羊肚菌同工酶電泳條件的優(yōu)化

羅 倩 羅明凱 向 準(zhǔn)

（1貴州師范學(xué)院，貴州貴陽 550018；2貴州省生物研究所，貴州貴陽 550009）

羊肚菌（Morchellaspp.）是一種珍稀的食用菌，因菌蓋表面狀如羊肚、凹凸不平而得名，味道鮮美，營養(yǎng)價(jià)值高[1-2]。近年來，隨著羊肚菌人工栽培面積的擴(kuò)大，市場(chǎng)上出現(xiàn)了菌種質(zhì)量參差不齊、管理混亂甚至同種異名的現(xiàn)象，增加了產(chǎn)業(yè)風(fēng)險(xiǎn)。目前，亟須尋找快速檢測(cè)指標(biāo)，以鑒別良莠不齊的菌種。同工酶是一類具有相同催化反應(yīng)功能但分子結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)不同的酶，早在20 世紀(jì)80 年代，同工酶電泳技術(shù)已在多種食用菌的菌種選育、分類鑒定、多樣性遺傳分析及代謝水平差異等方面得到了廣泛應(yīng)用[3]，如靈芝[4]、平菇[5]、木耳[6]、灰樹花[7]、金針菇[8]、牛肝菌等[9]。在食用菌研究中，應(yīng)用較多的同工酶是酯酶同工酶和過氧化物同工酶，但同工酶電泳結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性會(huì)受到食用菌培養(yǎng)方式、凝膠濃度、電泳條件的影響。為此，我國于2006 年發(fā)布了中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《食用菌菌種真實(shí)性鑒定酯酶同工酶電泳法》（NY/T 1097—2006），標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了樣品制備、電泳試劑配方、凝膠濃度，使操作更規(guī)范化，保證了結(jié)果的可重復(fù)性，但標(biāo)準(zhǔn)中適用的食用菌種類較少，集中在側(cè)耳類、茶樹菇、杏鮑菇、香菇、雙孢蘑菇。目前，關(guān)于羊肚菌同工酶電泳的報(bào)道較少，為此，本研究從凝膠濃度、染色條件及培養(yǎng)時(shí)間等方面優(yōu)化羊肚菌同工酶電泳條件，以期為羊肚菌菌種資源鑒定及品種選育提供支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌種

羊肚菌GY-05，保存于貴州師范學(xué)院菌種室。

1.2 試驗(yàn)試劑配制

采用垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行過氧化物酶同工酶電泳和酯酶同工酶[10-12]分析（見表1、表2）。

表2 酯酶同工酶電泳試劑配制

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1酶液的提取取培養(yǎng)7 d 羊肚菌菌絲體0.50 g，加1 mL樣品提取液和0.50 g石英砂，用冰浴研磨后將樣品在4 ℃、12 000 r/min 下離心20 min，取其上清液備用。

1.3.2制膠板厚度選擇不同制膠板厚度0.75、1.00、1.50 mm，分離膠7%，濃縮膠5%，電泳觀察結(jié)果。

1.3.3凝膠濃度參照文獻(xiàn)方法制備濃縮膠和分離膠，其中分離膠的濃度分別為7%、9%和12%。采用80 V 穩(wěn)壓電泳，溴酚藍(lán)指示劑進(jìn)入分離凝膠后，將電壓調(diào)為120 V，溴酚藍(lán)指示帶離底部1 cm 時(shí)停止電泳，染色后，觀察記錄結(jié)果。不同濃度分離膠配方見表3[3，10]。

表3 不同濃度分離膠配方

1.3.4培養(yǎng)時(shí)間將羊肚菌GY-06 置于22 ℃暗培養(yǎng)不同天數(shù)（4、6、8、10、12、15、17 d），按照優(yōu)化條件進(jìn)行酯酶同工酶電泳。

2 結(jié)果與分析

2.1 酯酶同工酶電泳條件優(yōu)化

2.1.1制膠板厚度對(duì)羊肚菌酯酶同工酶電泳的影響試驗(yàn)選擇7.00%的分離膠濃度，研究不同制膠板厚度（0.75、1.00、1.50 mm）對(duì)羊肚菌酯酶同工酶電泳的影響。當(dāng)分離膠濃度為7%時(shí)，3種厚度的制膠1.3 板的電泳效果都不太好，染色酶帶較少，酶帶不清晰，但考慮上樣量的因素，選擇1.50 mm厚度的制膠板用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.2分離膠濃度對(duì)羊肚菌酯酶同工酶電泳的影響結(jié)合國標(biāo)和文獻(xiàn)，選擇7%、9%和12%的分離膠濃度進(jìn)行羊肚菌酯酶同工酶電泳，結(jié)果見表4。由表4可知，分離膠濃度為12%時(shí)，羊肚菌酯酶同工酶酶帶清晰可辨，分離效果較好。

表4 分離膠濃度對(duì)羊肚菌酯酶同工酶電泳的影響

2.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酯酶同工酶電泳結(jié)果的影響

從圖1 和圖2 可知，羊肚菌GY-05 的培養(yǎng)時(shí)間會(huì)影響酯酶種類和數(shù)量的表達(dá)。每個(gè)泳道可分辨的酶帶為2～6條，7個(gè)時(shí)間處理總共有34條酶帶，Rf值為0.02～0.52，2 條共同酶帶的遷移率為0.06、0.16。培養(yǎng)4～6 d 的酯酶譜帶數(shù)量較少，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，譜帶數(shù)量增加；培養(yǎng)10 d后，酯酶譜型基本保持不變，表達(dá)量上略有差異。綜合考慮時(shí)間成本和電泳效果，選擇最優(yōu)培養(yǎng)時(shí)間為10 d。

圖1 菌株GY-05第21代酯酶同工酶酶譜

圖2 菌株GY-05酯酶同工酶譜模式

2.3 羊肚菌過氧化物同工酶染色條件優(yōu)化

為了獲得清晰的羊肚菌過氧化物同工酶酶譜，試驗(yàn)考慮了凝膠濃度、供氫體和底物濃度等因素，比對(duì)了5種染色方法的效果，其結(jié)果如表5、圖3所示。由表5、圖3可知，分離膠濃度為12%，方法二染色時(shí)能得到清晰酶譜（圖3），譜帶數(shù)量為3～4條，其余方法均無法達(dá)到分析要求。羊肚菌過氧化物同工酶最適的染色液配方為5 mL 醋酸聯(lián)苯胺溶液，2 mL 3%H2O2，93 mL H2O。

圖3 過氧化物同工酶酶譜（方法二染色）

表5 羊肚菌GY-05過氧化物同工酶電泳染色結(jié)果

3 討論與結(jié)論

同工酶技術(shù)作為一項(xiàng)可靠的分子標(biāo)記技術(shù)，具有快速、直觀、靈敏、簡(jiǎn)單、遺傳穩(wěn)定、不易受外界環(huán)境影響、酶譜類型豐富等特點(diǎn)[13]，是從基因產(chǎn)物水平來研究生物的遺傳變異，從蛋白質(zhì)水平上研究生物群體遺傳分化的重要手段之一，它彌補(bǔ)了以菌落形態(tài)、顏色、孢子形態(tài)、子實(shí)體形態(tài)等特征分類的傳統(tǒng)方法的不足，可應(yīng)用于菌種選育、分類鑒定[14]。根據(jù)食用菌種類的不同，電泳條件特別是凝膠濃度也隨之發(fā)生變化，茶樹菇[15]和香菇[16]的分離膠濃度為7%，雙孢蘑菇的分離膠濃度為9%[17]?！妒秤镁N真實(shí)性鑒定酯酶同工酶電泳法》中尚無關(guān)于羊肚菌電泳的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，這為酯酶同工酶電泳法在羊肚菌研究中的利用帶來了不便。本試驗(yàn)從凝膠濃度、培養(yǎng)時(shí)間、試劑配方、染色條件等方面探索了羊肚菌酯酶同工酶電泳的最佳條件，即1.5 mm 膠板、12%濃度分離膠、5%濃縮膠，樣品培養(yǎng)時(shí)間為10 d。任桂梅等[18]在研究羊肚菌不同生長期酯酶同工酶采用的分離膠濃度為10%，這可能因?yàn)樽訉?shí)體部分的酶種類和分子量不同，但羊肚菌酯酶同工酶電泳分離膠濃度與國標(biāo)中大多數(shù)食用菌分離膠濃度7%有差異。本研究發(fā)現(xiàn)，同一菌株在不同培養(yǎng)時(shí)間酯酶同工酶的種類和表達(dá)數(shù)量有差異，在杏鮑菇的相關(guān)研究中也出現(xiàn)類似結(jié)果[19]，這可能是由翻譯后基因產(chǎn)物的修飾或基因位點(diǎn)變化所引起的。綜上，利用同工酶進(jìn)行食用菌菌種選育和鑒定時(shí)，除固定電泳條件外，還應(yīng)固定最佳的培養(yǎng)時(shí)間，才能保證結(jié)果的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。

過氧化物酶是廣泛存在于各種動(dòng)物、植物和微生物的一類氧化酶，以過氧化氫為電子受體催化底物氧化的酶，其供氫體較多[20]。過氧化物同工酶的電泳分析中，影響酶帶清晰度的因素除凝膠質(zhì)量外，染色液的配比也很關(guān)鍵。本研究發(fā)現(xiàn)，過氧化氫用量會(huì)影響過氧化物同工酶酶帶顏色的深淺，當(dāng)電泳條件相同時(shí)，含3% H2O2的染色液的呈色效果優(yōu)于30% H2O2染色液，這與陳紅兵等[21]的研究結(jié)果相一致，這可能是底物抑制現(xiàn)象，納摩爾水平的過氧化氫可導(dǎo)致血卟啉中間體的降解[22]。本試驗(yàn)電泳得到的過氧化物酶酶帶條帶較少，這可能與羊肚菌分解利用木質(zhì)素的能力較弱，淀粉酶活力較高相關(guān)[23]，因此，不建議過氧化物酶同工酶作為羊肚菌檢測(cè)遺傳多樣性的生化標(biāo)記。