褪黑素聯(lián)合鹽酸米諾環(huán)素對牙周致病菌混合生物膜的抑制作用

楊雨晴，葉靜，劉青，闕克華，張溪，劉穎

（1.天津醫(yī)科大學口腔醫(yī)院牙體牙髓科，天津 300070；2.天津市天津醫(yī)院口腔科，天津 300211）

牙周炎是由于牙菌斑中的細菌侵犯牙周組織而引起的慢性炎癥性疾病。臨床中治療牙周炎的關鍵是控制菌斑，常規(guī)治療方法包括機械治療和手術治療。但是，由于口腔解剖結構的復雜性，牙周袋底、根分叉等區(qū)域器械難以到達，而菌斑微生物無法被徹底清除可導致牙周治療失敗[1]。因而，臨床中會輔以藥物治療以提高菌斑生物膜的控制效果[2]。目前，臨床上常用于牙周炎輔助治療的藥物有甲硝唑、阿莫西林、四環(huán)素等抗生素類藥物，其中鹽酸米諾環(huán)素（minocycline hydrochloride，MINO）是治療牙周炎最常用的抗生素之一，對多種牙周病原體具有顯著抑制作用，同時能抑制膠原酶和基質(zhì)金屬蛋白酶的活性，減少對牙周結締組織和骨組織的破壞，有利于緩解牙周炎癥[3]。但藥物導致的細菌耐藥問題仍無法避免，且單一用藥仍不能獲得理想的治療效果[4]，需要探索更安全、高效的藥物輔助治療方案。

褪黑素（melatonin，MEL）是一種由色氨酸分子衍生的內(nèi)源性物質(zhì)，不僅具有抗炎、抗氧化等生理功能，而且研究發(fā)現(xiàn)其與環(huán)丙沙星、多黏菌素等藥物聯(lián)合應用時，具有提高藥物療效、降低最小抑菌濃度和降低藥物毒性的能力[5]。近年來，褪黑素在口腔領域的研究也取得一定的進展，研究表明，褪黑素對浮游狀態(tài)下的牙齦卟啉單胞菌和伴放線聚集桿菌具有明顯抑制作用；還具有控制牙周組織的炎癥，抑制局部牙槽骨吸收，促進牙周愈合的潛能[6-7]。然而，褪黑素與菌斑抑制藥物聯(lián)合應用對牙周炎的輔助治療作用尚未見國內(nèi)外文獻報道。因此，本研究旨在探究褪黑素與鹽酸米諾環(huán)素聯(lián)合應用對牙周致病菌及其混合生物膜的抑制作用，為臨床治療牙周炎提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株 戈登鏈球菌（Streptococcus gordonii，S.g，ATCC10558）、牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.g，ATCC33277）、具核梭桿菌（Fusobacterium nucleatum，F(xiàn).n，ATCC25586），伴放線聚集桿菌（Actinobacillus actinomycetemcomitans，A.a，ATCC 43717）為天津醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院實驗室儲存。

1.1.2 主要試劑和儀器 褪黑素（上海生工生物工程股份有限公司）、鹽酸米諾環(huán)素（上海源葉生物科技有限公司）、腦心浸出液培養(yǎng)基（BHI 奧博星生物技術有限責任公司）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進HDPN-II-256 型）、高速離心機（美國Sigma）、酶標儀（美國ThermoFisherScientific），紫外分光光度計（美國BECKMAN），Axio-Imager_LSM-800 型激光共聚焦顯微鏡（CLSM 德國卡爾蔡司公司）。

1.2 方法

1.2.1 藥物配制 用無菌去離子水將鹽酸米諾環(huán)素配置成濃度為1 mg/mL 的母液。將80 mg 褪黑素溶解于1 mL 二甲基亞砜（DMSO）中配置成8%的母液，溶劑DMSO 的終濃度為0.1%。上述溶液均經(jīng)0.22 μm 濾網(wǎng)過濾消毒后儲存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 實驗菌種的復蘇與培養(yǎng) 將S.g、F.n、P.g、A.a復蘇后接種于BHI 固體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，F(xiàn).n、P.g、A.a 置于厭氧（80% N2，20% CO2）環(huán)境、S.g 置于微需氧（5%O2、85%N2、10%CO2）環(huán)境下37℃培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)并確認為純培養(yǎng)后，挑單菌落于BHI 液體培養(yǎng)基中繼續(xù)靜置培養(yǎng)至對數(shù)生長期，3 000 r/min，5 min 離心后重懸菌液，配制成1×107CFU/mL 菌懸液保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 牙本質(zhì)片的制備 本研究經(jīng)天津醫(yī)科大學口腔醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（批準號：TMUhMEC20221107）。納入標準：離體牙發(fā)育完全，牙體完整，無裂紋，無齲壞，無充填物。將存于0.1%麝香草酚中的離體磨牙制備成3 mm×3 mm×1 mm（長×寬×高）的牙本質(zhì)片，使用砂紙打磨拋光，共制備50 片。隨后將其置于17%EDTA 溶液中1 min，超聲蕩洗10 min。高溫高壓滅菌30 min 后，隨機抽取2 片置于BHI 液體培養(yǎng)基中，37℃微需氧條件下靜置培養(yǎng)24 h，以檢測牙本質(zhì)片表面滅菌效果。在確定無殘余活細菌后，將牙本質(zhì)片浸泡于無菌生理鹽水中，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 細菌間相互作用及混合菌懸液的制備 使用平板對峙法確定4 種細菌間是否具有相互作用，如無互相抑制作用則可將上述各菌液按照1∶1∶1∶1的比例混合，建立多菌種混合菌懸液模型，同樣調(diào)整接種混合菌懸液濃度約為1×107CFU/mL。

1.2.5 測定鹽酸米諾環(huán)素和褪黑素的MIC 和MBC 測定褪黑素的MIC 采用液體二倍稀釋法，陰性對照組為含5% DMSO 的菌懸液和不含藥物的菌懸液，每個濃度設3 個復孔，培養(yǎng)條件同1.2.2。按照同樣方法將鹽酸米諾環(huán)素溶液稀釋，陰性對照組為不含藥物的菌懸液，每個濃度設3 個平行孔。若肉眼觀察孔內(nèi)無細菌生長則對應的濃度即為MIC 值。采用菌落計數(shù)法測定各菌MBC 值：從所有大于或等于MIC 的實驗組內(nèi)取20 μL 菌液分別涂布于BHI 固體血平板上，S.g 于37℃下微需氧環(huán)境培養(yǎng)24 h，其余細菌均于厭氧37℃培養(yǎng)48 h 后分別進行菌落計數(shù)，肉眼觀察培養(yǎng)基中無菌落生長的最低藥物濃度即為MBC 值。實驗于不同時間重復3 次。

1.2.6 褪黑素聯(lián)合鹽酸米諾環(huán)素抑菌濃度分數(shù)指數(shù)（FICI）的測定 采用微量棋盤稀釋法，在無菌96 孔板中鹽酸米諾環(huán)素從橫排加入，褪黑素從縱排加入。鹽酸米諾環(huán)素和褪黑素的終濃度均為2MIC、MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC、1/32MIC、1/64MIC，鹽酸米諾環(huán)素和褪黑素照濃度由高到低分別加入藥液和菌懸液各100 μL，陰性對照組每孔均加入BHI液體培養(yǎng)基和菌懸液各100 μL，培養(yǎng)條件同1.2.2。實驗于不同時間重復3 次。根據(jù)96 孔板中聯(lián)合藥敏抑菌情況與單獨藥敏抑菌情況計算FICI，計算公式如下：FICI=甲藥聯(lián)合時MIC/甲藥單獨時MIC+乙藥聯(lián)合時MIC/乙藥單獨時MIC。當FICI≤0.5 時聯(lián)合藥敏表現(xiàn)為協(xié)同作用，0.52 時為拮抗作用。

1.2.7 兩藥聯(lián)合對牙周主要致病菌單菌種和混合生物膜形成的作用 在96 孔板中，每孔先加入100 μL S.g、F.n、P.g、A.a 和混合菌懸液，后實驗組分別加入100 μL 藥液（終濃度為1%的褪黑素聯(lián)合2MIC、MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC 的鹽酸米諾環(huán)素溶液），陽性對照組為單獨鹽酸米諾環(huán)素（終濃度為2MIC、MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC），陰性對照組分為兩組，不含藥物的BHI 液體培養(yǎng)基和含5% DMSO 的溶液，每組3 個復孔，于相應培養(yǎng)環(huán)境下靜置培養(yǎng)48 h。48 h 后移除培養(yǎng)基及懸浮細菌，PBS 沖洗，然后往孔板內(nèi)加入戊二醛固定15 min，吸出干燥后每孔加200 μL 結晶紫溶液，染色20 min，去離子水沖洗，37℃恒溫箱中烘干15 min，每孔加200 μL 95%乙醇溶液，靜置5 min，酶標儀檢測菌懸液在600 nm處的OD 值。生物膜抑制率=（陰性對照組OD600-實驗組OD600）/陰性對照組OD600×100%[8]。

1.2.8 兩藥聯(lián)合對牙周主要致病菌單菌種和混合生物膜的離散作用 96 孔板內(nèi)建立48 h 單菌種和多菌種生物膜，48 h 后移除培養(yǎng)基及懸浮細菌，PBS沖洗。實驗組分別加入100 μL 的藥液（終濃度為1%的褪黑素聯(lián)合2MIC、MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC的鹽酸米諾環(huán)素溶液），陽性對照組為單獨鹽酸米諾環(huán)素（終濃度為2MIC、MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC），陰性對照組分為兩組，不含藥物的BHI 液體培養(yǎng)基和含5% DMSO 的溶液，每組3 個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，結晶紫染色法檢測各組生物膜在600 nm 處的OD 值。生物膜清除率=（陰性對照組OD600-實驗組OD600）/陰性對照組OD600×100%。

1.2.9 CLSM 評估兩藥聯(lián)合應用對混合生物膜的抑制及離散作用 對于生物膜形成的測定，將牙本質(zhì)片分為3 組（n=8）置于48 孔板中，每孔加入200 μL混合菌懸浮液，實驗組分別加入200 μL 終濃度為1%+1/4MIC 和1%+1/2MIC 的兩藥混合溶液，陽性對照組加入200 μL 終濃度為1/4MIC 和1/2MIC 的鹽酸米諾環(huán)素溶液，陰性對照組加等量含氯化血紅素-Vk 溶液的BHI 培養(yǎng)基，每組3 個復孔，在37℃、厭氧環(huán)境下靜置培養(yǎng)48 h 后檢測藥物對多菌種生物膜形成的影響。

對于生物膜離散的測定，將牙本質(zhì)片分為3 組（n=8）置于48 孔板中，每孔加入200 μL 混合菌懸浮液，37℃、厭氧環(huán)境下靜置培養(yǎng)48 h，以建立48 h多菌種生物膜模型。實驗組分別加入200 μL 終濃度為1%+1/2MIC 和1%+MIC 的兩藥混合溶液，陽性對照組加入200 μL 終濃度為1/2MIC 和MIC 的鹽酸米諾環(huán)素溶液，陰性對照組加等量含氯化血紅素-Vk 溶液的BHI 培養(yǎng)基，每組3 個復孔，于相應環(huán)境下靜置培養(yǎng)24 h 后分別檢測藥物對多菌種生物膜離散的影響。

上述樣本處理后，將每組的生物膜上清液吸除，處理后各組避光條件下加入SYTO-9/PI 混合液1 mL，用PBS 漂洗2 次，去除殘液，使用CLSM 觀察牙本質(zhì)片表面多菌種生物膜的情況，每個樣本均隨機選取3 個視野進行觀察。觀察條件為SYTO-9 的激光發(fā)射波長為488/525 nm，PI 的激光發(fā)射波長為561/642 nm，并用Imaris v.7.2.3 圖像分析軟件確定紅色熒光面積代表的死菌總量。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件對本次研究的數(shù)據(jù)結果進行分析，正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)用±s 表示，采用單因素ANOVA 方差分析，兩兩比較應用LSD-t 檢驗方法，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 褪黑素和鹽酸米諾環(huán)素對各致病菌的MIC 和MBC 褪 黑素 對S.g、F.n、P.g、A.a 的MIC 值 均 為1%，MBC 值均為2%，對混合菌液的MIC 值為2%，MBC 值為4%。鹽酸米諾環(huán)素對S.g、F.n、P.g、A.a 和混 合 菌 液 的MIC 值 分 別 為4、4、8、8、16 μg/mL，MBC 值分別為32、32、64、64、128 μg/mL。

2.2 兩藥聯(lián)用對各牙周致病菌及混合菌懸液的MIC 采用微量棋盤稀釋法測得褪黑素和鹽酸米諾環(huán)素聯(lián)合用藥實驗的結果。在聯(lián)合應用時對S.g 的MIC褪黑素=0.5%，MIC鹽酸米諾環(huán)素=0.062 5 μg/mL，F(xiàn)ICI=0.515 6>0.5，表明兩者聯(lián)合對S.g 的抑菌效果為相加作用。在聯(lián)合應用時對F.n 的MIC褪黑素=0.5%，MIC鹽酸米諾環(huán)素=0.062 5 μg/mL，F(xiàn)ICI=0.515 6>0.5，表明兩者聯(lián)合對F.n 的抑菌效果為相加作用。二者聯(lián)用時對P.g的MIC褪黑素=0.25%，MIC鹽酸米諾環(huán)素=0.125 μg/mL，F(xiàn)ICI=0.265 6≤0.5，表明兩者對P.g 的抑菌效果為協(xié)同作用。二者聯(lián)用時對A.a 的MIC褪黑素=0.25%，MIC鹽酸米諾環(huán)素=0.125 μg/mL，F(xiàn)ICI=0.265 6≤0.5，表明兩者對A.a 的抑菌效果為協(xié)同作用。二者聯(lián)用時對混合菌懸液的MIC褪黑素=1%，MIC鹽酸米諾環(huán)素=0.25 μg/mL，F(xiàn)ICI=0.515 6>0.5，則兩者對混合菌懸液的抑菌效果為相加作用。

2.3 兩藥聯(lián)合對牙周主要致病菌單菌種及混合生物膜形成的抑制作用 結晶紫染色法結果顯示，兩藥聯(lián)合處理組生物膜形成量隨藥物濃度的增加而逐漸降低，說明藥物對生物膜形成的抑制作用呈現(xiàn)濃度依賴。除F.n 中1%+1/8MIC 和1%+1/4MIC 組，兩藥聯(lián)合對單菌種和混合生物膜的生物膜生物量與單獨鹽酸米諾環(huán)素組相比顯著降低（P<0.05）。結果還顯示，當褪黑素和鹽酸米諾環(huán)素聯(lián)合作用時，對P.g、A.a 的抑制效果優(yōu)于F.n 和S.g。

此外，當藥物濃度為1%+1/2MIC 時，混合多菌種生物膜形成能力下降更為明顯，抑制率可達55.3%，高于2MIC 鹽酸米諾環(huán)素單獨應用時的抑制率（19.0%），見圖1。

圖1 褪黑素聯(lián)合鹽酸米諾環(huán)素對各致病菌和混合生物膜形成的影響Fig 1 Effect of melatonin combined with minocycline hydrochlorid on biofilm formation in various pathogenic bacteria and mixed biofilms

2.4 兩藥聯(lián)合對牙周主要致病菌單菌種及混合菌種生物膜的離散作用 結果表明，隨著藥物濃度的升高，兩藥聯(lián)合使用對牙周主要致病菌單菌種和混合生物膜的離散作用也逐漸增強。除1%+1/8MIC組，其他各濃度組的生物膜量均明顯低于非藥物處理的對照組（P<0.05）。與單獨鹽酸米諾環(huán)素組相比，藥物聯(lián)合濃度≥1%+1/4MIC 時，S.g、F.n 和A.a 的OD 值均顯著降低（P<0.05）。此外，兩藥聯(lián)合應用對S.g、F.n 和A.a 生物膜的離散作用相當，而對P.g 的離散效果相對較差。結果還顯示，當藥物聯(lián)合濃度為1%+MIC 時，相較于單獨鹽酸米諾環(huán)素，其對混合生物膜的清除率提高最顯著，提高了20.2%，且清除效果高于單獨使用時的2MIC 鹽酸米諾環(huán)素，見圖2。

圖2 褪黑素聯(lián)合鹽酸米諾環(huán)素對各致病菌生物膜的離散作用Fig 2 Effect of melatonin combined with minocycline hydrochloride on the discrete of biofilms by various pathogenic bacteria and mixed biofilms

2.5 CLSM 觀察兩藥聯(lián)合對混合生物膜的抑制和離散作用 進一步應用熒光染色法評估褪黑素聯(lián)合鹽酸米諾環(huán)素對牙本質(zhì)表面混合生物膜的抑制和離散作用（圖3）。綠色熒光顯示活菌，紅色熒光為死菌。CLSM 可觀察到，兩藥聯(lián)合處理后的死菌數(shù)量較單獨鹽酸米諾環(huán)素組和Control 組顯著增多。

圖3 藥物聯(lián)合處理后對牙本質(zhì)表面混合生物膜的CLSM 圖像（ SYTO-9/PI staining，200×）Fig 3 CLSM images of mixed biofilm on the dentine surface after drug combination treatment（ SYTO-9/PI staining，200×）

3 討論

菌斑生物膜是由多種微生物組成的生態(tài)系統(tǒng)，也是牙周炎的始動因子[9]。因此，生物膜的清理和控制是牙周炎治療的主要目的。研究表明，藥物治療在牙周炎的治療中具有抑制細菌、控制炎癥、促進牙周組織再生的作用[10]，故藥物治療可以作為牙周基礎治療的輔助療法以提高牙周炎治療的成功率。但藥物治療可能存在誘導細菌耐藥性等的潛在風險，因此，尋找一種更安全有效的牙周輔助治療方式具有重要的臨床意義。

本研究擬評估褪黑素與鹽酸米諾環(huán)素聯(lián)合應用對S.g、F.n、P.g、A.a 4 種細菌單菌種和混合多菌種浮游細菌和生物膜的抗菌性能。S.g 是菌斑生物膜的早期定植者之一[11]。F.n 通過表達多種黏附素發(fā)揮橋梁作用，連接早期和晚期定植菌以促進菌斑生物膜的形成和成熟[12]。P.g 是牙周炎病變區(qū)的優(yōu)勢菌，可參與生物膜的形成，釋放多種毒力因子破壞宿主免疫細胞，引起牙周組織的破壞[13]。A.a 可分泌多種細胞毒素，從而加快牙周附著喪失和牙槽骨吸收[14]。這幾種細菌均在牙周炎的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用。

鹽酸米諾環(huán)素是臨床牙周炎治療的常用藥物，但其長期應用可能導致抗生素耐藥等問題，且單獨使用達不到理想的治療效果[15]。褪黑素是一種內(nèi)源性吲哚類激素，具有很高的水溶性和脂溶性，近期研究發(fā)現(xiàn)在牙周炎患者中唾液褪黑素水平降低，提示褪黑素可作為牙周病診斷的重要生物標志物[16]，也有研究顯示褪黑素對多重耐藥、革蘭陽性和革蘭陰性細菌具有有效的抗菌活性[17]。Zhou 等[17]首次報道褪黑素對體外P.g 的作用，發(fā)現(xiàn)其對P.g 具有體外抗菌活性。本實驗研究結果同樣顯示褪黑素對S.g、F.n、P.g、A.a 4 種細菌及混合菌懸液均有抑制作用。已有研究證實褪黑素與抗生素聯(lián)合應用可提高抗生素的治療效果，減少藥物不良反應，故本實驗探討褪黑素與鹽酸米諾環(huán)素聯(lián)合應用對牙周致病菌的抗菌效果。聯(lián)合藥敏結果表明，兩藥聯(lián)合使用將鹽酸米諾環(huán)素的MIC 降低至單用時的1/64，同時，兩藥聯(lián)用對P.g 和A.a 具有協(xié)同抑菌效果（FICI≤0.5），對S.g、F.n 和混合菌懸液表現(xiàn)為相加作用（0.5

口腔環(huán)境中的牙周致病菌主要是以混合生物膜形式存在，生物膜的耐藥性較浮游細菌高100～1 000 倍[18]。為了更準確地評估褪黑素與鹽酸米諾環(huán)素聯(lián)合應用的抑菌性能，本研究結晶紫染色法以及CLSM 檢測進一步評估了聯(lián)合用藥對4 種牙周致病菌混合生物膜形成和離散的影響。結果顯示，聯(lián)合用藥對單菌種和混合生物膜均具有良好的抑制和離散作用，并呈現(xiàn)劑量依賴性。在抑制生物膜形成的實驗中，當聯(lián)合藥物濃度為1%+1/2MIC 時，對混合多菌種生物膜抑制能力提升最為明顯，生物膜抑制率從12.4%提高至55.3%，且相比于單獨應用2MIC 的鹽酸米諾環(huán)素抑菌能力增強36.3%。在生物膜離散實驗中，兩藥聯(lián)合濃度為1%+MIC 時，對混合生物膜的清除作用提升最為顯著，清除率較單獨應用鹽酸米諾環(huán)素高20.2%，且清除效果顯著高于單用2MIC 的鹽酸米諾環(huán)素。本研究結果顯示，混合生物膜與單菌種生物膜對藥物的敏感性存在差異。因此，應用更加模擬臨床的混合生物膜模型來評估藥物的抗菌作用更為準確。CLSM 結果同樣顯示，兩藥聯(lián)合處理后牙本質(zhì)表面的死菌數(shù)量明顯多于Control 組和單獨鹽酸米諾環(huán)素組。因此，本實驗結果表明：褪黑素與鹽酸米諾環(huán)素聯(lián)合應用可顯著提高單一用藥對牙周致病菌生物膜的抗菌作用。此外，褪黑素還具有下調(diào)牙齦組織中促炎細胞因子的表達、抑制牙槽骨吸收、促進成骨細胞增殖的作用[19]。因而，褪黑素可能于控制牙周炎癥和促進組織再生中發(fā)揮積極作用。

目前，藥物聯(lián)合應用的抗菌機制尚未明朗，分析其可能由于褪黑素可與細菌內(nèi)的鐵、銅和鋅等金屬離子螯合，降低細菌細胞內(nèi)底物和細菌細胞膜表面的脂質(zhì)水平導致細菌細胞膜通透性改變，使兩種藥物更容易進入細菌內(nèi)發(fā)揮抗菌作用相關[6]。

綜上所述，褪黑素聯(lián)合鹽酸米諾環(huán)素可顯著提高對牙周致病菌斑生物膜的抑制和清除能力，并可降低鹽酸米諾環(huán)素的藥物濃度，預防細菌耐藥性的發(fā)生，有望在牙周炎的輔助治療中發(fā)揮作用。