鼠后肢缺血模型研究進展

張永康,殷康力,宗媛,劉家睿,王御震,曹燁民?

(1.上海中醫(yī)藥大學,上海 201203;2.上海中醫(yī)藥大學附屬上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院脈管病科,上海 200082)

據(jù)統(tǒng)計,全世界超過2 億人受外周動脈疾病(peripheral arterial disease,PAD)的影響,在美國約800 萬人患有PAD[1]。PAD 是動脈粥樣硬化導致的進展性慢性動脈閉塞性疾病[2],需明確的是PAD通常意義上指除冠狀動脈和主動脈以外的所有動脈疾病[1]。為避免混淆,本綜述此次僅回顧PAD 中下肢動脈疾病的臨床前模型構(gòu)建方法,且本文中PAD 特指下肢動脈疾病。

構(gòu)建可靠、能模擬臨床癥狀的PAD 模型是做好轉(zhuǎn)化醫(yī)學的重要環(huán)節(jié)。下肢缺血作為PAD 最重要的病理改變,是誘發(fā)眾多臨床癥狀的重要原因。因此,構(gòu)建下肢缺血模型作為PAD 臨床前模型,可以為探索改善PAD 患者下肢血流灌注的治療方法提供良好的工具。研究者們已建立小鼠、大鼠、兔子和豬等動物的后肢缺血模型[3-6]?？紤]到臨床相關(guān)性、成本、動物體積和可提供的組織材料量,鼠后肢缺血模型在以上幾類動物模型中更占優(yōu)勢[3,7]。由于小鼠有多種品系,因此比大鼠應用更為廣泛。由于大鼠和小鼠是該模型中常用的嚙齒類動物,因此本綜述只介紹大鼠或小鼠的后肢缺血模型,綜述中的鼠類特指大鼠和小鼠。1998 年Couffinhal等[8]首次使用C57BL/6 小鼠構(gòu)建的鼠后肢缺血模型,該模型是現(xiàn)階段PAD 最常用的臨床前模型[9-10],隨后又有研究者將該造模方法運用到大鼠上[11-13],該模型主要用于治療性血管新生研究或動脈形成機制探索。迄今為止,文獻記錄的大鼠或小鼠后肢缺血模型的構(gòu)建方法繁多,包括手術(shù)結(jié)扎[8]、介入栓塞[7]、光化學栓塞[14]、物理[15-16]或化學損傷[17]和Ameroid收縮器法[18],以上方法都是基于減少甚至阻斷目標后肢主要血流灌注來達到目的,因此造模后的評價也基于檢測目標后肢血流灌注變化進行。不同方法在血流灌注恢復時間窗、副作用、循環(huán)細胞因子水平、周圍組織損傷程度等多方面存在差異。這些差異會干擾實驗對血管新生或動脈形成的結(jié)果,進而無法真實的反應實驗藥物療效。除此之外,鼠的品系、性別、年齡、麻醉方法和手術(shù)方式也會對模型本身血管新生或動脈形成造成影響[19-23]。

本綜述旨在總結(jié)現(xiàn)有的鼠后肢缺血模型造模和評價方法,對常見造模方法的優(yōu)缺點進行比較。同時分析可能對模型產(chǎn)生影響的因素,以供后續(xù)研究選擇合適的造模方法或進行優(yōu)化提供參考。

1 鼠后肢動靜脈解剖概述

鼠腹主動脈分支出左右髂總動脈,髂總動脈向遠端又依次分支出臀前動脈、臀后動脈、髂股動脈、髂外動脈和髂內(nèi)動脈。其中髂外動脈是鼠后肢的主要供血動脈,髂外動脈經(jīng)過腹股溝韌帶后移形為股總動脈。股總動脈向遠端依次分支出旋股外側(cè)動脈和近側(cè)股動脈,并最終分出隱動脈和腘動脈。臀前動脈和臀后動脈為股二頭肌供血,髂股動脈和旋股外側(cè)動脈為股四頭肌供血。髂內(nèi)動脈分支處股深動脈和近側(cè)股動脈為后肢內(nèi)收肌群供血。隱動脈及腘動脈向遠端多次分支為足部供血[24-26]。相應的靜脈伴動脈同行(見圖1)。

圖1 鼠后肢動靜脈及其供血肌肉解剖示意圖Figure 1 Anatomy schematic diagram of murine hind limb arteries,veins and their blood-supplying muscles

2 現(xiàn)有造模方法

鼠PAD 模型分為急性后肢缺血模型和亞急性后肢缺血模型。兩種類型的后肢缺血模型采用了不同的造模方法。其中,鼠后肢急性缺血模型的造模方法眾多,是研究PAD 使用最廣泛的鼠類模型[18]。而相比之下鼠后肢亞急性缺血模型造模方法單一,僅有一種造模方法。

2.1 急性后肢缺血模型

鼠急性后肢缺血模型通常是通過快速閉塞后肢動脈構(gòu)建。后肢動脈的閉塞常通過結(jié)扎、電凝、介入栓塞、光化學栓塞和物理或化學損傷等手段來完成。以上不同的急性后肢缺血模型造模方法之間有著很大不同,并且同一造模方法下也可能存在著數(shù)種不同的造模方式。

2.1.1 鼠后肢動脈結(jié)扎

鼠后肢動脈結(jié)扎是PAD 研究中使用最廣泛的造模方法。該方法通常從鼠一側(cè)后肢內(nèi)側(cè)切口,暴露后肢動脈并于結(jié)扎后離斷以達到后肢缺血。另一側(cè)后肢作為對照用于造模評價中的對比而不進行手術(shù)操作。鼠后肢動脈結(jié)扎因結(jié)扎方式、結(jié)扎次數(shù)、結(jié)扎位置以及離斷與否而存在著多種不同的造模方式,同時也因上述因素造成了鼠后肢缺血模型血流恢復和血管新生模式的差異。

根據(jù)結(jié)扎方式的不同可分為不可吸收尼龍線結(jié)扎法和電凝閉塞法。而根據(jù)結(jié)扎次數(shù)可分為單次結(jié)扎和雙重結(jié)扎,也就是指結(jié)扎后肢動脈中的一支或兩支,如單次股動脈結(jié)扎和股動脈與髂總動脈雙重結(jié)扎。雙重結(jié)扎比單次結(jié)扎造成的后肢缺血更嚴重,恢復時間也會更長。當然,不同的結(jié)扎位置也導致鼠后肢缺血情況的差異?，F(xiàn)有的手術(shù)方法通常側(cè)重于髂動脈[27]、股動脈及其分支的結(jié)扎[8],其中部分手術(shù)方法對目標動脈周圍靜脈和神經(jīng)進行了剝離[28-30]。還有,對于雙重結(jié)扎后是否離斷兩結(jié)扎部位間的血管,決定了模型的實驗用途,如股動脈雙重結(jié)扎離斷術(shù)后的模型就不適用于評估動脈生成,但十分適合用于評估缺血性遠端組織的血管生成。

根據(jù)結(jié)扎方式、結(jié)扎次數(shù)、結(jié)扎位置和離斷與否對現(xiàn)有的鼠后肢動脈結(jié)扎模型進行分類,其方法主要包括單次股動脈電凝或結(jié)扎[11,31-33]、單次髂總動靜脈電凝或結(jié)扎[30,34]、單次髂總動脈電凝或結(jié)扎[11,31,35]、股動脈與髂總動脈雙重電凝[31,36]、股動脈雙重電凝或結(jié)扎離斷[8,12,31,35]以及髂外動靜脈和股動靜脈雙重結(jié)扎離斷術(shù)[23,37](見圖2)。這6 種手術(shù)除了結(jié)扎方式、結(jié)扎次數(shù)、結(jié)扎位置以及離斷與否不同外,手術(shù)操作手法基本相似,都是從腹部或腹股溝附近進行切開,暴露并游離出目標血管進行操作。該造模方法所使用的鼠類較為廣泛,包括C57BL/6 小鼠[8,31,34]、C57BL/6 遺傳背景的基因敲除小鼠[30-31,33,35]、BALB/c 小鼠[38]、Lewis 大鼠[12]和Wistar 大鼠[11,13]。根據(jù)不同的PAD 類型,研究者還會在鼠動脈結(jié)扎前對其進行干預已達到接近臨床疾病,如下肢動脈硬化閉塞癥模型會使用高脂高能飼料喂飼載脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)基因敲除小鼠后手術(shù)[39],以及糖尿病性下肢缺血會先建立糖尿病鼠模型后再手術(shù)[13]。

圖2 不同手術(shù)方法簡圖Note.A.Brief schematic illustration of vascular anatomy in the murine hindlimb.B.Single electrocoagulation or ligation of femoral artery.C.Single electrocoagulation or ligation of common iliac artery and vein.D.Single electrocoagulation or ligation of the common iliac artery.E.Double electrocoagulation or ligation of common iliac and femoral artery.F.Double electrocoagulation or ligation of femoral artery with dissection.G.Double ligation and dissection of external iliac artery and vein and femoral artery and vein.The black bar indicates the cut or stripped sites of the vessels.Figure 2 Schematic illustration of various surgical methods

2.1.2 介入栓塞

介入操作也因其創(chuàng)傷較小,對實驗動物整體及局部影響較弱而備受關(guān)注。在鼠后肢缺血模型中,已有不少研究使用介入栓塞的方法進行造模。其中大鼠因下肢動脈管腔較粗,容易行介入操作,頗受研究者的青睞,如Lewis 大鼠[7]和SD 大鼠[40]于既往文獻中被用來造模。介入栓塞法是通過鼠頸動脈將導管送入,在造影引導下至髂動脈和尾部上腹部上動脈間,注射栓塞劑對局部血管進行栓塞以造成組織缺血。既往用作栓塞劑的有水凝膠線[7]、聚乙烯醇顆粒[40-41]和N-丁基氰基丙烯酸酯[40]。其中,水凝膠線是介入栓塞中使用最廣泛的栓塞劑。

2.1.3 光化學栓塞

光化學栓塞是通過光化學反應誘導的后肢血栓形成,進而造成后肢缺血的一種新型造模方法。既往文獻使用ICR 小鼠[14,42]和Wistar 大鼠[43],通過給鼠尾靜脈注射光敏劑,再使用特定光源照射一段時間后誘導局部動脈血栓形成。常用的光敏劑有赤蘚紅B 和孟加拉玫瑰紅,注射上述光敏劑后分別使用冷白光或過濾綠光照射小鼠目標動脈30～40 min 誘導血栓形成[14,42-43]。光敏劑可損害血管內(nèi)皮并在照明后的最初幾分鐘內(nèi)誘導局部血小板聚集而形成血栓。該方法可以通過改變光束位置、強度和光敏劑濃度來控制血栓大小及位置[44]。

2.1.4 化學損傷

Kurz等[17]首次使用SD 大鼠驗證了氯化鐵直接作用于動脈表面會迅速誘導動脈內(nèi)富含血小板的血栓形成。在氯化鐵的刺激下通常會進展為完全性血栓閉塞,進而完成后肢缺血模型造模[45]。一般在解剖顯微鏡下,在目標動脈上包裹一塊浸泡過氯化鐵(10%～ 50%)的濾紙(約1～ 2 mm)。濾紙包裹動脈時長約為3 min,隨后取下[46]。此時動脈內(nèi)血栓逐漸形成,最終導致血管完全閉塞。既往文獻中也曾使用基因敲除小鼠進行造模,如P2Y12 基因敲除小鼠[46]和白細胞相關(guān)免疫球蛋白樣受體基因敲除小鼠[47]。

2.1.5 物理損傷

現(xiàn)有的物理損傷法通常包括機械損傷和電損傷,二者都是通過物理手段對動脈血管壁造成損傷,繼而誘發(fā)血小板黏附和附壁血栓形成。機械損傷使用柔性導絲在血管內(nèi)部旋轉(zhuǎn)而造成動脈內(nèi)皮損傷,隨即誘發(fā)附壁血栓形成[15,48-49]。損傷的動脈中膜平滑肌細胞丟失和壞死在造模第1 天同時發(fā)生。在隨后的14 d 內(nèi),血栓形成和血小板沉積從第1 天的100%逐漸衰減到25%。該模型通常使用蛋白酶受體-1 缺乏的轉(zhuǎn)基因小鼠,用于研究細胞增殖和中膜增厚[49];另一種物理損傷是由微電凝器產(chǎn)生穿透動脈血管壁的電流對動脈血管壁造成損傷,隨后誘導由血小板和纖維蛋白形成混合血栓[16,50]。既往電損傷模型使用過C57BL/6 小鼠[16]和ApoE基因敲除小鼠[50]。

2.2 亞急性后肢缺血模型

鼠后肢亞急性缺血模型使用Ameroid 收縮器進行造模[18,51]。Ameroid 收縮器由不銹鋼外殼包裹,內(nèi)層是酪蛋白的環(huán)狀物。酪蛋白是一種吸濕性物質(zhì),吸收體液后會緩慢膨脹。不銹鋼外層迫使酪蛋白向內(nèi)膨脹,最終阻斷目標動脈血流[52]。在鼠后肢亞急性缺血模型中Ameroid 收縮器通常于1～ 10 d內(nèi)逐漸關(guān)閉[53]。在暴露并剝離出目標血管后,選擇合適尺寸的Ameroid 收縮器固定在血管上即可完成造模。既往文獻中使用了C57BL/6 小鼠[51,53]、BALB/c 小鼠[54]或C57BL/6 遺傳背景的基因敲除小鼠[53,55]。

3 鼠后肢缺血模型常見評價方法

鼠后肢缺血模型的造模評價通?；谟^察目標肢體血流灌注的變化。對于急性后肢缺血模型的造模評價,通常在造模后立即對目標后肢進行血管檢查或血流灌注檢測,并與對側(cè)后肢(未行造模操作側(cè))作對比。而亞急性后肢缺血模型往往在造模后的2 周內(nèi)進行多次檢測來評價模型動物。常見的評價方法如下。

3.1 激光多普勒灌注成像

激光多普勒灌注成像是基于激光和紅細胞之間的相互作用引起的多普勒頻移被記錄并轉(zhuǎn)換為電信號上進行分析的結(jié)果[56]。該技術(shù)能夠用于監(jiān)測人體或動物組織血流灌注的情況。激光多普勒灌注成像作為一種非侵入性的組織血流灌注檢測方法,在同種實驗條件下具有較高的一致性和可重復性,是使用最為廣泛的評價鼠下肢缺血模型的方法[22,26,56-57]。

3.2 微型計算機斷層掃描

微型計算機斷層掃描是一種3D X 射線成像技術(shù),該技術(shù)與臨床常見的CT 掃描方式相同,有著掃描尺度小、分辨率高、重復性高的特點,對于微小而精細的結(jié)構(gòu)能夠?qū)崿F(xiàn)體內(nèi)高分辨率成像[58-59]。

3.3 核磁共振成像

核磁共振成像同樣也能評價鼠后肢缺血模型的造模效果,其中最常用的就是對比增強核磁共振血管成像(contrast enhanced magnetic resonance angiography,CE-MRA)和時間飛躍法(time of flight,TOF)[40,60]。其中,CE-MRA 是需要注射釓造影劑后實現(xiàn)核磁共振血管成像,而TOF 則不需要額外注射造影劑即可完成血管成像。

3.4 單光子發(fā)射計算機斷層成像術(shù)

Hendrikx等[61]發(fā)現(xiàn)基于放射性同位素示蹤劑的單光子發(fā)射計算機斷層成像術(shù)(Single-Photon Emission Computed Tomography,SPECT)能夠用于鼠后肢的血流灌注檢測。SPECT 是無創(chuàng)、高分辨率、高重復性的檢測方法,但該檢測方法對設(shè)備條件要求較高且操作難度較大使其不能被廣泛使用。

3.5 其他

除了上述的4 種評價方法,還有新興的對比增強超聲技術(shù)[62]、空間頻域成像技術(shù)[63]以及吲哚菁綠標記的熒光實時顯影技術(shù)[38,64]等技術(shù)也用于鼠后肢缺血模型造模評價中,且效果良好。

4 各種造模方法的優(yōu)劣對比

鼠后肢動脈結(jié)扎作為使用最廣泛的鼠后肢缺血模型有著眾多不可忽視的優(yōu)點。該方法適用于實驗室條件要求不高、操作簡單的科研環(huán)境,并可參考已發(fā)表的論文以獲取詳細的操作流程或完整的操作視頻。同時,此法易于找到目標動脈(尤其是股動脈),死亡率低[65]。這對于初次接觸或尚不熟悉動物實驗的研究人員來說十分友好。但該方法因有創(chuàng)導致的局部炎癥、手術(shù)過程中的神經(jīng)刺激及靜脈創(chuàng)傷而被詬病。有研究發(fā)現(xiàn),手術(shù)導致的局部炎癥會影響血管新生相關(guān)細胞因子的水平[7]。同時,在手術(shù)操作的過程中分離股神經(jīng)、動脈和靜脈時,要避免損傷到股神經(jīng)和靜脈。由于神經(jīng)是血管內(nèi)皮生長因子的主要來源[66],在血管新生的過程中發(fā)揮著重要作用,手術(shù)時對神經(jīng)的破壞也會影響血管新生和動脈生成[67]。而股靜脈受到損傷后,有可能造成致命性的出血,雖然部分小靜脈的出血可以通過壓迫法進行止血,但大靜脈的撕裂往往更難止血且常造成不良結(jié)果。不過,部分研究者建議同時結(jié)扎動靜脈,以避免造成靜脈損傷并提高可重復性[32,37]。

而介入栓塞法和光化學栓塞法在根本上擺脫了鼠后肢動脈結(jié)扎法中出現(xiàn)的局部炎癥、神經(jīng)損傷和靜脈損傷的干擾,保持了組織的完整性,降低了炎癥反應及感染的風險。然而,這兩種方法對實驗室條件、實驗人員技術(shù)和資金都有更高的要求。介入栓塞要求實驗人員要熟悉鼠的循環(huán)系統(tǒng)解剖,并且在造模的過程中還要承擔輻射的風險。介入栓塞學習難度高,造模時間相對較長,難以多人同時開展造模,該方法對需要大批量造模的實驗來說并非最佳選擇。光化學栓塞作為無創(chuàng)的血管閉合造模方法,具有高度的重現(xiàn)性[14]。相比于動脈結(jié)扎模型,光化學誘導模型血流恢復相對較慢,提供了更長的治療時間窗和更穩(wěn)定的缺血模型。而動脈結(jié)扎法快速灌注恢復,讓血管新生因額外治療還自身改善這個問題變得模糊不清。有研究觀察到,光化學栓塞誘導的鼠后肢缺血模型中,鼠的癥狀表現(xiàn)隨著時間推移而逐漸出現(xiàn)組織變色、壞疽和截肢,與臨床病例的病程演變過程有著較高的契合性[14]。同時,注射到鼠體內(nèi)的光敏劑不會對器官功能產(chǎn)生影響,鼠存活率高。但該方法實驗因沒有對光源照射的強度和大小作出統(tǒng)一的要求,后續(xù)仍需進一步造模優(yōu)化。

化學損傷法通過氯化鐵溶液誘導動脈內(nèi)血栓形成,從而避免了離斷或結(jié)扎等手術(shù)方法造成的額外血管和周圍組織損傷。同時,該造模過程不需要使用特殊設(shè)備誘導血栓形成。該方法誘導的血栓由血小板富集而成,在解剖顯微鏡下和人類動脈血栓十分相似[45]。

物理損傷法中的機械損傷法在理論上可用于下肢動脈缺血的造模,但既往研究大多將其應用于內(nèi)皮剝脫和中膜損傷血管中的研究[68]。對于機械損傷法誘導的下肢動脈缺血的運用,有待于進一步評價并制定相關(guān)的標準化操作流程,以提高造模的一致性。而電損傷法最初用于觀察血管新內(nèi)膜形成的動物模型。隨后再狹窄研究中的血管中膜增厚也常通過該方法進行造模[16]。由于對初始血凝塊形成進行標準化可能性較低,并且整個血管壁存在大量壞死,因此該模型不太適合用作新藥療效評估的血栓形成[3]。

Ameroid 收縮器法作為亞急性后肢缺血模型雖然是慢性下肢缺血的不完美模型,但也填補了非急性后肢缺血模型的空白。該法也存在著一些不足:首先,Ameroid 收縮器比介入栓塞法造?；ㄙM少,但相較于傳統(tǒng)動脈結(jié)扎法更昂貴;其次,Ameroid 收縮器如果插槽太淺,動脈可能會在收縮期間擠出,導致造模失敗;而酪蛋白在收縮器內(nèi)分布不均勻會導致閉塞率加快而失去慢性閉塞的意義[9];最后,該方法誘導的后肢反應與急性后肢缺血模型不同,逐漸閉塞的動脈與相應的側(cè)枝代償使得難以觀察到遠端肢體的缺血和血管新生,并且相較于急性后肢缺血模型,該模型后肢中剪切應力反應基因和炎癥基因缺乏上調(diào)[69]。由此可見,該模型仍需更多的研究來進行優(yōu)化和改進。

5 造模中的影響因素

對于后肢缺血模型造模方法導致的差異需要重視外,造模中其他因素的影響也不可輕易被忽略,否則會造成實驗結(jié)果的偏差。首先,不同品系的鼠擁有完全不同的血流灌注恢復模式。Helisch等[20]觀察了C57BL/6、BALB/c 和129S2/Sv 三種品系的小鼠在雙重股動脈結(jié)扎術(shù)后當天、第7、14、21和28 天時血流灌注,側(cè)枝的形成以及運動耐力的情況。結(jié)果表明原有的側(cè)枝血管系統(tǒng)遺傳差異會影響股動脈閉塞后代償性側(cè)枝動脈生長的結(jié)果和組織環(huán)境[20]。其次,鼠的性別也會對模型本身造成影響。有研究發(fā)現(xiàn)C57BL/6J 的雌性小鼠在動脈結(jié)扎手術(shù)后7 d 血流灌注恢復比雄性小鼠低,這可能由雌性小鼠后肢側(cè)枝重構(gòu)減少、血管生成減少、血管舒張反應受損和血管收縮活性增加所致[21]。并且,鼠的年齡會影響缺血恢復的速度。幼年(6～ 8 周齡)鼠比老年(8～ 10 月齡)鼠血流灌注恢復更快、更完整。對于促血管新生的研究,老年鼠是最佳選擇,因為可能在治療干預后觀察到不同組之間更為顯著的差異。而對于抗血管新生的研究,應優(yōu)先選擇幼年鼠來更好的呈現(xiàn)實驗結(jié)果[23]。鼠的麻醉方法也會影響造模。有研究表明α-激動劑可能誘導早期外周血管收縮從而對實驗結(jié)果造成干擾[19]。氯胺酮和α-激動劑的聯(lián)合使用不適用于富含血管平滑肌細胞血管系統(tǒng)的研究[22]。

6 總結(jié)及展望

總的來說,現(xiàn)有的鼠后肢缺血模型的造模方式較為多樣,可供不同實驗室條件及不同需求的研究者進行選擇。而實驗動物的選擇,應根據(jù)實驗需求選擇使用合適類型的大鼠或小鼠,若使用不同于既往文獻的大鼠或小鼠類型,可通過預實驗探索可行性。但應注意如何選擇與自身研究方向更為契合的造模方法才是最重要的。同時,現(xiàn)有的鼠后肢缺血造模方式仍不完美,對于后肢慢性缺血模型的構(gòu)建仍在探索。當下的造模方式無法很好的復刻臨床PAD 患者的病理基礎(chǔ)和病程進展。并且,現(xiàn)有的方法缺乏統(tǒng)一的標準,部分造模方法仍需要進一步的優(yōu)化。