機械加載上調Piezo1 促進廢用性骨質疏松小鼠的血管生成

孟堯，王雪彤，李心樂，張平，3，4

（1.天津醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院人體解剖與組織胚胎學系，天津 300070；2.天津醫(yī)科大學基礎醫(yī)學研究中心，天津 300070；3.衛(wèi)生部激素與發(fā)育重點實驗室，天津市代謝性疾病重點實驗室，天津 300134；4.天津市脊柱脊髓重點實驗室，天津 300052）

廢用性骨質疏松（DOP）多發(fā)生于長期臥床或失重狀態(tài)下（如宇航員），造成嚴重的骨量丟失，骨代謝失衡，使骨脆性增加，現已成為一個重要的健康問題[1]。研究表明，骨組織中有一種特殊的高表達CD31 和內皮黏蛋白Emcn 的毛細血管（H 血管），它是骨重建與血管生成耦聯的重要載體，而DOP 小鼠模型會導致H 血管數量減少[2]。因此，促進H 血管形成可能成為治療廢用性骨質疏松的關鍵因素。

機械加載是一種加載頻率低、加載強度小、作用于膝關節(jié)等滑膜關節(jié)的溫和機械刺激，能模擬人體主動運動的物理治療手段[3]。前期研究發(fā)現機械加載可以促進血管形成、骨形成，用于骨質疏松[4-5]、骨關節(jié)炎[6]、股骨頭壞死[7]、乳腺癌骨轉移[8]的治療。Piezo1 是一種在生物體內廣泛分布的機械敏感離子通道蛋白[9]，可以將細胞膜上感受到的機械信號轉化為電化學信號[10]。研究表明Piezo1 在血管系統中發(fā)揮著不可或缺的作用，對促進血管重塑有重要意義[11]。前期工作發(fā)現機械加載可以通過促進成骨和成血管形成來治療絕經后骨質疏松[4-5]，但機械加載對廢用性骨質疏松血管生成的調控作用與其作用媒介尚不清楚。本實驗采用鼠尾懸吊方式建立廢用性骨質疏松小鼠模型，探究Piezo1 是否可能作為機械加載調控靶點來改善骨微環(huán)境中的血管形成，為物理治療廢用性骨質疏松提供新的見解。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 使用63 只SPF 級雌性C57BL/6小鼠（16 周齡，體重18~20 g，中國軍事醫(yī)學科學院動物中心）。實驗小鼠根據隨機數字表法分為3 組：假手術組（Sham 組，n=21）、廢用性骨質疏松組（DOP組，n=21）和廢用性骨質疏松機械加載組（DOPL 組，n=21）。在25°C 的室溫且無病原體條件下，將小鼠置于12 h 的明暗循環(huán)中，自由攝取飼料和水。所有實驗根據天津醫(yī)科大學實驗動物管理規(guī)定進行，并經天津醫(yī)科大學倫理委員會批準。

1.1.2 主要儀器和試劑 ST2 細胞系購買自美國Lonza 公司。石蠟切片機（RM255）購買自德國Leica公司。光學顯微鏡BX53 購買自日本Olympus 公司。DMEM 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司。EGM-2 培養(yǎng)基購自美國Lonza 公司。抗體Piezo1 購自美國Cell Signaling Technology 公司。CD31 一抗購自中國proteintech 公司。Emcn、β-actin 一抗購自美國Sigma 公司。墨汁購自中國北京索萊寶公司。胎牛血清、青霉素、鏈霉素和胰蛋白酶購自美國Invitrogen公司。Piezo1 siRNA 基因干擾載體的構建和篩選自上海吉瑪公司。

1.2 方法

1.2.1 鼠尾懸吊小鼠模型 如前所述進行尾部懸吊[12]。實驗小鼠配備了定制的綁帶，并懸掛在定制籠子中的高架滑輪系統中。調整小鼠的位置，保證頭低位30°尾懸吊，后肢不接觸地面，前肢與籠子的地板接觸并保持可以用前肢在籠子里行走（圖1A）。

圖1 鼠尾懸吊和機械加載示意圖Fig 1 Mice tail suspension and mechanical loading diagram

1.2.2 機械加載 在機械加載治療過程中，用1.5%異氟烷對小鼠進行吸入式麻醉。小鼠側臥于加載臺上，使用自主研發(fā)的機械加載裝置（內源性干細胞治療儀，專利號：ZL201621010131.9）實施治療[13]。每天對雙側膝關節(jié)分別進行側向加載（圖1B），加載力為1 N，加載頻率為5 Hz，小鼠每側膝關節(jié)加載時長為3 min，共6 min，持續(xù)治療2 周。加載時，加載面與膝關節(jié)內外側面相接觸，調節(jié)合適的松緊度保證治療效果并確保膝關節(jié)血運通暢，合格標準為在踝關節(jié)動脈可感受到節(jié)律性跳動。同時假手術組和廢用性骨質疏松造模組小鼠被麻醉并定位在加載臺上，而不接受機械加載治療，實驗結束后全部小鼠處死并取材。

1.3 組織學分析

1.3.1 組織處理 小鼠在造模2 周后進行人道主義處死。剝離小鼠后腿，剔除皮膚、軟組織及韌帶，分離股骨、脛骨組織。將骨組織標本浸沒于10%中性福爾馬林中固定2 d 后，在14%的EDTA 中脫鈣2 周。將骨組織標本用石蠟包埋，進行冠狀位切片，厚度為5 μm。

1.3.2 免疫組織化學染色 使用石蠟包埋的小鼠股骨標本（每組n=6），石蠟切片經過脫蠟和水化后加入適量內源性過氧化物酶阻斷劑，室溫孵育10 min。然后將切片與抗Piezo1 的一級抗體在4℃下孵育過夜，滴加適量反應增強液，室溫孵育20 min后滴加適量強酶標山羊抗兔IgG 聚合物，室溫孵育20 min。最后滴加適量的配置新鮮DAB 液（濃縮DAB液50 μL+DAB 底物液1 mL），室溫孵育2~10 min，出現明顯棕色即可。在正置顯微鏡下觀察、拍照并測量，選取股骨遠端生長板近端（距生長板近端約0.8 mm）1.6 mm2的長方形區(qū)域為目標區(qū)域，拍照定量分析Piezo1 的水平。

1.3.3 墨汁灌注 首先麻醉動物，將治療2 周的動物（每組n=6）腹腔注射10%水合氯醛（每只小鼠3 mL/kg 的劑量注射）進行麻醉。然后將小鼠四肢固定用肝素生理鹽水灌注心臟（每只小鼠生理鹽水用量約為30 mL）。抽取墨汁灌注液并進行左心室灌注至動物皮膚黏膜全部變黑為止（每只小鼠灌注液用量約為50 mL）。灌注成功后，處死動物，將動物靜置于4℃，24 h。進行石蠟切片處理，切片厚度為15 μm。使用中性樹膠封片并在正置顯微鏡下進行觀察、拍照，然后進行統計學分析。

1.4 細胞學實驗

1.4.1 細胞分離培養(yǎng) 人道主義處死動物，分離小鼠（每組n=3）雙側髂骨、股骨、脛骨，剝離皮膚、肌肉及周圍韌帶，保留完整髂骨、股骨和脛骨，將其用滅菌1×PBS 溶液清洗后浸于含有2%胎牛血清的MEM-α溶液中。使用滅菌的剪刀剪開髂骨、股骨、脛骨的兩端。暴露骨髓腔，采用5 mL 含有2%胎牛血清的MEM-α 溶液的注射器沖取骨髓，使用含有2 mL Ficoll 無菌離心管過篩細胞，室溫下離心。離心后，棄上清液，進行細胞計數，再次離心，獲得骨髓來源細胞。

1.4.2 內皮祖細胞的誘導實驗 將得到的骨髓單個核細胞使用含有20%胎牛血清的EGM-2 培養(yǎng)基，重懸并種于6 孔板中，恒溫培養(yǎng)箱孵育48 h 后換液，更換新的EGM-2 培養(yǎng)基。誘導時長大約10 d，在倒置顯微鏡下動態(tài)觀察直至細胞形成典型的鋪路石樣形態(tài)。

1.4.3 細胞轉染 Piezo1siRNA 基因干擾載體（正義鏈：5′-GUCUACAAGAACUUCGAGATT-3′，反義鏈：5′-UCUCGAAGUUCUUGAGACTT-3′）。NC 組為si RNANC 基因干擾載體（正義鏈：5′-UUCUCCGAACG UGUCACGUTT-3′，反義鏈：5′-ACGUGACACGUUCG GAGAATT-3′）。將處于對數生長期的內皮祖細胞和ST2 細胞接種在無菌6 孔板中，密度調整為1×105個/cm2。約24~36 h 后，當細胞密度達到60%~80%時，加入轉染試劑和無雙抗體培養(yǎng)基。4 h 后，更換完整的培養(yǎng)基進行下一步實驗。為了驗證Piezo1 的沉默效率，使用構建的Piezo1 siRNA 轉染ST2 細胞，通過細胞免疫熒光和Western 印跡檢測Piezo1 siRNA 的沉默效率。

1.4.4 細胞免疫熒光 首先使用預冷的80%乙醇溶液固定細胞浸泡30 min，再更換遇冷的無水乙醇浸泡30 min，1 mL/孔，然后用0.5% Triton X-100室溫浸泡10 min 進行細胞穿透，PBS 清洗后，加入10%胎牛血清進行封閉，室溫孵育1 h，PBS 清洗后將細胞置于Piezo1 一抗（1∶500）中孵育過夜（4℃），再使用熒光二抗（1∶500）室溫孵育1 h，最后用DAPI 染色液染核后，在載玻片上滴加適量抗熒光淬滅劑進行封片，并在熒光顯微鏡下觀察細胞。分別使用不同通道拍攝并Merge 圖像。

1.5 Western 印跡分析 在RIPA 裂解緩沖液中提取股骨蛋白，采用一抗Piezo1（1∶1 000）和β-actin（1∶10 000）在4°C 過夜孵育。二抗室溫（1∶10 000）孵育90 min 后，將增強型化學發(fā)光試劑盒中顯影液和定影液1∶1 混合后反復沖洗目的條帶，使用化學發(fā)光成像系統曝光并通過Image J 軟件分析各組蛋白條帶的灰度值。

1.6 統計學處理 使用IBM SPSS Statistics 25 統計軟件進行數據分析，并采用Graphpad Prism7 軟件進行統計圖制作。符合正態(tài)分布的計量數據采用±s 表示。單因素方差分析（ANOVA）用于多組間的比較，最小顯著差法（LSD-t 檢驗）用于兩組比較。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 機械加載改善DOP 小鼠的骨量的檢測 HE染色顯示（圖2），與Sham 組相比，DOP 組骨小梁的面積和總面積的比值顯著降低（t=9.553，P<0.001）。而DOPL 組結果顯示，與DOP 組相比，骨小梁的面積和總面積的比值增加（t=-9.365，P<0.001）。

圖2 股骨遠端的HE 染色形態(tài)學檢查（ 100×，Bar=200 μm）Fig 2 Morphological examination of distal femur by HE staining（ 100×，Bar=200 μm）

2.2 機械加載對DOP 小鼠血管生成的影響 墨汁灌注實驗結果顯示（圖3），與Sham 組相比，DOP 組骨組織血管面積顯著下降（t=9.764，P<0.001）；而與DOP 組相比，DOPL 組骨組織血管面積顯著增加（t=10.001，P<0.001）。熒光雙染實驗結果顯示（圖4），與Sham 組相比，DOP 組CD31（t=6.377，P<0.001）與Emcn（t=6.258，P<0.001）的表達水平降低，同時，其共表達水平也降低（t=9.223，P<0.001）；而與DOP 組相比，DOPL 組中CD31（t=6.619，P<0.001）和Emcn（t=4.624，P<0.01）的表達水平升高，并且其共表達水平也相應升高（t=4.453，P<0.01）。

圖3 墨汁灌注實驗檢測機械加載對小鼠血管生成的影響（ 200×，Bar=100 μm）Fig 3 The effect of mechanical loading on angiogenesis was detected by ink perfusion experiment in mice（ 200×，Bar=100 μm）

圖4 熒光雙染實驗檢測機械加載對小鼠H 血管生成的影響（ 100×，Bar=200 μm）Fig 4 The effect of mechanical loading on H vessels was detected by fluorescence double staining experiment in mice（ 100×，Bar=200 μm）

2.3 機械加載對DOP 小鼠Piezo1 信號表達的促進作用 與Sham 組相比，DOP 組股骨遠端Piezo1的表達水平下降（t=7.604，P<0.01）；與DOP 組相比，DOPL 組Piezo1 的表達顯著升高（t=6.557，P<0.01），如圖5 所示。Western 印跡結果顯示，與Sham 組相比，DOP 組Piezo1 蛋白表達水平降低（t=15.977，P<0.001）；與DOP 組相比，DOPL 組Piezo1 蛋白的表達水平升高（t=4.803，P<0.01），如圖6 所示。

圖5 免疫組織化學檢測各組Piezo1 的表達（ 400×，Bar=50 μm）Fig 5 The expression of Piezo1 in each group was detected by immunohistochemistry（ 400×，Bar=50 μm）

圖6 Western 印跡檢測各組Piezo1 表達水平Fig 6 Western blotting was used to detect the expression of Piezo1 in each group

2.4 機械加載通過調控 Piezo1 影響H 血管的生成 免疫熒光結果表明，與未轉染Piezo1 siRNA 組相比，Piezo1 siRNA 轉染后可以顯著降低細胞中Piezo1 表達（t=16.203，P<0.001，圖7）。Western 印跡進一步驗證了這一實驗結果（t=14.617，P<0.001，圖8）。免疫熒光染色檢測CD31 和Emcn 的表達，結果顯示，與未轉染Piezo1 siRNA 組相比，Piezo1 siRNA轉染后小鼠內皮祖細胞中CD31（t=-7.508、-4.809、-13.538，均P<0.01）和Emcn（t=4.999、11.319、9.421，均P<0.01）表達顯著減少，并且CD31 和Emcn 的共表達降低（t=12.949、2.580、7.727，均P<0.05）；而在轉染Piezo1 siRNA 后，DOP 組與DOPL 組在CD31和Emcn 的表達及共表達方面無統計學差異，如圖9 所示。

圖7 免疫熒光檢測各組Piezo1 沉默效率（ 200×，Bar=100 μm）Fig 7 The silencing efficiency of Piezo1 in each group was measured by immunofluorescence（ 200×，Bar=100 μm）

圖8 Western 印跡檢測Piezo1 沉默效率Fig 8 Westernblotting was used to detect the silencing efficiency of Piezo1

圖9 熒光雙染檢測Piezo1 siRNA 對H 血管生成的影響（ 100×，Bar=200 μm）Fig 9 The effect of Piezo1 siRNA on H vessels was detected by fluorescence double staining（ 100×，Bar=200 μm）

3 討論

DOP 是由于運動能力受限或功能障礙而引起骨量減少，骨破壞與骨形成失衡的一種繼發(fā)性骨質疏松[14]。主要表現為骨痛、骨脆性增加、骨折風險提高，給患者、家庭以及社會造成巨大負擔[15]。總之，骨質疏松迫切需要一種無創(chuàng)溫和的治療手段來預防和治療該疾病的發(fā)生、發(fā)展。

研究表明，骨質疏松的治療是一個綜合康復的過程，全身振動的運動訓練方式是一種非藥物性抗骨質疏松有效的方法[16]。這種運動訓練可以減少長時間臥床導致的骨丟失，達到增加骨密度的目的[17]。機械加載作為一種可模擬主動運動的被動物理康復治療方式，能夠促進成骨抑制破骨并減緩骨質疏松的骨質流失，影響骨髓間充質干細胞分化，調節(jié)血管生成，達到治療絕經后骨質疏松的目的[4-5]。本實驗聚焦于DOP 鼠尾懸吊小鼠模型，模擬空間微重力環(huán)境，探究機械加載對廢用性骨質疏松小鼠血管形成的影響。筆者認為機械加載可能是通過周期循環(huán)的力學刺激和骨應力變化，引起骨髓腔內壓改變、骨質內液體流動與分子轉運，從而改善DOP 小鼠由于失重導致的骨質流失和血管減少。該實驗證明了膝關節(jié)機械加載可能作為一種有效的物理康復治療方式來緩解廢用性骨質疏松。

Piezo1 作為一種機械敏感離子通道蛋白，能夠感受相應力學信號，在骨疾病治療中具有重要作用[18]。有研究表明在生物力學環(huán)境中，Piezo1 可以促進骨組織血管生成，達到促進骨折愈合的目的[19]。在此基礎上，本實驗探究機械加載刺激下Piezo1 蛋白的表達情況，通過免疫組織化學染色與Western 印跡實驗證明了機械加載可以促進DOP 小鼠中Piezo1 表達。研究發(fā)現H 血管作為骨髓中一類特殊的血管，耦聯了血管生成和骨形成，可能是治療骨質疏松的重要靶點[20]。并且，筆者之前的研究發(fā)現機械加載可以促進絕經后骨質疏松小鼠中H 血管的表達，達到治療骨質疏松的目的[4-5]。本研究機械加載可以促進DOP 小鼠骨量增加和血管生成，并通過內皮祖細胞免疫熒光實驗發(fā)現機械刺激改善了DOP 小鼠中H 血管相關因子CD31 和Emcn 的表達，同時，促進DOP 小鼠中CD31 和Emcn 的共表達。為了驗證Piezo1 對CD31 和Emcn 的影響，筆者沉默了內皮祖細胞中的Piezo1，通過免疫熒光實驗觀察到，沉默Piezo1 抑制了CD31 和Emcn 的表達和共表達，證明Piezo1 對H 血管的形成具有調控作用。并且，筆者發(fā)現沉默Piezo1 后，DOP 組與DOPL 組在CD31 和Emcn 的表達及共表達方面無統計學差異，該結果表明機械加載是通過Piezo1 為媒介來調控H 血管相關因子CD31 和Emcn 的表達。以上結果表明，機械加載可能通過促進骨組織中Piezo1 的表達，促進H 血管相關因子CD31 和Emcn 的表達以及血管形成，達到治療DOP 的目的。

綜上所述，本研究表明機械加載通過促進Piezo1 的表達，調控骨血管生成。但機械加載對骨血管微環(huán)境的調控機制尚不明確，還需進一步探究。本研究提示機械加載可以作為DOP 的一種新的治療方法，為臨床治療DOP 提供理論依據。