蒸餾水促進人晶狀體上皮細胞(SRA01/04)凋亡并抑制其增殖、遷移、侵襲及轉(zhuǎn)分化能力研究

程心璇 劉亞軍 張文文 陳菲菲 何自芳 張 司 解正高

后囊膜混濁(PCO)是白內(nèi)障手術(shù)的常見并發(fā)癥,PCO通常與術(shù)后殘留晶狀體上皮細胞 (LECs)的病理進展有關(guān),包括LECs的增殖、遷移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)[1]。目前PCO常采用的治療方法為Nd:YAG激光囊膜切開術(shù),但有發(fā)生各種并發(fā)癥的風險[2]。因此,術(shù)中藥物預防PCO仍是目前研究的重要目標。既往已研究多種藥物預防PCO的發(fā)展,然而由于眼內(nèi)使用藥物的高安全標準,現(xiàn)在仍無藥物對預防PCO足夠有效和安全。蒸餾水(DW)價格便宜,使用安全,并可通過滴注平衡鹽溶液迅速被中和,已作為“藥物”被用來研究其對繼發(fā)性囊膜混濁的影響。DW通過低滲透壓,使細胞吸收水分引起細胞破裂而起到預防繼發(fā)性囊膜混濁的作用[3]。但有研究發(fā)現(xiàn),細胞在低滲溶液中具有調(diào)節(jié)性容積減小的作用,可防止細胞脹破[4]。目前,DW處理后未破裂的LECs,其凋亡、增殖、遷移及EMT是否有改變尚未足夠了解。因此,本研究探索DW對LECs的增殖、遷移及EMT的影響,為DW用于預防繼發(fā)性囊膜混濁提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞與主要試劑、儀器

人晶狀體上皮細胞系SRA01/04由上海通派有限公司提供。胎牛血清、胰蛋白酶(GIBCO公司);青霉素及鏈霉素(南京凱基生物);Transwell 細胞培養(yǎng)小室(賽默飛公司);Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(Biolegend公司);CCK-8試劑盒、5-乙炔基-2’-脫氧尿苷(EdU)、BCA試劑盒(碧云天公司);RIPA試劑(貝斯特生物公司);羊抗兔辣根過氧化物酶標記的二抗(南京百世生物科技有限公司);顯影液試劑(上海翊圣生物公司);α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)(Proteintech公司);Bcl-2抗體、Bax抗體、Caspase-9抗體、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)抗體、 纖連蛋白(Fibronectin)抗體、 波形蛋白(Vimentin)抗體(Abcam公司);流式細胞儀(BD公司);凝膠成像儀(上海勤翔公司);熒光顯微鏡(OLYMPUS公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與處理

SRA01/04細胞在DMEM / F12培養(yǎng)基中生長,培養(yǎng)基添加體積分數(shù)10%胎牛血清和10 g·L-1青霉素以及10 g·L-1鏈霉素,細胞在含體積分數(shù)5% CO2和37 ℃的細胞培養(yǎng)箱中正常生長,每3 d更換一次培養(yǎng)液。取貼壁培養(yǎng)的細胞,用2.5 g·L-1胰蛋白酶(含EDTA)37 ℃消化細胞1 min后,1 000 r·min-1室溫離心5 min,棄上清,加入4 mL新鮮培養(yǎng)液,吹打混勻。取細胞懸液18 μL,加2 μL的4 g·L-1臺盼藍溶液,進行細胞計數(shù),細胞存活率需在90%以上。調(diào)節(jié)細胞密度至1×105個·mL-1,取6孔板,加入細胞懸液,每孔2 mL,于37 ℃、含體積分數(shù)5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。

1.2.2 實驗分組

細胞貼壁后,將細胞隨機分為6組,對照組不作處理,其余細胞棄去培養(yǎng)液,BBS組采用BBS處理3 min;DW組分別采用DW處理30 s(DW 30 s組)、1 min(DW 1 min組)、2 min(DW 2 min組)、3 min(DW 3 min組)。除對照組外,其余組加入2 mL細胞培養(yǎng)液終止作用,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.3 流式細胞儀檢測

采用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒測定SRA01/04細胞的凋亡。分組處理細胞,用不含EDTA的胰蛋白酶消化各組細胞并收集。PBS洗滌細胞2次,再使其重新懸浮于緩沖液中。細胞濃度為1×105個·mL-1,緩沖液500 μL,分別添加Annexin V-FITC/PI和PI各5 μL,室溫下黑暗中放置15 min。最后使用流式細胞儀分析伴隨光散射的熒光信號。

1.2.4 EdU檢測

為評估DW對LECs增殖的影響,進行EdU染色。將SRA01/04細胞接種于6孔板(1×105個·mL-1),分組處理后,用含20 μmol·L-1EdU的新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞2 h。之后,將細胞固定在40 g·L-1多聚甲醛中15 min,PBS洗滌3次,每次5 min,用含F(xiàn)ITC的Apollo染色反應(yīng)液于黑暗中孵育30 min,采用DAPI孵育細胞并貼壁,最后用共聚焦熒光顯微鏡捕獲EdU陽性細胞,ImageJ軟件計數(shù)。

1.2.5 CCK-8實驗檢測

采用CCK-8實驗檢測DW對SRA01/04細胞增殖的影響。將分組處理后的細胞分別接種于96孔板中,每組6個復孔,培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,然后分別加入CCK-8試劑10 μL和含體積分數(shù)0.5%胎牛血清的培養(yǎng)液100 μL,37 ℃孵育2 h,分光光度計檢測450 nm光密度。

1.2.6 Western blot檢測

SRA01/04細胞分組處理后采用RIPA試劑裂解,采用BCA試劑盒對總蛋白進行定量。采用100 g·L-1電泳凝膠分離,之后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,體積分數(shù)5%脫脂牛奶封閉,孵育一抗α-SMA、N-cadherin、Fibronectin、Vimentin、Bax、Bcl-2、Caspase-9在4 ℃過夜。采用羊抗兔辣根過氧化物酶標記的二抗在室溫下孵育1 h。最后,采用顯影液試劑暴露條帶,并使用ImageJ軟件進行定量分析。

1.2.7 細胞劃痕實驗

將SRA01/04細胞接種于6孔板中,生長至60%～80%融合。更換培養(yǎng)基,用不含血清的培養(yǎng)基再培養(yǎng)18 h。使用1個200 μL移液管尖端于每孔中央沿直線刮擦細胞單層,采用PBS洗滌受傷的單層以除去分離的細胞和碎片,分組處理后,采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h,顯微鏡測量傷口閉合情況,ImageJ軟件測定和分析細胞遷移的距離。數(shù)據(jù)基于平均距離的百分比進行量化;0 h的傷口被認為是100%的平均距離。

1.2.8 Transwell遷移和侵襲分析

將SRA01/04細胞接種于孔徑為8 μm的24孔板的Transwell小室的內(nèi)室中,用于細胞遷移測定。每孔4×104個細胞,使用DMEM/F12無血清培養(yǎng),在下部孔中,使用含體積分數(shù)10% FBS的DMEM作為化學引誘劑。細胞經(jīng)過分組處理后培養(yǎng)24 h,PBS洗滌3次,40 g·L-1多聚甲醛固定10 min并用10 g·L-1結(jié)晶紫染色15 min,觀察染色的細胞并在顯微鏡下拍照。隨機選擇6個視野,使用ImageJ軟件進行細胞計數(shù)。細胞侵襲的測定:Transwell小室采用Matrigel預涂覆,其余實驗程序與用于遷移測定的程序相同。

1.3 統(tǒng)計學處理

使用GraphPad Prism 5.0進行統(tǒng)計分析。所有實驗均重復3次或3次以上。使用單因素方差分析(ANOVA)進行多組間的比較,組間兩兩比較采用Tukey檢驗,檢驗水準:α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 DW對SRA01/04細胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白的作用

使用流式細胞儀檢測SRA01/04細胞凋亡情況。早期和晚期凋亡細胞的百分比分別顯示在直方圖的右下和右上象限(圖1)。多組間比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。對照組及BBS組中凋亡細胞少見,隨著DW作用時間的逐漸增加,SRA01/04細胞凋亡率逐漸增加,DW 3 min組中凋亡最為顯著。DW 2 min組[(19.23±1.19)%]及DW 3 min組[(60.87±9.32)%]的細胞凋亡率與對照組[(3.87±1.84)%]及BBS組[(4.37±1.86)%]相比,差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。SRA01/04細胞中凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2及Caspase-9的表達結(jié)果顯示,DW處理后與處理前相比,Bax和Caspase-9蛋白水平升高,而Bcl-2蛋白水平降低(圖2)。多組間比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。DW 2 min組(3.64±0.62)及DW 3 min組(14.19±0.52)的Bax/Bcl-2與對照組(1.00±0.01)及BBS組[(1.18±0.09)%]相比,差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05);DW 1 min組[(3.01±0.18)%]、DW 2 min組[(3.64±0.62)%]及DW 3 min組[(4.60±0.52)%]的Caspase-9蛋白水平與對照組[(1.01±0.01)%]及BBS組[(1.10±0.14)%]相比,差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。

圖1 流式細胞儀檢測各組SRA01/04細胞凋亡圖

圖2 Western blot檢測各組SRA01/04細胞凋亡相關(guān)蛋白表達條帶圖

2.2 DW對SRA01/04細胞增殖的抑制作用

DW處理SRA01/04細胞不同時間后檢測EdU陽性細胞率,多組間比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。隨著DW處理時間的增加,EdU陽性細胞數(shù)逐漸減少,SRA01/04細胞增殖能力逐漸下降(圖3)。在3個單獨的圖像中測量EdU陽性細胞數(shù),將EdU陽性細胞數(shù)除以細胞核數(shù)以計算EdU陽性細胞率。DW 30 s組[(44.82±2.50)%]、DW 1 min組[(37.79±0.26)%]、DW 2 min組[(28.76±4.00)%]及DW 3 min組[(26.07±0.93)%]EdU陽性細胞率與對照組[(58.07±6.85)%]及BBS組[(55.00±2.82)%]相比,差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。CCK-8實驗檢測發(fā)現(xiàn),SRA01/04細胞活性隨著DW處理時間的增加逐漸降低(圖4)。DW 2 min組及DW 3 min組細胞活性與對照組相比,差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。其他組與對照組相對,差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)。

A:對照組;B:BBS組;C:DW 30 s組;D:DW 1 min組;E:DW 2 min組;F:DW 3 min組。紅色:EdU染色;藍色:DAPI染色。圖3 各組SRA01/04細胞中EdU細胞陽性染色共聚焦圖像(×200)

注:與對照組相比,**P<0.01,***P<0.001。圖4 各組SRA01/04細胞活性對比分析折線圖

2.3 DW對SRA01/04細胞遷移的抑制作用

細胞劃痕實驗結(jié)果顯示,與對照組相比,DW處理組SRA01/04細胞的48 h遷移能力降低,且DW對SRA01/04細胞遷移的抑制作用隨著DW處理時間的增加而增強(圖5A)。Transwell小室遷移和侵襲實驗發(fā)現(xiàn),DW處理后,DW處理各組SRA01/04細胞穿過聚碳酸酯膜的細胞明顯少于對照組(圖5B),SRA01/04細胞的運動遷移能力減弱。多組間比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。DW 1 min組[(44.25±13.25)%]、DW 2 min組[(34.70±14.56)%]及DW 3 min組[(22.38±14.95)%]SRA01/04細胞遷移距離與對照組[(79.09±6.59)%]相比,差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。其他組與對照組相對,差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)。

A:各組SRA01/04細胞傷口閉合情況的顯微圖像;B:各組SRA01/04細胞Transwell小室遷移和侵襲實驗顯微圖像。圖5 各組SRA01/04細胞的遷移和侵襲能力(×200)

2.4 DW對SRA01/04細胞EMT的抑制作用

Western blot檢測結(jié)果顯示,SRA01/04細胞中轉(zhuǎn)分化相關(guān)蛋白α-SMA、N-cadherin、Fibronectin、Vimentin的表達隨DW處理時間呈依賴性降低(圖6)。多組間比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。DW 1 min組(0.53±0.14)、DW 2 min組(0.33±0.10)及DW 3 min組(0.20±0.10)SRA01/04細胞中α-SMA蛋白表達水平與對照組(0.97±0.07)及BBS組(0.93±0.06)相比,差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05);DW 30 s組(0.78±0.16)、DW 1 min組(0.56±0.11)、DW 2 min組(0.44±0.08)及DW 3 min組(0.23±0.05)SRA01/04細胞中N-cadherin蛋白表達水平與對照組(1.06±0.10)相比,差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05);DW 1 min組(0.64±0.06)、DW 2 min組(0.42±0.04)及DW 3 min組(0.29±0.03)SRA01/04細胞中Fibronectin蛋白表達水平與對照組(0.95±0.09)相比,差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05);DW 30 s組(0.78±0.14)、DW 1 min組(0.64±0.05)、DW 2 min組(0.41±0.02)及DW 3 min組(0.30±0.02)SRA01/04細胞中Vimentin蛋白表達水平與對照組(1.06±0.07)相比,差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。DW抑制了SRA01/04細胞的EMT作用。其他組與對照組相對,差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)。

圖6 Western blot檢測各組SRA01/04細胞EMT相關(guān)蛋白表達

3 討論

PCO是白內(nèi)障手術(shù)最常見的術(shù)后并發(fā)癥,可導致視力喪失,其發(fā)病率在成人中為30%～50%,在接受白內(nèi)障手術(shù)的患兒中為100%[5]。手術(shù)后晶狀體赤道部和前囊膜下殘余的上皮細胞增殖、遷移至人工晶狀體和后囊膜之間,發(fā)生EMT,轉(zhuǎn)化成為成纖維細胞和紡錘形的肌成纖維細胞,導致囊膜發(fā)生混濁。因此,抑制LECs增殖和遷移可能是預防PCO的有效策略。

DW又稱無菌注射用水,通常用作無菌粉劑和稀釋劑的注射用溶劑,是一種廣泛應(yīng)用于外科的洗滌液。其滲透壓低于人體組織細胞的滲透壓,研究認為,DW是通過低滲透壓,使細胞吸收水分引起細胞破裂而起到預防繼發(fā)性囊膜混濁的作用[6-7]。本研究發(fā)現(xiàn),DW能夠促進LECs凋亡,抑制其增殖、遷移和EMT作用。

LECs的增殖在白內(nèi)障的發(fā)病機制中起重要作用。DW處理SRA01/04細胞不同時間后采用EdU和CCK-8實驗檢測細胞增殖情況,發(fā)現(xiàn)SRA01/04細胞的增殖能力隨DW處理時間呈依賴性下降。細胞凋亡是一種細胞程序性死亡,具有獨特的生化和遺傳途徑,在維持組織的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用[8]。本研究通過流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn),DW可以促進SRA01/04細胞的凋亡。內(nèi)在細胞凋亡的關(guān)鍵事件是線粒體外膜透化(MOMP)。MOMP 受促凋亡和抗凋亡Bcl-2家族蛋白之間的相互作用調(diào)節(jié)。促凋亡蛋白 Bax和 Bak在線粒體外膜形成孔,細胞色素c 和其他可溶性蛋白質(zhì)從線粒體膜間隙釋放,導致Caspase 激活和細胞死亡[9]。本研究檢測了SRA01/04細胞中凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-9在DW處理后的蛋白水平,結(jié)果表明,DW促進了促凋亡蛋白Bax和Caspase-9的表達,同時下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2水平,Bcl-2/Bax比值逐漸下降。本研究結(jié)果表明,DW不僅可以有效抑制LECs的增殖,還可以促進其體外凋亡。白內(nèi)障術(shù)后LECs的遷移可能導致PCO,本研究細胞劃痕實驗及Transwell細胞遷移實驗結(jié)果表明,DW抑制了SRA01/04細胞的遷移和侵襲。因此,DW可能是安全有效預防PCO發(fā)生的方法之一。

PCO 的特征之一是LECs完整性的喪失,這與異常增殖、遷移和細胞形態(tài)變化有關(guān),這種生物學過程稱為EMT[10]。EMT是上皮細胞將其表型改變?yōu)?肌)成纖維細胞的表型,細胞失去細胞間黏附,極性喪失,并獲得間充質(zhì)表型,包括增強細胞的遷移能力、侵襲性、細胞凋亡抵抗力,并大大增加細胞外基質(zhì)組分,包括Fibronectin和膠原纖維的產(chǎn)生[11]。α-SMA是活性成纖維細胞的常見標志物,E-鈣黏蛋白(E-cadherin)在上皮細胞中表達,并且在胚胎發(fā)育、組織纖維化和癌癥的EMT期間降低表達,從E-cadherin到N-cadherin的鈣黏蛋白轉(zhuǎn)化可以用于監(jiān)測EMT的發(fā)生[12]。Vimentin是正常表達于間充質(zhì)來源細胞的最主要的中間絲蛋白,Vimentin 現(xiàn)也認為是EMT的生物標志物之一[13]。EMT增加了Vimentin、Fibronectin、N-cadherin、α-SMA的表達[14]。本研究發(fā)現(xiàn),DW處理SRA01/04細胞后,相關(guān)蛋白α-SMA、Fibronectin、Vimentin及N-cadherin表達量均隨DW處理時間的增加而減少,說明DW對SRA01/04細胞的EMT有抑制作用。

4 結(jié)論

DW能夠促進SRA01/04細胞體外凋亡,并抑制SRA01/04細胞在體外增殖、遷移和轉(zhuǎn)分化的能力,但仍需要進一步的研究來探索DW對體內(nèi)白內(nèi)障手術(shù)后PCO進展的影響。本研究為繼發(fā)性囊膜混濁的防治提供了一個新的思路,對于臨床工作有一定指導意義。