數(shù)字PCR 芯片的熒光圖像處理與分析*

朱飛彪 汪 磊 朱 靈 鄭賢鋒

（1.安徽師范大學(xué)物理與電子信息學(xué)院 蕪湖 241000）

（2.中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院安徽光學(xué)精密機械研究所 合肥 230031）

1 引言

隨著微納米制造技術(shù)和微流控技術(shù)的不斷進步，微腔式數(shù)字PCR芯片體積更小、通量更大、成本更低。數(shù)字PCR 技術(shù)和傳統(tǒng)的實時熒光定量PCR技術(shù)相比，將檢測靈敏度提高至單個核酸分子，直接通過分析終點熒光圖像的熒光信號值實現(xiàn)核酸分子的絕對定量［2］。

通常，利用網(wǎng)格對微反應(yīng)腔室進行劃分和定位，然后對每個腔室的熒光信號進行判斷，統(tǒng)計陽性熒光點。由周淑芳等提出，先人為確定熒光圖像中三個頂角微反應(yīng)腔室的中心位置，利用最大化引力方程進行修正，基于投影法實現(xiàn)圖像的網(wǎng)格劃分和中心定位，根據(jù)定位實現(xiàn)圖像拼接和陽性腔室識別［3］，對于信號較弱或者陰性腔室比例大的圖像可能造成網(wǎng)格劃分不準(zhǔn)的情況，而且需要手動輔助操作。許靜等提出通過計算提取的輪廓周長，并設(shè)置雙閾值篩選出陽性腔室［4］，該方法對于腔室之間或者腔室與污點之間存在粘連的情況，易將陽性腔室錯誤地排除，引起結(jié)果的誤差。

針對上文提到方法的不足，本文提出通過形態(tài)學(xué)處理將粘連的陽性腔室分開并去除非目標(biāo)小顆粒噪聲，然后用連通域標(biāo)記的方法對陽性信號點進行統(tǒng)計，同時為了減小噪聲對結(jié)果的影響，分別對每一連通域求面積，從所有連通域中剔除面積較小的，剩下的連通域個數(shù)作為陽性熒光信號點的最終數(shù)量，并且不需要對每個腔室進行精確定位處理，也不需要人工干預(yù)。

2 數(shù)字PCR芯片熒光圖像處理方法

本文數(shù)字PCR芯片熒光圖像處理過程包括：首先對采集到的熒光圖像使用加權(quán)平均值法進行灰度處理，基于SURF 算法對熒光圖像進行拼接，然后對拼接后的熒光圖像灰度化處理，通過中值濾波法對圖像進行濾波降噪，之后，基于大津法對圖像進行閾值分割獲得二值化圖像，繼而通過形態(tài)學(xué)處理方法對二值化圖像進行處理，消除陽性腔室之間的粘連同時消除非目標(biāo)小顆粒噪聲，最后基于連通域標(biāo)記法實現(xiàn)對陽性腔室的識別和統(tǒng)計。

2.1 熒光圖像拼接

2.1.1 圖像預(yù)處理

首先把拍攝到的熒光圖像依次從文件夾中讀取出來。采集到的原始圖像通常包含了大量的色彩信息，圖像灰度化可以在保證圖像整體色彩及亮度等級分布特征與彩色圖像描述一致的前提下，有效縮減后期處理的信息量，圖像處理和識別的速度能夠大大提升。本文采用加權(quán)平均值法對原始圖像進行灰度化處理，該處理方法原理是將三通道RGB的灰度值按一定比例相乘，然后將其得到的灰度值相加在一起。數(shù)學(xué)公式如下：

其中，(i,j) 表示圖像中像素點的坐標(biāo)，R(i,j) ，G(i,j) ，B(i,j) 分別表示該像素的紅綠藍(lán)分量，Gray(i,j)表示灰度化后像素的灰度值。

2.1.2 圖像拼接

在用生物相機拍攝數(shù)字PCR 芯片的熒光圖像時，由于攝像機的像素是一定的，當(dāng)拍攝的范圍越大時，拍攝得到的熒光圖像的分辨率就會越低，另外，攝像機鏡頭在成像時會存在一定的像差，導(dǎo)致圖像在靠近中心的位置比較清晰而在靠近邊緣的位置就比較模糊。鑒于所述原因，通過多次拍照然后經(jīng)過圖像拼接技術(shù)解決視場和分辨率矛盾的問題以及減小像差對圖像質(zhì)量的影響問題。

基于特征信息的圖像配準(zhǔn)方法和基于灰度信息的圖像配準(zhǔn)方法是常用的兩種圖像配準(zhǔn)方法［5］?；诨叶鹊膱D像配準(zhǔn)方法對圖像的每一像素點的依賴性都很強，算法的計算量非常大，因此效率較低，基于特征信息的圖像配準(zhǔn)方法在很大程度上能夠克服這個缺點［6］。本文利用SURF（Speeded up robust features，快速魯棒特征）算法對待拼接的圖像進行特征點的提取和特征點的匹配。具體拼接過程如下。

1）特征點檢測

SURF算法的特征點檢測是基于尺度空間理論的，通過計算圖像所有像素Hessian 矩陣行列式的極值點來定位特征點所在的位置［7］，假設(shè)一個圖像的函數(shù)為f（x，y），圖像中的點為（x，y），在σ的尺度下，其Hessian矩陣定義為

其中：LXX(x,σ)，Lxy(x,σ)，Lyy(x,σ)是圖像f（x，y）上的點（x，y）與高斯函數(shù)二階微分在點（x，y）處的卷積。

為了降低計算量提高運算速度，在特征點提取過程中使用9*9 的盒狀濾波器代替σ＝1.2 的二階高斯濾波器，方框塊波模板同圖像卷積后的值分別為Dxx、Dxy、Dyy［8］，那么Hessian矩陣可以簡化為

通過使用圖像金字塔實現(xiàn)圖像的尺度空間的構(gòu)建，在響應(yīng)圖像上采用非極大值抑制（non-maximum suppression，NMS）的方法在圖像中初步定位特征點［9］。由于離散化，前面所檢測到的特征點的位置往往并不是精確的位置，因此還要應(yīng)用泰勒級數(shù)展開式來進行插值計算，通過三維線性插值法對候選特征點進行亞像素級定位，同時刪除低于閾值的點，得到精確定位的特征點。

2）特征點描述

通過識別特征點的主方向讓圖像的特征點獲得旋轉(zhuǎn)不變性。首先加權(quán)計算以特征點為圓心，6σ（σ為特征點所在的尺度值）為半徑的圓形鄰域內(nèi)的點在x和y方向的Haar 小波響應(yīng)，然后統(tǒng)計60°扇形區(qū)域內(nèi)全部點的水平和垂直haar小波響應(yīng)值總和，遍歷整個圓形區(qū)域后，將最大值所在扇區(qū)域的方向作為該特征點的主方向［10］。

在確定特征點的主方向以后，沿主方向以特征點為中心構(gòu)建邊長為20σ×20σ的正方形區(qū)域并劃分為4×4 個子區(qū)域，計算每個子區(qū)域5×5 個采樣點相對于主方向的水平和垂直方向的Harr 小波響應(yīng)值，分別計為dx和dy，并賦予不同的高斯權(quán)重系數(shù)，然后對響應(yīng)值進行統(tǒng)計（∑dx，∑dy，∑|dx|，∑|dy|）得到四維的特征向量［11］，那么所有子區(qū)域向量就構(gòu)成了該特征點的4×4×4=64維的SURF特征描述向量。

3）特征點匹配

對特征點的匹配采用特征點特征向量的歐氏距離作為兩幅圖像中特征點的相似性判定度量，在第二幅圖像中找出與第一幅圖像中特征點歐式距離最近和次近的兩個特征點，如果最近距離與次近距離的比值小于比例閾值，就把距離最近的這一對特征點作為匹配點［12］。然后采取RANSAC（Random Sample Consensus，隨機采樣一致性）算法剔除誤匹配點。

4）圖像融合

用匹配點對計算仿射變換模型參數(shù)，然后根據(jù)仿射變換模型對熒光圖像進行拼接融合，最終獲得熒光圖像全景圖像。

圖1 是對數(shù)字PCR 芯片拍攝的三幅熒光圖像，圖像之間存在一定的重疊部分，圖2 就是拼接之后的芯片熒光全景圖像，拼接后的圖像沒有接縫而且信息完整。

圖1 原始熒光圖像

圖2 拼接后圖像

2.2 陽性腔室的識別和統(tǒng)計

2.2.1 閾值分割

通常，在獲取圖像和傳輸圖像的時候難免會被各種噪聲污染，引起圖像質(zhì)量的變差，影響圖像進一步的處理和分析，為了降低后期圖像處理的難度同時提高數(shù)據(jù)的精度，要在盡量保持圖像中目標(biāo)不改變的情況下對噪聲進行抑制。本文采用中值濾波法對圖像進行降噪，中值濾波法是常用的非線性濾波方法，可以有效地消除圖像中的椒鹽噪聲，而且對高斯噪聲也有一定的抑制作用，并能夠很好地保留圖像邊緣信息，降噪效果較為理想［13］。

圖像的閾值分割是一種在數(shù)字圖像處理過程中應(yīng)用較為廣泛的的圖像分割技術(shù)，它利用了圖像中要提取的目標(biāo)物與其背景在灰度特性上的差異，按照一定的規(guī)則在數(shù)字圖像中確定一個最佳的灰度值作為閾值，把每一個像素點的灰度值與所確定的閾值相比較，通過判斷將圖像分割成目標(biāo)和背景兩部分，從而產(chǎn)生相應(yīng)的二值圖像［14］。假設(shè)確定了圖像f（x，y）的閾值為T，那么閾值分割后的圖像g（x，y）為

圖像的閾值分割不僅能夠大大減少圖像在后續(xù)處理和分析過程中的數(shù)據(jù)量，進一步提高處理的運算速度，而且使得目標(biāo)區(qū)域的特征信息更加顯著，降低圖像中目標(biāo)辨識的復(fù)雜性，提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。

閾值分割法分為全局閾值分割法和局部閾值分割法，全局閾值分割法指的是使用同一個閾值對整幅圖像進行分割處理，該方法適用于前景和背景的對比度比較明顯的圖像［15］。而局部閾值分割法指的是不同區(qū)域的目標(biāo)和背景的對比度是不同的，不同區(qū)域選擇不同的閾值將目標(biāo)物體與背景分開。拼接后的數(shù)字PCR熒光圖像被灰度處理后，圖像中的陽性腔室和非陽性腔室（陰性腔室以及其他區(qū)域）之間具有不同灰度級，而且目標(biāo)和背景的對比度較高，采用全局閾值分割拼接后的熒光圖像較為合適。

最大類間方差法（大津法）是一種自適應(yīng)的閾值分割方法，原理簡單，容易實現(xiàn)，而且對于對比度較高的圖像處理效果非常好［16］，所以本文選擇該方法對圖像進行閾值分割處理，分割后的結(jié)果如圖3所示。

圖3 二值化圖像

2.2.2 形態(tài)學(xué)處理

通常，由于在制作數(shù)字PCR 芯片時，會受到加工條件，加工工藝等因素的影響，可能會導(dǎo)致部分腔室之間距離較小甚至粘連在一起，另外，在用生物相機拍攝熒光圖像時，可能會受到相機本身或外界噪聲的干擾，拍攝角度等因素的影響，最終使得熒光圖像中的部分相鄰腔室的熒光存在交疊，使得二值化圖像中不同的目標(biāo)區(qū)域形成連通區(qū)域，進而影響數(shù)字PCR熒光圖像中陽性單元的統(tǒng)計。

數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)處理包含膨脹操作和腐蝕操作［17］，本文先對圖像采用腐蝕操作，如圖4 所示，消除了二值化圖像中不同腔室之間的粘連，同時消除部分面積較小的孤立噪聲點，使得接下來的處理更加簡單，也進一步提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性。

圖4 形態(tài)學(xué)處理后的圖像

2.2.3 陽性腔室統(tǒng)計

通常，一幅圖像是由很多像素構(gòu)成的，連通域是指圖像中具有相同像素值且位置相鄰的目標(biāo)像素點組成的圖像區(qū)域，根據(jù)判別的鄰域不同一般分為4 連通域和8 連通域［18］。經(jīng)過前面一系列的處理，數(shù)字PCR 熒光圖像已經(jīng)被二值化，并且熒光圖像中粘連的反應(yīng)腔通過形態(tài)學(xué)處理也已經(jīng)被分開，每一個陽性腔室分別成為單個的連通域。

連通域標(biāo)記法原理簡單易于實現(xiàn)，并且計算速度快，因此本文采用8 連通域的連通域標(biāo)記法識別并標(biāo)記熒光圖像中的各個連通域。通過對圖像中連通域的計數(shù)進而統(tǒng)計出連通域的個數(shù)，最終獲得數(shù)字PCR 芯片熒光圖像中陽性腔室的數(shù)量。為了避免較大污點以及在形態(tài)學(xué)處理時產(chǎn)生多余的連通域，使得最終結(jié)果產(chǎn)生誤差影響后續(xù)分析，在標(biāo)記所有的連通域之后，統(tǒng)計每個連通域的像素值，剔除像素較小的連通域。陽性腔室統(tǒng)計完成之后，根據(jù)泊松分布原理就可以計算出原始樣本的模板拷貝數(shù)，最終實現(xiàn)核酸的精確定量。

3 實驗結(jié)果分析

經(jīng)過對數(shù)字PCR 芯片熒光圖像的一系列操作之后，就能實現(xiàn)對所有陽性腔室的識別和統(tǒng)計，可以按照連通域掃描到的位置信息在原始圖像上標(biāo)記出所統(tǒng)計過的陽性腔室，如果標(biāo)記的位置就是陽性腔室所在的位置，那就說明對陽性腔室連通域的識別是準(zhǔn)確的。如圖5 所示就是用“+”標(biāo)記后的圖像局部放大圖，從圖中可以看出，本文的處理識別方法能夠準(zhǔn)確地剔除污點，同時能夠準(zhǔn)確地區(qū)分粘連的腔室，實現(xiàn)了陽性腔室的精確識別。

圖5 局部放大圖像

為了進一步地驗證本文所提出處理和統(tǒng)計方法的準(zhǔn)確性，在用本文方法對熒光圖像統(tǒng)計過后，我們通過常用的一款圖像分析軟件ImageJ 對同一幅熒光圖像進行分析，統(tǒng)計出陽性腔室的數(shù)量，如圖6 所示兩者結(jié)果一致，表明本文采用的方法可以對數(shù)字PCR 芯片熒光圖像信號的精確識別和統(tǒng)計。另外，在整個處理過程中，用ImageJ 處理的每一步都需要人工操作，而使用本文方法無需人工干預(yù)，操作更加簡便。

圖6 本文方法統(tǒng)計結(jié)果和ImageJ統(tǒng)計結(jié)果

4 結(jié)語

本文根據(jù)數(shù)字PCR芯片熒光圖像的特點，提出通過連通域標(biāo)記法對陽性信號進行識別和統(tǒng)計，首先利用SURF 算法實現(xiàn)熒光圖像的拼接，通過灰度處理和閾值分割對圖像進行二值化處理將陽性信號點從陰性區(qū)域和背景中提取出來，然后通過形態(tài)學(xué)處理把彼此粘連的陽性信號點分開，最后通過對形態(tài)學(xué)處理后的二值化圖像進行連通域掃描和識別，最終實現(xiàn)陽性信號點的統(tǒng)計。實驗結(jié)果表明，本文處理方法簡單可靠，另外，該處理思想和方法同樣可以應(yīng)用于細(xì)胞計數(shù)等領(lǐng)域。