)和5-甲基-2-(1-甲基亞乙基)-環(huán)己酮(1.32%)。

表1 黃梁木精油的主要成分名稱和相對含量

表3 青貯原料特征

圖1 黃梁木精油總離子流圖

圖2 黃梁木精油主要物質(zhì)種類占比扇形圖

圖3 不同處理全株玉米青貯有氧暴露期間溫度變化圖

2.2 青貯原料的特點

全株玉米新鮮原料的干物質(zhì)含量為20.09% DM,粗蛋白質(zhì)含量為9.79% DM。中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維和可溶性碳水化合物含量分別為50.25% DM,22.71% DM和17.54% DM。微生物乳酸菌、酵母菌、霉菌和大腸桿菌分別為6.49,4.63,3.59和7.32 lg cfu·g-1FM。

2.3 全株玉米青貯添加黃梁木精油的有氧穩(wěn)定性

由圖3和圖4可知,黃梁木精油可以提高全株玉米青貯有氧穩(wěn)定性,CK組全株玉米青貯有氧穩(wěn)定性為46.17 h,N1和N2組的有氧穩(wěn)定性分別為52.17 h和82.5 h。當黃梁木添加量為N4(2.5 mL·kg-1)和N6(3.75 mL·kg-1)時,全株玉米青貯在有氧暴露7天之內(nèi)均比較穩(wěn)定,N4處理組的全株玉米青貯在有氧暴露84 h后溫度略有升高但低于室溫2℃,而N6處理組的全株玉米青貯有氧暴露7天內(nèi)溫度保持和室溫一致。在全株玉米青貯中添加2.5 mL·kg-1的黃梁木精油即可保持青貯飼料的有氧穩(wěn)定性。

圖4 不同處理全株玉米青貯有氧穩(wěn)定

2.4 有氧暴露后全株玉米青貯的發(fā)酵品質(zhì)和化學(xué)成分

有氧暴露對全株玉米青貯干物質(zhì)含量、pH值、乳酸菌數(shù)量和酵母菌數(shù)量均有顯著影響(P<0.05)(表4)。CK組在有氧暴露7天后干物質(zhì)含量顯著降低(P<0.05),從22.24%下降到16.34%。pH值和微生物數(shù)量均顯著上升(P<0.05)。隨著黃梁木精油添加比例的增加,全株玉米青貯的干物質(zhì)含量顯著升高(P<0.05),pH值、乳酸菌數(shù)量和酵母菌數(shù)量顯著降低(P<0.05)。其中,N4處理的干物質(zhì)、pH值和乳酸菌數(shù)量與CK組無明顯變化,N6處理組的能夠降低全株玉米青貯pH值,達到最低值,為3.88。精油添加組中的大腸桿菌和霉菌數(shù)量除N1處理組以外,其他組均未被檢測到。

表4 全株玉米青貯有氧暴露后發(fā)酵參數(shù)和微生物數(shù)量

有氧暴露對全株玉米青貯中的蛋白組分和纖維產(chǎn)生顯著的影響(表5)。CK組在有氧暴露7天后粗蛋白質(zhì)含量從9.40%到12.48%,中性洗滌纖維含量從49.18%到61.58%,酸性洗滌纖維含量從21.77%到30.97%,均顯著上升(P<0.05)。添加黃梁木精油后,N1,N2,N4組的粗蛋白質(zhì)、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量均顯著降低(P<0.05)。當黃梁木添加量為N4(2.5 mL·kg-1)和N6(3.75 mL·kg-1)時,飼料中的粗蛋白質(zhì)、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量與有氧暴露第0天無顯著變化。

表5 全株玉米青貯有氧暴露后的營養(yǎng)品質(zhì)

3 討論

3.1 黃梁木精油的成分

黃梁木精油成分復(fù)雜,含有多種代謝物。大多數(shù)植物精油的成分以萜烯類化合物、芳香族化合物和脂肪族化合物等成分為主[19]。黃梁木精油含有相對含量較高的烴類、芳烴和酯類等物質(zhì)。另外,黃梁木精油還含有種類較豐富的雜環(huán)化合物,彭莘媚等[20]發(fā)現(xiàn)香豆素雜環(huán)化合物具有廣泛的生物活性,其結(jié)構(gòu)中的香豆素環(huán)和噻唑環(huán)對抗真菌活性起促進作用。因此,本研究中相對含量較高的雜環(huán)化合物可能是黃梁木精油抑菌效果良好的原因之一。Das等[21]發(fā)現(xiàn),芹菜精油中含量最高的單體化合物乙酸芳樟酯對真菌具有較好的抑菌效果,僅5.5 μL·mL-1的乙酸芳樟酯就能抑制黃曲霉合成黃曲霉毒素。因此,黃梁木精油主要成分之一的甲酸芳樟酯可能對真菌具有較好的抑制效果。將黃梁木精油用于提高全株玉米青貯有氧穩(wěn)定可能是一條有效的途徑。

3.2 青貯前全株玉米鮮料的化學(xué)特性和微生物數(shù)量

本研究中,全株玉米的DM含量低于已有研究測定的玉米值(DM:27.2%)[22],DM和WSC含量對于青貯至關(guān)重要,為乳酸菌提供足夠的發(fā)酵底物[23]。據(jù)Bai等[24]通過對比兩種不同水分水平的玉米植株,發(fā)現(xiàn)高含水量的全株玉米青貯飼料比低水分的全株玉米青貯飼料表現(xiàn)出更高的有氧穩(wěn)定性。另外,微生物數(shù)量是決定青貯發(fā)酵的因素之一,全株玉米的乳酸菌數(shù)量已達到良好青貯飼料標準(>5.0 lg cfu·g-1FM)可以進行大量的乳酸發(fā)酵[26]。但酵母菌和大腸桿菌的數(shù)量與乳酸菌差異變化不顯著,可能會影響乳酸菌發(fā)酵,產(chǎn)生有害物質(zhì),造成蛋白質(zhì)損失,降低青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)[15]。

3.3 黃梁木精油對全株玉米青貯有氧穩(wěn)定性的影響

有氧穩(wěn)定性是評價青貯飼料品質(zhì)的一個重要指標,由于青貯飼料有氧暴露是無法避免的,往往會導(dǎo)致飼料的營養(yǎng)成分流失、毒素積累,而較高的有氧穩(wěn)定性可以使青貯保持優(yōu)良的適口性,營養(yǎng)物質(zhì)不易被降解[25]。當好氧真菌暴露在空氣中大量繁殖生長,乳酸和可溶性碳水化合物等營養(yǎng)物質(zhì)被消耗,代謝產(chǎn)熱,從而青貯飼料的pH值和溫度逐漸上升。隨著有氧暴露時間延長,青貯溫度在好氧真菌旺盛生長期間達到峰值,添加黃梁木精油后顯著降低了全株玉米青貯飼料的最高溫度[27]。N4處理組的全株玉米青貯在有氧暴露84 h后溫度略有升高但低于室溫2℃,而N6處理組的全株玉米青貯有氧暴露7天內(nèi)溫度保持和室溫一致。這可能是有氧暴露7天后,添加黃梁木精油顯著降低了酵母菌數(shù)量,抑制好氧真菌生長。當添加2.5 mL·kg-1的黃梁木精油時即可以有效提高全株玉米青貯有氧穩(wěn)定性。

3.4 有氧暴露階段黃梁木精油對全株玉米青貯品質(zhì)的影響

黃梁木精油可以提高華美糯全株玉米青貯有氧穩(wěn)定性,抑制酵母菌、霉菌等不良微生物的生長,避免干物質(zhì)的降解[28]。本研究中,添加黃梁木精油很好的抑制了大腸桿菌和霉菌的生長。N2、N4和N6處理的大腸桿菌和霉菌均低于檢測值。表明黃梁木精油中的一些活性成分抑菌作用明顯,抑制了不良微生物的活性,并且精油添加量越高,抑菌作用更顯著。華美糯全株玉米青貯有氧暴露以后,干物質(zhì)中纖維含量顯著升高。纖維含量是評價青貯飼料的一個重要指標,飼料中高含量的粗纖維會降低動物的采食量和干物質(zhì)消化率,甚至?xí)档蜕a(chǎn)性能[29]。本試驗中,全株玉米青貯的粗蛋白質(zhì)、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量在有氧暴露階段顯著上升,這可能很大程度上受酵母菌影響。在有氧暴露期間,酵母菌等好氧微生物消耗了青貯中可溶性碳水化合物、維生素等營養(yǎng)物質(zhì),造成有氧變質(zhì),導(dǎo)致纖維、粗蛋白在干物質(zhì)中的含量相對上升,纖維含量的升高也表明青貯品質(zhì)的下降[30-31]。在全株玉米中添加黃梁木精油可以抑制不良微生物的活性,減少營養(yǎng)物質(zhì)的損失[32]。

4 結(jié)論

黃梁木精油成分復(fù)雜,含有多種代謝物,其中種類較豐富的有萜類(219種)、酯類(156種)和酮(98種),相對含量最高的化合物是1,5-二甲基-2,6-雙(亞甲基)-環(huán)辛烷(34.15%)。有氧暴露7天后,添加黃梁木精油可以抑制大腸桿菌、霉菌和酵母菌等不良微生物的活性,減少營養(yǎng)物質(zhì)的損失,對青貯飼料的有氧穩(wěn)定具有改善作用。不同添加量的黃梁木精油均可以提高全株玉米(華美糯)青貯的有氧穩(wěn)定性,當黃梁木精油的添加量為2.5 mL·kg-1即可保持全株玉米青貯有氧穩(wěn)定性。