膀胱癌類器官模型的研究進展

孫曉宇，張志宏綜述，張昌文 審校

（天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科，天津 300211）

膀胱癌是一種高度異質(zhì)性的惡性腫瘤，其中3/4為高復(fù)發(fā)率、預(yù)后較好的非肌層浸潤性膀胱癌（non-muscle invasive bladder cancer，NMIBC），1/4為高轉(zhuǎn)移率、預(yù)后較差的肌層浸潤性膀胱癌（muscle invasive bladder cancer，MIBC）[1]。盡管如今基于腫瘤分子分型進行靶向治療或者免疫治療等方面取得了極大進步，但近30%的NMIBC 進展為MIBC，患者5 年總生存率（overall survival，OS）僅為50%[2]。這與膀胱癌的高度異質(zhì)性、較高的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率和耐藥性有關(guān)。

隨著精準醫(yī)療的不斷發(fā)展，亟需建立更有針對性的個體化治療體系，新興的體外三維培養(yǎng)類器官模型應(yīng)運而生。類器官是將胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）、誘導(dǎo)多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）或成體干細胞（somatic stem cells，SSCs）經(jīng)過體外培養(yǎng)基培養(yǎng)，干細胞通過自我組織形式形成多種細胞類型組成的三維器官型結(jié)構(gòu)[3-5]。與傳統(tǒng)的二維腫瘤細胞系及人源腫瘤異體移植瘤（patient-derived xenograft，PDX）模型相比，類器官模型可以很好的保留腫瘤組織的異質(zhì)性和更真實的腫瘤微環(huán)境，為腫瘤研究提供了良好的臨床前模型[6]。本文重點介紹膀胱癌類器官模型的研究進展，討論其不足以及對未來應(yīng)用前景進行展望。

1 膀胱癌類器官模型的建立

自2009 年Sato 等[7]利用富含亮氨酸重復(fù)序列的G 蛋白耦聯(lián)受體5（leucine-rich repeat containing G protein-coupled receptor 5，Lgr5）陽性的腸道干細胞在添加Wnt 通路激動劑R-spondin、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）抑制劑Noggin、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）等生長因子的基質(zhì)膠培養(yǎng)基中培養(yǎng)出具有隱窩絨毛結(jié)構(gòu)的腸道類器官后，類器官技術(shù)有了突破性的進展。胃[8]、汗腺[9]、大腦[10]、乳腺[11]等人源類器官逐步建立。近5 年基于膀胱癌類器官模型的研究也相繼發(fā)表（表1）。除了人源性膀胱癌類器官外，PDX 類器官也已構(gòu)建成功[12-19]。2018 年Lee 等[12]建立了22個膀胱癌類器官系組成的膀胱癌類器官生物樣本庫，并通過外顯子及全基因組測序證實了膀胱癌類器官與原發(fā)腫瘤組織病理學(xué)特征、體細胞突變和DNA 拷貝數(shù)改變等特征保持高度一致。同時在一定程度上闡述了膀胱癌類器官自身的進化特點，為膀胱腫瘤異質(zhì)性研究提供了參考。2019 年，Mullenders等[20]從53 例患者樣本中培養(yǎng)成功133 個膀胱癌類器官，并發(fā)現(xiàn)成纖維細胞生長因子（FGF）7和FGF10 可以促進膀胱癌類器官的增殖，進而對培養(yǎng)基進行了優(yōu)化。人類癌癥模型組織（Human Cancer Models Initiative，HCMI） 建 立 了 類 器 官 生 物 庫（https：//ocg.cancer.gov/programs/HCMI），可獲取現(xiàn)有類器官的基因和臨床信息。

表1 膀胱癌類器官模型的文獻回顧

2 膀胱癌類器官模型的應(yīng)用

2.1 腫瘤機制研究 Shen 等[27]利用膀胱癌類器官模型聯(lián)合體外和體內(nèi)實驗探索了磷酸甘油酯脫氫酶（phosphoglycerate dehydrogenase，PHGDH）的生物學(xué)功能，并驗證了PHGDH 可與聚結(jié)合蛋白2（poly（rC）-binding protein 2，PCPP2）相互作用，上調(diào)溶質(zhì)載體家族7 成員11（recombinant solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）表達，促進膀胱癌的惡性進展。Wang 等[29]建立了CRISPR-Cas9 基因編輯的膀胱癌類器官模型用以研究膀胱腫瘤耐藥問題，得出通過靶向組織蛋白酶H 進行分化是治療化療耐藥性MIBC 的潛在治療策略。Vlaar 等[18]借助膀胱癌類器官模型證明了異常芳烴受體（aryl hydrocarbon receptor，AHR）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是尿路上皮腫瘤發(fā)生的重要驅(qū)動因素。這些研究都為人們進一步理清膀胱癌發(fā)病和耐藥等過程中關(guān)鍵基因的功能提供了重要線索。

2.2 抗腫瘤藥物篩選 膀胱癌類器官模型具有高保真特性，是藥物測試的極佳模型。Mullenders 等[20]用3 個膀胱癌類器官系暴露于6 種針對膀胱癌一線化療藥物中，驗證了不同膀胱癌類器官其敏感化療藥物不同。Kita 等[14]同樣驗證了膀胱癌類器官的藥物敏感性與PDX 平行，類器官模型在快速建立、低成本和技術(shù)可行性等方面顯示出重要優(yōu)勢。

除了對化療藥物進行敏感性檢測外，Neal 等[30]建立了一種氣-液界面（air-liquid interface，ALI）培養(yǎng)類器官模型的方法來保留免疫細胞，可在7 d 內(nèi)對免疫治療藥物的功能測試。證實了在膀胱癌類器官模型中模擬腫瘤免疫微環(huán)境和對免疫檢查點抑制劑的反應(yīng)是可行的。Yin 等[31]建立了一種包含免疫微環(huán)境的腫瘤樣細胞簇模型，可在14 d 內(nèi)完成抗腫瘤藥物篩選。

2.3 生物打印 近幾年3D 生物打印技術(shù)日益成熟，促進了膀胱癌類器官模型不斷優(yōu)化。Kim 等[22]利用3D 打印技術(shù)，組建了包含肌肉層、腫瘤相關(guān)成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、免疫細胞的膀胱組裝體（assembloids）。通過該組裝體驗證了FOXA1-BMP-hedgehog 信號軸在腫瘤和基質(zhì)之間控制腫瘤可塑性的重要作用。

Yoon 等[25]利用壓電噴墨打?。╬iezoelectric inkjet printing，IJP）技術(shù)，將膀胱癌類器官解離成單個腫瘤細胞制備為生物墨水，通過噴墨打印將單個細胞精確地分配到微孔板中培養(yǎng)成類器官。驗證了IJP 技術(shù)可以有效的對細胞進行分類，對腫瘤異質(zhì)性研究具有重大意義。

2.4 微流控技術(shù) Gheibi 等[32]使用75 μm 微流體裝置可以在較長時間內(nèi)維持BC 細胞，并成功驗證了膀胱癌類器官模型的藥物反應(yīng)性和耐藥性。羅升昌等[33]借助微流控技術(shù)構(gòu)建支架系統(tǒng)，進行了腫瘤類器官的血管化及多細胞共培養(yǎng)模式的探索，為類器官模型的工程化提供了寶貴經(jīng)驗。2021 年，Serex等[34]將微流控技術(shù)和生物打印技術(shù)相結(jié)合，建立了一種能夠?qū)崟r調(diào)節(jié)細胞濃度的微流控打印頭，打印出了標準化的膀胱癌類器官，獲得了可靠和可重復(fù)的結(jié)果。

3 膀胱癌類器官模型的挑戰(zhàn)

3.1 規(guī)范標準的培養(yǎng)體系 目前全球類器官模型研究團隊大多采用從小鼠肉瘤中提取的基質(zhì)膠作為類器官的三維培養(yǎng)基質(zhì)，但其各組分卻各有特點，且具有潛在的免疫原性。因此難以通過一個統(tǒng)一的評價體系去定性定量。

有多個研究報道了在腫瘤類器官模型的構(gòu)建過程中，正常細胞的生長速度和數(shù)量超過了腫瘤細胞，在后續(xù)傳代中腫瘤類器官甚至消失[35-37]。因此亟需高選擇性的培養(yǎng)基，實現(xiàn)目標類器官的快速生長。

我國今年發(fā)布了《腫瘤類器官診治平臺的質(zhì)量控制標準中國專家共識（2022 年版》[38]，《類器官藥物敏感性檢測指導(dǎo)腫瘤精準治療臨床應(yīng)用專家共識（2022 年版）》[39]。兩部共識初步制訂了腫瘤類器官質(zhì)量及藥敏檢測相關(guān)標準。不同疾病類器官模型有其特有的特點，目前尚未有專病類器官模型的相應(yīng)規(guī)范。

3.2 血管化及共培養(yǎng)體系 盡管目前膀胱癌類器官在藥物研發(fā)、藥敏檢測等領(lǐng)域顯現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢，但缺乏維持腫瘤生長的血管系統(tǒng)、免疫細胞等是其很大的局限。目前已有多個共培養(yǎng)體系報道[6，40-41]，但仍不能完全模擬體內(nèi)腫瘤微環(huán)境。除了血管系統(tǒng)，Carroll 等[42]探索通過類器官模型在體外模擬神經(jīng)系統(tǒng)。目前多個領(lǐng)域?qū)＜以诠餐邪l(fā)含多傳感器的類器官芯片平臺，努力將生物力學(xué)及體內(nèi)微環(huán)境融入到集合類器官模型中。

4 膀胱癌類器官模型的展望

首先，膀胱癌類器官模型在腫瘤機制探索、新藥研究等方面是一種絕佳的臨床前模型。實驗動物因其價格昂貴、轉(zhuǎn)運困難及福利運動等多方面因素越來越受到制約，在未來類器官模型代替動物模型是一種趨勢。2022 年9 月29 日，美國參議院通過了食品藥品監(jiān)督管理局（food and drug administration，F(xiàn)DA）現(xiàn)代化法案（FDA Modernization Act 2.0），允許藥物研究在可行的條件下使用替代方法。類器官模型將為未來制藥行業(yè)和臨床試驗提供更有力的支持。

其次，類器官技術(shù)發(fā)展日益成熟，建立更加準確、快速、高通量、自動化的類器官模型是大勢所趨。目前高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)和基于機器學(xué)習(xí)的圖像分析[43]研究正在不斷探索。類器官模型結(jié)合染色質(zhì)開放性測序技術(shù)（assay for transposase accessible chromatin with high-throughput sequencing，ATACseq）[44]、染色體三維基因組學(xué)測序技術(shù)（Bridge Linker-Hi-C，BL-Hi-C）[45]、代謝組學(xué)和蛋白組學(xué)的多組學(xué)聯(lián)合研究，是未來疾病機制研究的重要部分。

最后，類器官芯片為核心，結(jié)合3D 打印技術(shù)和高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)實現(xiàn)高精度、一體化、集成化、自動化是類器官發(fā)展的未來趨勢。在未來，膀胱癌類器官模型有可能完全替代目前的二維腫瘤細胞系及PDX 模型，成為廣泛應(yīng)用的臨床前模型。