SYVN1泛素化降解XRCC5對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞DNA氧化損傷的影響△

王從玉 李鵬飛 王思文 鮑思潔 石海紅 管懷進(jìn)

年齡相關(guān)性白內(nèi)障(ARC)是全世界可逆性視力損害的罪魁禍?zhǔn)譡1]。迄今,ARC的致病機(jī)制尚未完全闡明。因此,尋找非手術(shù)治療策略對(duì)ARC患者具有重要意義。研究表明,紫外線(UVB)會(huì)導(dǎo)致晶狀體上皮細(xì)胞(LECs)內(nèi)DNA發(fā)生氧化損傷、蛋白質(zhì)因錯(cuò)誤折疊而累積。如果錯(cuò)誤折疊蛋白未能及時(shí)降解,其異常聚集將導(dǎo)致晶狀體混濁的發(fā)生[2-3]。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中,泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解錯(cuò)誤折疊或不需要的蛋白,參與多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)展過程,包括阿爾茨海默病[4]、帕金森病[5]、亨廷頓病[6]等。泛素化是由三組酶(E1、E2和E3)催化的級(jí)聯(lián)反應(yīng),E3泛素連接酶被認(rèn)為是泛素化修飾中最重要的組成部分[7]。SYVN1是一種滑膜蛋白,已被證實(shí)在ARC的發(fā)病中起重要作用[8],然而對(duì)DNA氧化損傷的影響尚需進(jìn)一步探索。XRCC5是非同源末端連接修復(fù)途徑的重要基因,負(fù)責(zé)修復(fù)DNA雙鏈斷裂(DSB)[9]。最近的研究表明,DNA損傷修復(fù)蛋白(DRPs)泛素化是調(diào)節(jié)DNA損傷反應(yīng)的關(guān)鍵機(jī)制,如果調(diào)控不當(dāng),DNA損傷反應(yīng)可能會(huì)導(dǎo)致人類疾病[10]。因此,本研究用人晶狀體上皮細(xì)胞系SRA01/04作為研究對(duì)象,探索SYVN1是否可以通過調(diào)節(jié)DRPs中XRCC5的泛素化降解影響LECs中DNA氧化損傷修復(fù)情況。

1 材料與方法

1.1 材料

SRA01/04細(xì)胞購于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所。胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)液和細(xì)胞培養(yǎng)板購于美國(guó)Gibco公司;聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)實(shí)驗(yàn)所需耗材購于美國(guó)Thermo Scientific公司,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司,引物購于中國(guó)生工生物工程股份有限公司;SYVN1過表達(dá)質(zhì)粒購于中國(guó)PPL質(zhì)粒與蛋白共享庫;蛋白GAPDH抗體、熒光二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,山羊抗兔和山羊抗鼠IgG)購于中國(guó)ABclonal公司;SYVN1、XRCC5、Ub和γH2A抗體購于英國(guó)Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

取出凍存的SRA01/04細(xì)胞,放入37 ℃培養(yǎng)箱中快速解凍,1 000～1 200 r·min-1離心10 min,加入完全培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和10 g·L-1青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基)后,置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 UVB構(gòu)建細(xì)胞氧化損傷模型

待細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%時(shí),用Hanks液清洗細(xì)胞1～2次,加入適量無菌PBS,在紫外燈(波長(zhǎng)為275～400 nm,峰值為310 nm)下 30 cm 處照射15 min后[8],繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組

SRA01/04細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、UVB組、UVB+HA組和UVB+OV-SYVN1組,其中,對(duì)照組細(xì)胞正常培養(yǎng),UVB組細(xì)胞行UVB照射建立細(xì)胞氧化損傷模型,UVB+HA組和UVB+OV-SYVN1組細(xì)胞行細(xì)胞轉(zhuǎn)染后再行UVB照射。細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法為:6孔板中SRA01/04細(xì)胞融合度達(dá)70%時(shí),UVB+HA組和UVB+OV-SYVN1組細(xì)胞分別加入HA過表達(dá)質(zhì)粒和SYVN1過表達(dá)質(zhì)粒2 μg,轉(zhuǎn)染試劑opti-MEM、Lipofectamine3000和P3000體積比為250 μL：75 μL：5 μL,室溫孵育15 min;隨后培養(yǎng)箱中孵育6 h,更換為含有胎牛血清的完全培養(yǎng)基,于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 免疫沉淀實(shí)驗(yàn)

根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求處理細(xì)胞后,加入免疫沉淀裂解液(100 mmol·L-1NaCl,20 mmol·L-1Tris-HCl,體積分?jǐn)?shù)1% TritonX-100),提取蛋白質(zhì)上清。隨機(jī)分為IP組和Input組。其中,IP組分為IgG組、SYVN1組和XRCC5組,IP組進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn),用IgG抗體下拉與IgG結(jié)合的蛋白,用SYVN1抗體下拉與SYVN1結(jié)合的蛋白;Input組為未經(jīng)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)處理的細(xì)胞總蛋白。每組取400 μg蛋白質(zhì)原液,分別加入1 μL對(duì)應(yīng)的抗體后在搖床上孵育過夜。第2天,應(yīng)用磁珠將抗體-蛋白質(zhì)復(fù)合物提取出來,進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn),檢測(cè)SYVN1、XRCC5和泛素蛋白的表達(dá)。同時(shí),本實(shí)驗(yàn)的Input組取50 μL蛋白原液,檢測(cè)泛素蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 免疫熒光染色檢測(cè)DNA損傷標(biāo)志物

在24孔板中放入細(xì)胞爬片,將細(xì)胞均勻接種在爬片上,培養(yǎng)6～8 h待細(xì)胞貼壁后,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分組處理。孵育24 h后,用PBS清洗細(xì)胞。隨后加入200 μL 40 g·L-1多聚甲醛,固定1 h;加入0.3 g·L-1牛血清白蛋白和體積分?jǐn)?shù)0.5% Triton X-100溶液,室溫封閉2 h;之后,根據(jù)抗體γH2A說明書加入熒光一抗(1：250),于4 ℃冰箱內(nèi)孵育過夜;第2天,取出復(fù)溫2 h后,PBST搖床洗3次,每次5 min;避光加入熒光二抗(1：500),室溫孵育2 h 后,PBST搖床洗3次,每次5 min;用DAPI染核,避光孵育8 min后,PBST搖床洗3次,每次15 min;應(yīng)用熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.7 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白相對(duì)表達(dá)量

將分組處理后的細(xì)胞用冰浴預(yù)冷的PBS清洗3次,每次5 min;之后,棄掉PBS,根據(jù)細(xì)胞密度加入80～200 μL蛋白質(zhì)裂解液,冰上裂解10 min;用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞,利用移液槍轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中,4 ℃ 搖床裂解30 min,4 ℃、14 000 r·min-1離心30 min,提取蛋白質(zhì)上清。凝膠電泳(150 V)分離蛋白,應(yīng)用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜(250 mA,2 h)將靶蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,使用5 g·L-1脫脂奶粉在室溫下封閉2 h。參照目的抗體說明書稀釋一抗(γH2A、SYVN1、XRCC5和泛素稀釋比例均為1：1 000,GAPDH稀釋比例1：10 000),加入PVDF膜中,置于4 ℃冰箱孵育過夜。第2天,用TBST漂洗3次,每次5 min,之后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(稀釋比例為1：10 000),室溫孵育2 h。最后加入顯影劑,置于顯影機(jī)內(nèi)顯影。以GAPDH作為內(nèi)參,計(jì)算目的蛋白表達(dá)的灰度值。

1.8 UbiBrowser軟件分析

利用UbiBrowser軟件(http://ubibrowser.ncpsb.org.cn/v2/)預(yù)測(cè)能與XRCC5發(fā)生相互作用的E3泛素連接酶。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。各組細(xì)胞的蛋白相對(duì)表達(dá)量及SYNV1轉(zhuǎn)染效率對(duì)比均應(yīng)用單因素方差分析,兩樣本間比較應(yīng)用兩樣本t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn):α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 SRA01/04細(xì)胞中SYVN1過表達(dá)模型驗(yàn)證

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,對(duì)照組、OV-SYVN1組細(xì)胞中SYVN1蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.15、1.99±0.17。與對(duì)照組比較,OV-SYVN1組細(xì)胞中SYVN1蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯上調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖1)。表明SYVN1過表達(dá)模型構(gòu)建成功。

與對(duì)照組比較,**P<0.01。圖1 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SYVN1在SRA01/04細(xì)胞過表達(dá)模型中的表達(dá)變化

2.2 γH2A蛋白在SYVN1過表達(dá)模型中的表達(dá)

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,對(duì)照組、UVB組、UVB+HA組和UVB+OV-SYVN1組中γH2A蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.04、1.59±0.04、1.53±0.07、1.85±0.04。與對(duì)照組比較,UVB組SRA01/04細(xì)胞中γH2A蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1);與UVB+HA組比較,UVB+OV-SYVN1組SRA01/04細(xì)胞中γH2A蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖2)。表明過表達(dá)SYVN1會(huì)加重DNA氧化損傷。

1:對(duì)照組;2:UVB組;3:UVB+HA組;4:UVB+OV-SYVN1組。與對(duì)照組比較,****P<0.000 1;與UVB+HA組比較,##P<0.01;ns表示與UVB組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖2 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞γH2A蛋白表達(dá)

2.3 免疫熒光染色檢測(cè)DNA氧化損傷程度

免疫熒光染色結(jié)果顯示,與UVB+HA組比較,UVB+OV-SYVN1組SRA01/04細(xì)胞中γH2A染色明顯加強(qiáng)(圖3)。表明過表達(dá)SYVN1后,SRA01/04細(xì)胞的DNA氧化損傷程度加重。

圖3 免疫熒光染色檢測(cè)UVB+HA組和UVB+ OV-SYVN1組SRA01/04細(xì)胞中γH2A的表達(dá)

2.4 XRCC5存在泛素化修飾及其與E3泛素連接酶的預(yù)測(cè)

免疫沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),XRCC5存在泛素化修飾(圖4A)。UbiBrowser軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn), SYVN1可能是XRCC5的一個(gè)潛在的E3泛素連接酶(圖4B)。

圖4 免疫沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)XRCC5存在泛素化修飾(圖A)及UbiBrowser軟件預(yù)測(cè)其相互作用蛋白(圖B)

2.5 SYVN1與XRCC5之間存在相互作用

免疫沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,SYVN1與XRCC5存在相互作用(圖5),表明SYVN1有可能參與介導(dǎo)XRCC5蛋白的泛素化修飾。

圖5 免疫沉淀實(shí)驗(yàn)顯示SYVN1與XRCC5存在相互作用

2.6 SYVN1促進(jìn)XRCC5的蛋白質(zhì)降解

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,對(duì)照組和OV-SYVN1組中XRCC5蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.12、0.33±0.05。與對(duì)照組比較,OV-SYVN1組中XRCC5蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(圖6)。表明SYVN1可能通過促進(jìn)泛素化修飾來加速XRCC5的蛋白質(zhì)降解。

與對(duì)照組比較,***P<0.001。圖6 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)XRCC5在OV-SYVN1氧化損傷細(xì)胞模型中的表達(dá)變化

3 討論

ARC的發(fā)病機(jī)制仍不明確,但氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的DNA損傷是ARC形成和發(fā)展的關(guān)鍵因素[11-14]。而DNA氧化損傷后機(jī)體會(huì)啟動(dòng)DNA損傷反應(yīng)系統(tǒng),招募DRPs去修復(fù)受損的DNA。所以,探索DRPs表達(dá)改變的機(jī)制是目前研究ARC發(fā)病機(jī)制亟需解決的問題。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),表觀遺傳修飾參與調(diào)控DNA損傷修復(fù)基因(DRGs)的表達(dá),如ERCC6是核苷酸切除修復(fù)通路的關(guān)鍵酶,在ARC患者樣本中其蛋白表達(dá)水平下降;研究還發(fā)現(xiàn)其啟動(dòng)子區(qū)存在高度甲基化,并被DNA甲基化酶DNMT3b所調(diào)控,導(dǎo)致ERCC6的轉(zhuǎn)錄程度降低,進(jìn)而導(dǎo)致DNA修復(fù)進(jìn)程不暢[15]。以上研究結(jié)果表明,DRGs的表達(dá)降低與ARC的致病過程緊密相關(guān)。所以,本課題組應(yīng)用微陣列芯片檢測(cè)96個(gè)DRGs在ARC中的表達(dá)變化,結(jié)果表明,僅存在10個(gè)DRGs表達(dá)明顯下降,大多數(shù)DRGs的mRNA水平表達(dá)均無明顯變化[16],提示可能存在其他的調(diào)控機(jī)制參與DRPs蛋白水平的表達(dá)。

泛素化修飾是蛋白質(zhì)翻譯后修飾之一,泛素化系統(tǒng)發(fā)生異常與衰老相關(guān)疾病的聯(lián)系密切,包括年齡相關(guān)性白內(nèi)障、癌癥和神經(jīng)退行性疾病[13]。此外,泛素化是由三組酶(E1、E2和E3)催化的級(jí)聯(lián)反應(yīng),首先,E1泛素激活酶形成硫酯鍵激活泛素;隨后,泛素被轉(zhuǎn)移到E2泛素結(jié)合酶;最后,E3泛素連接酶催化泛素與目標(biāo)蛋白的賴氨酸殘基發(fā)生鍵合。E3泛素連接酶負(fù)責(zé)識(shí)別底物并提供底物特異性。因此,E3泛素連接酶被認(rèn)為是泛素化修飾中最重要的組成部分[7]。近年來,E3泛素連接酶與ARC之間的聯(lián)系引起廣泛關(guān)注。Chen等[8]研究發(fā)現(xiàn),E3泛素連接酶SYVN1介導(dǎo)MSH3泛素化降解,促進(jìn)LECs凋亡,進(jìn)而導(dǎo)致ARC進(jìn)展。同樣,李鵬飛等[17]研究發(fā)現(xiàn),S期激酶相關(guān)蛋白2通過促進(jìn)堿基切除修復(fù)蛋白8-氧代鳥嘌呤-DNA糖基化酶泛素化降解,導(dǎo)致LECs內(nèi)部受損DNA的累積,從而加劇ARC發(fā)展。此外,泛素連接酶依據(jù)其結(jié)構(gòu)域分為三類:HECT結(jié)構(gòu)域、RING結(jié)構(gòu)域和U-box結(jié)構(gòu)域。SYVN1是RING結(jié)構(gòu)域E3泛素連接酶家族成員,已經(jīng)被證明在各種眼科疾病中發(fā)揮重要作用[18-19]。例如,Shruthi等[18]在糖尿病視網(wǎng)膜病變的大鼠中發(fā)現(xiàn)SYVN1可能會(huì)誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激持續(xù)作用下將引發(fā)神經(jīng)元凋亡,進(jìn)而導(dǎo)致DR進(jìn)展。SYVN1對(duì)DNA氧化損傷的研究較少,已有學(xué)者證明在ARC患者的LECs中SYVN1表達(dá)升高[8]。為了探討SYVN1在ARC患者中如何調(diào)控DNA氧化損傷,我們?cè)谘趸瘬p傷模型中構(gòu)建了SYVN1過表達(dá)模型,檢測(cè)DNA損傷標(biāo)志物γH2A的表達(dá)變化,由于γH2A含量與DNA受損嚴(yán)重程度呈正比,因此其被當(dāng)作DNA損傷重要標(biāo)志物之一。本研究結(jié)果表明,過表達(dá)SYVN1會(huì)加重LECs中DNA損傷,但具體機(jī)制尚不清楚。

為了進(jìn)一步討論SYVN1如何影響DNA氧化損傷修復(fù),我們進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)可能與XRCC5蛋白發(fā)生相互作用的E3泛素連接酶,并通過免疫沉淀實(shí)驗(yàn)證明SYVN1與XRCC5之間存在相互作用。晶狀體中存在多條DNA氧化損傷修復(fù)通路[20],DSB修復(fù)途徑是DNA復(fù)制過程中的主要修復(fù)途徑,經(jīng)過非同源末端連接或同源重組的形式修復(fù)斷裂的DNA雙鏈,維持染色體穩(wěn)定性[21]。XRCC5是DSB修復(fù)通路的主要蛋白,其表達(dá)下降將會(huì)導(dǎo)致DNA修復(fù)功能障礙、細(xì)胞周期停滯甚至凋亡,并誘發(fā)癌癥等重大疾病[22]。有學(xué)者研究表明,蛋白質(zhì)翻譯后修飾可能調(diào)控DNA損傷修復(fù)基因表達(dá)。因此,及時(shí)有效地修復(fù)受損DNA對(duì)預(yù)防ARC具有重要意義。在之前的研究中,我們?cè)贏RC患者中檢測(cè)到XRCC5蛋白表達(dá)水平下降,并表明XRCC5可能對(duì)LECs誘導(dǎo)的凋亡具有保護(hù)作用[22],提示我們?cè)贚ECs中繼續(xù)探索XRCC5基因表達(dá)下降的機(jī)制。在前期研究和本研究中我們均發(fā)現(xiàn),XRCC5能發(fā)生泛素化修飾,但具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚。盡管Mao等[22]研究發(fā)現(xiàn),在ARC患者中Trim25表達(dá)升高,泛素化降解XRCC5導(dǎo)致LECs凋亡,可能與ARC的發(fā)病機(jī)制有關(guān),但是本研究拓展了XRCC5潛在的調(diào)控機(jī)制。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),過表達(dá)E3泛素連接酶SYVN1能夠顯著下調(diào)XRCC5的表達(dá),提示SYVN1可能泛素化降解XRCC5,參與ARC內(nèi)的DNA損傷修復(fù)過程。

4 結(jié)論

SYVN1能夠介導(dǎo)DRGs中XRCC5發(fā)生泛素化修飾,并通過降解XRCC5蛋白表達(dá)進(jìn)而影響DNA氧化損傷修復(fù)過程,參與ARC的發(fā)展,這些結(jié)果提示DRPs的翻譯后修飾可能與ARC的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。本研究為ARC的發(fā)病機(jī)制提供了新見解。