神經(jīng)介素U蛋白在人甲狀腺乳頭狀癌中表達(dá)的意義及作用機(jī)制

高關(guān)清，郭丹，盧文亞，張萍，王芳，石科

（1.河南省第二人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，鄭州 451191；2.河南醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校生物化學(xué)與醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室，鄭州 451191；3.河南省第二人民醫(yī)院普外科，鄭州 451191）

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤，預(yù)后通常較好[1]。與其他類型的腫瘤類似，甲狀腺乳頭狀癌的早期診斷對提高生存率很重要。目前多種生物標(biāo)志物和不同療法成功用于甲狀腺乳頭狀癌的診斷和治療[2-4]。然而，闡明甲狀腺乳頭狀癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制對于開發(fā)新的甲狀腺乳頭狀癌治療方法至關(guān)重要。

神經(jīng)介素U（neuromedin U，NMU）蛋白是人體內(nèi)源神經(jīng)調(diào)節(jié)肽家族的重要成員，能夠通過激活人體中樞和外周組織的神經(jīng)介素U 受體1（NMU receptor 1，NMUR），發(fā)揮多樣而復(fù)雜的生理功能[5]。NMU 是參與人體胃腸道免疫調(diào)節(jié)的重要角色，已有大量研究證實(shí)了它與炎癥發(fā)生以及先天淋巴細(xì)胞的活性調(diào)控息息相關(guān)[6]。NMU 激活NMUR 后通過調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周胃腸道運(yùn)動兩條途徑來實(shí)現(xiàn)對能量平衡的調(diào)節(jié)[7]。

研究顯示，NMU 具有控制腫瘤進(jìn)展的能力，并且有可能成為監(jiān)控腫瘤發(fā)生與進(jìn)展的標(biāo)志物。NMU表達(dá)升高或降低與腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲、糖代謝、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymaltransition，EMT）、維持腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cell，CSC）表型等密切相關(guān)，進(jìn)而影響腫瘤的免疫反應(yīng)、藥物敏感性和治療效果等[8]。結(jié)直腸癌細(xì)胞分泌的NMU 能在表達(dá)NMUR2 受體的CRC 細(xì)胞中誘導(dǎo)侵襲性表型[9]。NMU 也是肺腺癌患者預(yù)后不良的生物標(biāo)志物[10]。然而NMU 在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)及對其潛在影響仍然未知。本研究主要探討NMU 蛋白在人甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)及臨床意義及對細(xì)胞增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 基因表達(dá)GEPIA 分析 在線軟件GEPIA（http：//gepia.cancer-pku.cn/detail.php?gene=NMU）是基于基因表達(dá)數(shù)據(jù)和腫瘤基因組圖譜RNA 序列而建立的程序，本研究采用GEPIA 檢測甲狀腺癌和正常甲狀腺標(biāo)本中NMU mRNA 水平，及其在不同類型腫瘤中的表達(dá)。NMU 在甲狀腺癌中的表達(dá)在expression DIY（The Boxplot TAB）中顯示，截?cái)鄻?biāo)準(zhǔn)為log2FC>1 和P<0.01。

1.2 臨床資料 收集2016 年3 月—2022 年3 月河南省第二人民醫(yī)院71 例甲狀腺乳頭狀癌患者手術(shù)切除的腫瘤及正常組織標(biāo)本，分析其臨床病理資料特征。全部病例均經(jīng)過病理證實(shí)，術(shù)前未經(jīng)化療或放療，且具有完整的病例資料。收集患者的一般臨床資料，包括年齡、性別、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腺內(nèi)傳播等。71 例甲狀腺乳頭狀癌患者年齡43～65 歲，平均年齡（57.5±5.75）歲；男性14 例，女性57例；腫瘤分期低級別者29 例，高級別者42 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移未轉(zhuǎn)移者28 例，轉(zhuǎn)移者48 例；多灶者33 例，單灶者38 例。

1.3 試劑 NMU 抗體為兔抗人單克隆抗體（ab2296335、abcam、Cambridge），β-肌動蛋白（βactin）抗體（1∶1 000 稀釋，ab8226、abcam）。免疫組化稀釋濃度為1∶100，免疫印跡稀釋濃度為1∶1 000；免疫組化二步法檢測試劑盒（PV-6001）、DAB 顯色試劑盒（ZLI-9018）均購于北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司；噻唑藍(lán)（methylthiazoly tetrazolium，MTT）購自美國Sigma-Aldrich 公司。

1.4 方法及免疫組化染色結(jié)果的評分標(biāo)準(zhǔn) 甲狀腺乳頭狀癌腫瘤及正常的組織進(jìn)行福爾馬林固定，并用石蠟全包埋，包埋后的蠟塊標(biāo)本行5 μm 切片及免疫組化染色，抗體1∶100 稀釋。切片于75℃孵育30 min 后，二甲苯脫蠟及梯度乙醇水合。檸檬酸緩沖液孵育20 min 后5% BSA 于室溫封閉30 min。封閉后NMU 抗體孵育2 h，二抗孵育1.5 h，通過DAB 法顯色，隨后蘇木素染色。組化切片于蔡司顯微鏡下拍照。

評分標(biāo)準(zhǔn)：陽性細(xì)胞比例：陽性細(xì)胞數(shù)<20%為0 分；陽性細(xì)胞百分率為20%～50% 記1 分；腫瘤細(xì)胞陽性百分率為50%～70% 記2 分；腫瘤細(xì)胞陽性百分率＞70%則為3 分；同時對陽性著色細(xì)胞的染色強(qiáng)度進(jìn)行評分：陰性表達(dá)記0 分，弱陽性表達(dá)記1 分，中等陽性2 分，強(qiáng)陽性記為3 分；最終計(jì)分結(jié)果為陽性細(xì)胞比例分?jǐn)?shù)加染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)，范圍為0～6 分。0～2 分為NMU 低表達(dá)，3～6 分為NMU 高表達(dá)。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 甲狀腺乳頭狀癌的細(xì)胞系TPC-1 和KTC-1 細(xì)胞購自美國模式菌種收集中心（ATCC）。shRNA 質(zhì)粒購自Addgene。TPC-1 和KTC-1細(xì)胞均于含有10%胎牛血清（FBS，美國Gibco 公司）的RPMI-1640 培養(yǎng)基（美國Gibco 公司）中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法進(jìn)行。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為對照組（轉(zhuǎn)染對照shRNA 質(zhì)粒）及NMU 下調(diào)組（轉(zhuǎn)染NMU 的shRNA 質(zhì)粒），實(shí)驗(yàn)所用質(zhì)粒購自Charles River 公司，貨號SH814099，序列如下：CCGC TCCTGCTGCTGCTGCTGCT。取2 mL 滅菌的EP 管加入質(zhì)粒或Lipo2000 和1.5 mL Opti-MEM 培養(yǎng)基，室溫孵育5 min。隨后兩者混合后孵育20 min，加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，6 h 后換液，24 h 后進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）實(shí)驗(yàn) 利用RIPA 細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，使用BCA 法測量蛋白濃度。加入蛋白酶抑制劑后，將總蛋白進(jìn)行10%SDS-PAGE 電泳后，轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯（PVDF）的膜上，5%脫脂奶粉進(jìn)行室溫固定2 h，室溫條件下NMU 一抗（1∶1 000）孵育2 h，隨后Tris-HCL 緩沖液（TBST）洗脫未結(jié)合抗體，共洗5 次，每次5 min；隨后室溫山羊抗兔二抗（1∶3 000）孵育45 min，TBST洗脫未結(jié)合抗體，共洗5 次，每次5 min，加入ECL增強(qiáng)顯影底物后在曝光儀中檢測信號，所得信號使用Image J 8.0 軟件進(jìn)行分析。

1.7 實(shí)時定量熒光PCR 通過TRIzol 試劑提取HUVEC 細(xì)胞內(nèi)總RNA，并進(jìn)行兩步法反轉(zhuǎn)錄，條件為42℃，1 h，所得cDNA 通過SYBR 熒光探針進(jìn)行實(shí)時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），并使用β-actin 作為內(nèi)參，檢測相關(guān)mRNA 的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2×δCT 法進(jìn)行定量。NMU 正向：5′-AGT TGT GGA ATG AGG CAT CC-3′，反向：5′-GGA TGC ACA ACT GAC GAC AC-3′；β-actin：正向5′- GCA CTC TTC CAG CCT TCC TT-3′，反向：5′- GTT GGC GTA CAG GTC TTT GC-3′。以2-△△CT公式計(jì)算出β-actin 和NMU 相對表達(dá)量。

1.8 MTT 實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞鋪于96 孔板中，進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染處理后于48 h 加入40 μL 的MTT 試劑，37℃培養(yǎng)箱孵育4 h，應(yīng)用200 μL 的DMSO 震蕩溶解，隨后在570 nm 波長下使用多功能酶標(biāo)儀檢測其吸光度值。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3 個重復(fù)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.9 集落形成實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染處理后48 h鋪于6 孔板中，每孔約1 000 個細(xì)胞，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)14 d，隨后使用0.2%的結(jié)晶紫染色15 min，使用4%多聚甲醛室溫固定20 min，流水緩慢沖洗，隨后奧林巴斯熒光顯微鏡下觀察拍照，使用Image J 8.0軟件分析圖片。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用Graphpad 8.0軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)采用±s 表示。通過GPEIA 數(shù)據(jù)庫分析NMU mRNA 在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)。通過卡方檢驗(yàn)比較臨床病理特征與患者腫瘤組織NMU 表達(dá)的相關(guān)性，P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)分析揭示NMU 的mRNA 在甲狀腺乳頭狀癌患者腫瘤組織中高表達(dá)且與患者預(yù)后相關(guān) 首先通過GPEIA 數(shù)據(jù)庫分析NMUmRNA 水平在512 例人甲狀腺乳頭狀癌組織及對應(yīng)的337 例正常組織中的差異，發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織中NMU mRNA呈顯著高表達(dá)（圖1A，P=0.006）。且生物信息學(xué)分析結(jié)果證實(shí)甲狀腺乳頭狀癌患者腫瘤組織NMU 的表達(dá)與患者無病生存率顯著相關(guān)（圖1B，P=0.021）。

圖1 NMU 的mRNA 水平在甲狀腺癌中顯著增加并與患者不良預(yù)后顯著相關(guān)Fig 1 mRNA levels of NMU are significantly increased in thyroid cancer and are significantly associated with poor prognosis in patients

2.2 NMU 蛋白在甲狀腺乳頭狀癌患者腫瘤組織中高表達(dá)并與患者臨床病理特征顯著相關(guān) 將腫瘤組織按NMU 的表達(dá)水平分為高表達(dá)組與低表達(dá)組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對于正常組織，NMU 蛋白在人甲狀腺乳頭狀癌組織中呈顯著高表達(dá)（圖2）。

圖2 NMU 在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)水平Fig 2 The expression levels of NMU in thyroid papillary carcinoma

對染色結(jié)果進(jìn)行評分量化分析，結(jié)果證實(shí)，NMU 表達(dá)水平與甲狀腺乳頭狀癌患者的腫瘤分期（P=0.004）及多灶情況等（P=0.006）密切相關(guān)，而與其他的臨床特征，包括年齡（P=0.461）、性別（P=0.422）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.938）等無顯著相關(guān)性（表1）。

表1 71 例甲狀腺乳頭狀癌患者NMU 的表達(dá)水平與臨床病理特征相關(guān)性分析[n（ %）]Tab 1 Correlation analysis between NMU expression levels and clinical pathological characteristics in 71 patients with papillary thyroid cancer[n（ %）]

2.3 下調(diào)NMU 蛋白抑制甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞增殖 與對照組相比，NMU 下調(diào)組TPC-1 和KTC-1細(xì)胞NMU 的mRNA 及蛋白水平均顯著下降（t=7.96、7.37、10.42、7.69，均P＜0.05），見圖3。

圖3 NMU 的shRNA 在甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞系TPC-1 和KTC-1中的沉默效率Fig 3 shRNA silencing efficiency of NMU in thyroid papillary cancer cell lines TPC-1 and KTC-1

集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在TPC-1 和KTC-1細(xì)胞中，NMU 蛋白的下調(diào)會導(dǎo)致形成集落的數(shù)量下降（圖4A，t=12.43，P=0.001 1；t=16.46，P=0.000 5）。MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在TPC-1 和KTC-1 細(xì)胞中，NMU 蛋白下調(diào)后TPC-1 和KTC-1 細(xì)胞平均吸光度值均下降（圖4B，t=7.33，P=0.005 2；t=8.08，P=0.004 0）。

圖4 NMU 下調(diào)抑制甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞增殖Fig 4 NMU down-regulation inhibited the proliferation of thyroid papillary cancer cells

3 討論

甲狀腺乳頭狀癌是最為常見的一種甲狀腺癌，其生長緩慢，惡性程度低，預(yù)后通常較好。其發(fā)生會受到輻射、激素、遺傳、環(huán)境及炎癥等因素的影響。由于甲狀腺乳頭癌對放化療不敏感，因此靶向治療便成了最有潛力的一種治療手段[11]。然而截至目前，甲狀腺乳頭狀癌的治療靶點(diǎn)有限。為了進(jìn)一步提高患者的生存率，仍需發(fā)現(xiàn)新的更有效的治療靶點(diǎn)。NMU 在多種腫瘤中均出現(xiàn)高表達(dá)并與不良預(yù)后相關(guān)，因此進(jìn)一步借助ProteinAtlas 驗(yàn)證NMU mRNA在多種腫瘤中與患者預(yù)后的相關(guān)性。在本研究中發(fā)現(xiàn)，NMU 在甲狀腺乳頭狀癌中顯著高表達(dá)，并與患者的無病生存期顯著相關(guān)，提示不良預(yù)后。進(jìn)一步的臨床病理特征分析證實(shí)NMU 的表達(dá)與患者的腫瘤分期及多灶情況密切相關(guān)，而這兩種特征均與甲狀腺乳頭狀癌的轉(zhuǎn)移有關(guān)。因此推測NMU 可能參與甲狀腺乳頭狀癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，是一個甲狀腺乳頭狀癌的潛在治療靶點(diǎn)和標(biāo)志物。

為了證實(shí)推測，進(jìn)一步利用兩種甲狀腺乳頭狀癌的細(xì)胞系開展體外實(shí)驗(yàn)。通過轉(zhuǎn)染NMU 的shRNA 質(zhì)粒，下調(diào)NMU 的表達(dá)，并通過集落形成實(shí)驗(yàn)和MTT 實(shí)驗(yàn)檢測其對細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明，NMU 的下調(diào)顯著抑制甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞增殖。因此，研究初步揭示了NMU 在甲狀腺癌中的功能。NMU 表達(dá)水平的改變能夠影響癌細(xì)胞的多種功能，如增殖、遷移、侵襲、代謝、EMT 等，進(jìn)而影響腫瘤免疫、藥物敏感性和治療效果[8]。研究表明，結(jié)直腸癌細(xì)胞分泌的NMU 能夠調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)細(xì)胞侵襲[9]。另有研究證實(shí)，NMU 在人樹突細(xì)胞中表達(dá)[12]，而NMUR1 在免疫效應(yīng)細(xì)胞（如T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞）中表達(dá)[13]，提示抗原提呈細(xì)胞和免疫效應(yīng)細(xì)胞群之間存在相互作用，并進(jìn)一步提示NMU 可參與腫瘤的免疫治療。

除此之外，NMU 作為一種神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白，也能參與代謝過程，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)能量消耗、進(jìn)食行為，維持生命的新陳代謝[14]。而腫瘤的微環(huán)境及腫瘤細(xì)胞代謝在甲狀腺癌進(jìn)展與轉(zhuǎn)移中同樣扮演重要角色[15]，故有理由推測NMU 可能通過調(diào)控甲狀腺腫瘤細(xì)胞的代謝影響腫瘤進(jìn)展。在本研究中，初步發(fā)現(xiàn)NMU對甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞增殖的影響，而對于細(xì)胞遷移及代謝等方面的影響仍需進(jìn)一步體內(nèi)外研究證實(shí)。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)了NMU 在甲狀腺乳頭狀癌中顯著高表達(dá)，并與患者的無病生存期顯著相關(guān)。NMU 的表達(dá)水平與甲狀腺癌患者的腫瘤分期及多灶情況密切相關(guān)，且NMU 的下調(diào)能夠抑制甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞增殖，提示其可作為甲狀腺乳頭狀癌的潛在治療靶點(diǎn)。