基于網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接技術(shù)探討解痙散瘀湯治療肩袖損傷的作用機制▲

林澤宏 周紅海 魏紀湖 羅 灝 柒萬強 唐 俊

(廣西中醫(yī)藥大學1 研究生院,2 骨傷學院,廣西南寧市 530001)

肩袖損傷是常見的肩關(guān)節(jié)疾病,以肩部疼痛、活動障礙為主要癥狀,其在全部肩關(guān)節(jié)疾病中的占比為5%～40%,且在臨床上30%～70%的肩關(guān)節(jié)疼痛與肩袖損傷有關(guān)[1]。肩袖損傷的患病風險與年齡呈正相關(guān),60～69 歲人群的患病率可達 31%,而 80 歲以上人群的患病率預(yù)計可達 65%[2]。近年來,隨著我國社會人口老齡化加劇,我國的肩袖損傷患病率也在逐年增加,這加大了社會和個人的經(jīng)濟壓力。目前除手術(shù)治療外,中醫(yī)藥療法在肩袖損傷的保守治療中占有重要地位[3]。如何緩解肩袖損傷患者的疼痛,改善關(guān)節(jié)活動度,減少肩袖軟組織變性,防止肌腱進一步撕裂,是肩袖損傷保守治療的臨床和科研熱點。因此,探索一種安全、有效的中藥方劑對于肩袖損傷的保守治療具有重要意義。

中醫(yī)中并無“肩袖損傷”的直接記載,但根據(jù)綜合臨床表現(xiàn)和病因病機,應(yīng)將其歸屬于中醫(yī)“痹癥”中的“肩痹”范疇。解痙散瘀湯是我國國醫(yī)大師韋貴康教授運用“活血通經(jīng),解痙散瘀”之法治療頸肩痹痛的良方,臨床研究表明,該方對肩痹有明確的療效[4],但目前其治療肩袖損傷的作用機制還不明確。而中藥復(fù)方的作用機制具有多成分、多靶點的特點,故本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學及分子對接技術(shù),探討解痙散瘀湯治療肩袖損傷的潛在機制,以期為肩袖損傷保守治療的臨床用藥及研究提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 活性成分及其作用靶點的篩選 (1)通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP;https://old.tcmsp-e.com/index.php)獲取白芍、赤芍、當歸、丹參、甘草、兩面針、牛膝、桃仁、豨薟草的所有活性成分,然后設(shè)置口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%且類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18初步篩選主要活性成分,再通過TCMSP進一步檢索主要活性成分的作用靶點。(2)通過中國知網(wǎng)(https://www.cnki.net/)檢索有關(guān)地龍活性成分研究的文獻[5-7],收集地龍的活性成分,通過ChemDraw軟件繪制活性成分的分子結(jié)構(gòu)并保存為.sdf格式。將.sdf格式文件上傳SwissADME平臺(http://www.swissadme.ch/)篩選主要活性成分,篩選條件為“Pharmacokinetics”項的“GI absorption”結(jié)果為“High”,且“Druglikeness項”的5種預(yù)測(Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge)結(jié)果中有2個及2個以上為“Yes”。將地龍主要活性成分的.sdf格式文件上傳至SwissTargetPrediction平臺(http://swisstargetprediction.ch/),設(shè)置物種為“Homo Sapiens”且probability>0,對主要活性成分的作用靶點進行預(yù)測。(3)使用R語言將獲得的所有靶點進行合并去重,然后通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)將靶點名轉(zhuǎn)換為規(guī)范的基因名稱[8]。

1.2 解痙散瘀湯治療肩袖損傷潛在作用靶點的篩選 使用“Rotator Cuff Tears”作為檢索詞,在GeneCards?數(shù)據(jù)庫[9](www.genecards.org)和OMIM?數(shù)據(jù)庫(https://www.omim.org)中檢索肩袖損傷的相關(guān)靶點,將兩個數(shù)據(jù)庫的結(jié)果進行合并去重。通過VENNY 2.1平臺(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)將解痙散瘀湯主要活性成分的作用靶點與肩袖損傷的相關(guān)靶點進行映射取交集,得到解痙散瘀湯治療肩袖損傷的潛在作用靶點。

1.3 構(gòu)建成分-靶點網(wǎng)絡(luò) 使用Cytoscape 3.9.1軟件,對主要活性成分及解痙散瘀湯治療肩袖損傷的潛在作用靶點進行分析并構(gòu)建成分-靶點網(wǎng)絡(luò)。通過Cytoscape 3.9.1軟件的Network Analyzer插件分析成分-靶點網(wǎng)絡(luò)的拓撲參數(shù),根據(jù)節(jié)點連接度由大到小進行排序,將連接度位居前5的主要活性成分作為解痙散瘀湯治療肩袖損傷的關(guān)鍵活性成分。

1.4 構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò) 將解痙散瘀湯治療肩袖損傷的潛在作用靶點導入STRING 11.5 平臺(https://string-db.org),設(shè)定物種為“Homo sapiens”,可信度為0.4,剩余參數(shù)均為默認值,最終獲得解痙散瘀湯治療肩袖損傷的蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò),將數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.9.1軟件的cytoNCA插件,分析中介中心性、接近中心性、度中心性、特征向量中心性、局部平均連接中心性及網(wǎng)絡(luò)中心性共6個參數(shù)進行2次篩選,最終以度中心性值大于中位值的靶點作為核心靶點。

1.5 功能富集分析和通路富集分析 將解痙散瘀湯治療肩袖損傷的潛在作用靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp),設(shè)置物種為“Homo Sapiens”,進行基因本體論(Gene Ontology,GO)功能富集分析及京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,以P<0.05作為篩選標準[10]。將分析結(jié)果導入微生信平臺(http://www.bioinformatics.com.cn/)進行可視化處理。

1.6 關(guān)鍵活性成分與核心靶點蛋白的分子對接 首先,通過PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取關(guān)鍵活性成分的2D結(jié)構(gòu),采用ChemOffice軟件對其進行優(yōu)化并制作其3D結(jié)構(gòu)。然后,通過RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.pdbus.org/)獲取核心靶點蛋白的3D結(jié)構(gòu),并通過PyMol軟件對其進行去水、去小分子配體等優(yōu)化。最后,通過AutoDock 1.5.6軟件實現(xiàn)關(guān)鍵活性成分與核心靶點蛋白的分子對接,以結(jié)合能大小判定分子對接是否成功,結(jié)合能≤0 kcal/mol表明配體與受體可以自發(fā)結(jié)合,一般來說分子間的結(jié)合能越低,則發(fā)生作用的概率越大,結(jié)合越穩(wěn)定。

2 結(jié) 果

2.1 解痙散瘀湯的主要活性成分及其作用靶點 通過TCMSP共獲得主要活性成分273個及其作用靶點270個,其中白芍、赤芍、當歸、丹參、甘草、兩面針、牛膝、桃仁、豨薟草的主要活性成分分別有13個、29個、2個、65個、92個、20個、20個、23個、9個。通過SwissADME平臺獲得地龍的主要活性成分47個及其作用靶點679個。合并去重后,共獲得解痙散瘀湯的主要活性成分291種、作用靶點835個。

2.2 解痙散瘀湯治療肩袖損傷的潛在作用靶點 經(jīng)合并去重后,從GeneCards?數(shù)據(jù)庫和OMIM?數(shù)據(jù)庫共獲得肩袖損傷相關(guān)靶點357個。通過VENNY 2.1平臺將肩袖損傷的相關(guān)靶點與解痙散瘀湯主要活性成分的作用靶點取交集,共獲得解痙散瘀湯治療肩袖損傷的潛在作用靶點95個。

2.3 成分-靶點網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵活性成分篩選結(jié)果 將主要活性成分與解痙散瘀湯治療肩袖損傷的潛在作用靶點導入Cytoscape 3.9.1軟件,構(gòu)建得到的成分-靶點網(wǎng)絡(luò)包含節(jié)點237個、連線729條,見圖1。在網(wǎng)絡(luò)中,連接度位居前5的主要活性成分依次為槲皮素、環(huán)(L-脯氨酸-L-苯丙氨酸)二肽、木犀草素、L-脯氨酰-L-亮氨酰-L-亮氨酰甘氨酸、山柰酚,即關(guān)鍵活性成分。關(guān)鍵活性成分的基本信息見表1。

表1 關(guān)鍵活性成分的基本信息

圖1 成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)及核心靶點篩選結(jié)果 通過STRING 11.5平臺對解痙散瘀湯治療肩袖損傷的95個潛在作用靶點進行分析,剔除獨立靶點,得到PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù),然后將數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.9.1軟件進行拓撲分析和可視化,見圖2。拓撲分析結(jié)果顯示,白細胞介素(interleukin,IL)-1B、絲氨酸/蘇氨酸激酶1(serine/threonine kinase 1,AKT1)、血管內(nèi)皮生長因子 A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)9、纖維連接蛋白(fibronectin,FN)1為網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點。

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO功能富集分析結(jié)果 對解痙散瘀湯治療肩袖損傷的95個潛在作用靶點進行GO功能富集分析,共獲得736個條目,包括566個生物過程,60個細胞組分,110個分子功能。以-lgP值進行由大到小排序選出前10個條目進行可視化,見圖3。

圖3 GO富集分析結(jié)果的可視化圖

2.6 KEGG通路富集分析結(jié)果 對解痙散瘀湯治療肩袖損傷的95個潛在作用靶點進行KEGG通路富集分析,共獲得142條通路,潛在作用靶點主要涉及晚期糖基化終末產(chǎn)物-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體信號通路、缺氧誘導因子1信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、IL-17信號通路等信號通路。以-lgP值進行由大到小排序。將前15條通路制作成氣泡圖,見圖4。

圖4 KEGG通路富集分析的可視化圖

2.7 分子對接分析結(jié)果 所有關(guān)鍵活性成分和核心靶點蛋白對接的結(jié)合能均≤0 kcal/mol,表明解痙散瘀湯治療肩袖損傷的關(guān)鍵活性成分和核心靶點均具有較好的結(jié)合活性,見表2。選取部分分子對接結(jié)果進行展示,見圖5。

圖5 部分分子對接結(jié)果的可視化圖

3 討 論

肩袖損傷在中醫(yī)學中屬于“痹癥”中的“肩痹”范疇,臨床上常以“肩痹”治法治之。解痙散瘀湯為國醫(yī)大師韋貴康教授為肩部病痛所創(chuàng)良方,有活血通經(jīng)、解痙散瘀的功效,可使經(jīng)脈通、氣血順,損傷之筋脈得以濡養(yǎng),脈通筋柔,痹痛得消,臨床療效頗佳[4]。方中以丹參為君藥,丹參可調(diào)和氣血,行而不破,散中有收;當歸、桃仁、赤芍通行三焦,行血散瘀;白芍、甘草、牛膝、地龍緩急解痙止痛,再配以兩面針、豨薟草消腫止痛,共奏活血散瘀、解痙止痛之功。

本研究通過構(gòu)建成分-靶點網(wǎng)絡(luò),獲得5個關(guān)鍵活性成分,包括槲皮素、木犀草素、環(huán)(L-脯氨酸-L-苯丙氨酸)二肽、L-脯氨酰-L-亮氨酰-L-亮氨酰甘氨酸、山柰酚。肩袖組織發(fā)生急性損傷或是受到長期反復(fù)的機械性損傷時,損傷組織局部存在不同程度的炎癥反應(yīng),而持續(xù)、過度的炎癥反應(yīng)會加重患者的疼痛感,以及影響肩袖組織的修復(fù)[11]。槲皮素通過提高超氧化物歧化酶和MMP抑制劑的水平,以及降低腫瘤壞死因子α、IL-1B、MMP的水平,來抑制炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng),延緩蛋白聚糖的降解,從而促進肩袖損傷后軟組織的修復(fù)[12-13]。木犀草素通過核轉(zhuǎn)錄因子κB通路,減少IL-1B、腫瘤壞死因子α等炎癥因子的分泌,減輕損傷組織的局部炎癥反應(yīng)[14]。山柰酚能通過核轉(zhuǎn)錄因子κB信號通路和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路,降低誘導型一氧化氮合成酶、腫瘤壞死因子α等促炎性細胞因子的表達水平,發(fā)揮抗炎、鎮(zhèn)痛的作用[15-16]。環(huán)(L-苯丙氨酸-L-脯氨酸)二肽、L-脯氨酰-L-亮氨酰-L-亮氨酰甘氨酸是存在于地龍的生物類小分子多肽,具有良好的消炎、鎮(zhèn)痛效果[17]。上述關(guān)鍵活性成分的藥理作用表明解痙散瘀湯可提升人體抗氧化能力,減輕炎癥反應(yīng),從而緩解肩袖損傷患者的疼痛。

本研究PPI網(wǎng)絡(luò)拓撲分析結(jié)果顯示,IL-1B、AKT1、VEGFA、MMP9、FN1為解痙散瘀湯治療肩袖損傷的核心靶點。肩袖組織損傷后,局部釋放大量細胞因子,激活多種生物信號通路,形成復(fù)雜的靶點-通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò),在肩袖損傷的炎癥期、愈合期和重塑期發(fā)揮重要作用[18]。在軟組織損傷早期,毛細血管破裂和細胞內(nèi)液滲透導致局部組織充血腫脹,腫瘤壞死因子、IL-1B等致炎因子被大量釋放,從而激活p38MAPK等炎癥相關(guān)信號通路,進而誘發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)[19]。大量研究表明,IL-1B、AKT1是肩袖損傷炎癥期重要的促炎性細胞因子,通過核轉(zhuǎn)錄因子κB、MAPK等多條信號通路在損傷組織局部參與炎癥反應(yīng)的發(fā)生[20-22]。VEGFA可促進血管形成,改變血管通透性,參與炎癥反應(yīng)、細胞凋亡,在肩袖損傷的病理過程中有重要作用[23]。損傷的肩袖組織會在分子層面進行重塑,表現(xiàn)為腱細胞減少、細胞凋亡增加和膠原蛋白排列紊亂,增加后期肩袖再撕裂的概率,影響肩關(guān)節(jié)功能[24]。MMP家族通過重塑損傷細胞外基質(zhì)改變組織形態(tài),有研究表明,在肩袖損傷組織中MMP9表達顯著升高,其過度活躍會影響肩袖組織的修復(fù),而抑制其表達可促進肩袖損傷后的腱骨愈合[25-26]。FN1廣泛存在于細胞外基質(zhì),是組織修復(fù)的重要材料,通過與細胞外基質(zhì)受體相互作用來促進整合蛋白釋放,從而促進組織修復(fù)[27]。

本研究KEGG通路富集分析結(jié)果顯示,解痙散瘀湯治療肩袖損傷的潛在作用靶點主要涉及的信號通路有晚期糖基化終末產(chǎn)物-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體信號通路、缺氧誘導因子1信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、IL-17信號通路。晚期糖基化終末產(chǎn)物-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體信號通路可通過調(diào)控氧化修飾性蛋白質(zhì)的生成,促進炎癥發(fā)生與發(fā)展,同時炎癥因子激活免疫細胞,導致?lián)p傷組織局部炎癥反應(yīng)進一步加劇[28]。缺氧誘導因子1信號通路、腫瘤壞死因子信號通路及IL-17信號通路的表達,促進炎癥因子、促血管形成因子及基質(zhì)金屬蛋白酶釋放,影響炎癥反應(yīng)、細胞凋亡與組織重塑[29-31]。GO功能富集分析結(jié)果顯示,潛在作用靶點基因主要涉及的生物學過程有脂多糖反應(yīng)、低氧反應(yīng)、過氧化氫反應(yīng)、膠原分解代謝過程、蛋白水解等,這些生物學過程均與炎癥反應(yīng)和組織重塑有關(guān)[32-33]。綜上,解痙散瘀湯主要通過影響與炎癥反應(yīng)、細胞凋亡及血管生成相關(guān)的信號通路,來抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)控損傷組織局部細胞凋亡、抑制組織過度重塑,進而減緩肩袖損傷的發(fā)展,改善患者預(yù)后。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學篩選出解痙散瘀湯的主要活性成分,初步探明其以多成分、多靶點、多通路的方式,通過抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)控損傷組織重塑等機制,來發(fā)揮治療肩袖損傷的作用,這或許可為今后解痙散瘀湯治療肩袖損傷的相關(guān)實驗提供理論依據(jù)。