FOXQ1 敲除乳腺癌MCF7 細(xì)胞株的構(gòu)建及其功能初探

楊歡，馮玉梅

（天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究室；國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心；天津市“腫瘤防治”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心；乳腺癌防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300060）

缺氧微環(huán)境是實(shí)體瘤的普遍特征。Voss 等[1]研究發(fā)現(xiàn)，缺氧環(huán)境可導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞遷移能力的增加。此外，多個(gè)研究表明，原發(fā)性腫瘤氧合不良的患者轉(zhuǎn)移率和死亡率增加[2-4]。缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）是體內(nèi)多器官系統(tǒng)中細(xì)胞缺氧反應(yīng)的主要轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)節(jié)因子[5]。在常氧環(huán)境中HIF-1α 的脯氨酸殘基發(fā)生羥基化使其被泛素化降解，而缺氧環(huán)境中HIF-1α 脯氨酸不再發(fā)生羥基化，從而導(dǎo)致HIF-1α 蛋白的積累[6]。

叉頭框（forkhead box，F(xiàn)OX）蛋白是在進(jìn)化上保守的轉(zhuǎn)錄因子超家族，在癌癥的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[7]。許多FOX 蛋白被報(bào)道直接或間接響應(yīng)缺氧信號(hào)而被激活表達(dá)[8-11]。FOXQ1 是FOX 轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，其在包括乳腺癌在內(nèi)的多個(gè)癌種中被表征為上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的主要激活劑，賦予細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲的能力[12-15]；并且其在間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞（mesenchymal stromal cells，MSCs）中被報(bào)道可能間接響應(yīng)于缺氧信號(hào)而表達(dá)上調(diào)[11]。因此推測(cè)，在乳腺癌中，處于缺氧微環(huán)境的癌細(xì)胞其可能響應(yīng)于缺氧信號(hào)導(dǎo)致FOXQ1 表達(dá)上調(diào)，從而產(chǎn)生具備較高轉(zhuǎn)移或侵襲能力的亞克隆。

為了構(gòu)建有效的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，選擇通過(guò)成簇的規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/CRISPR相關(guān)蛋白9（CRISPR-associated protein 9，Cas9）系統(tǒng)來(lái)構(gòu)建FOXQ1 基因敲除的MCF7 細(xì)胞株。該系統(tǒng)由Cas9 蛋白、CRISPR RNA（crRNA）和反式激活CRISPR RNA（trans-activating crRNA，tracrRNA）組成。其中，crRNA 作為識(shí)別模塊能夠識(shí)別相應(yīng)的特異性靶序列；tracrRNA 和crRNA 的核苷酸鏈能互補(bǔ)配對(duì)構(gòu)成單指導(dǎo)RNA（single guide RNA，sgRNA），sgRNA 與Cas9 一同形成核糖核蛋白復(fù)合物（ribonucleoprotein，RNP）并同時(shí)激活Cas9 作為核酸內(nèi)切酶的功能[16-17]；Cas9 切斷目的區(qū)域的雙鏈核酸，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)源DNA 損傷修復(fù)機(jī)制工作，最終借助該機(jī)制達(dá)到編輯遺傳信息的目的[18]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人乳腺癌細(xì)胞系MCF7 來(lái)自American Type Culture Collection；DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清和青霉素/鏈霉素購(gòu)于美國(guó)Gibco 公司；Leti-CAS9-puro 單載體慢病毒購(gòu)于吉?jiǎng)P基因；crRNA 和tracrRNA 由廣州銳博生物合成；Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于美國(guó)Invitrogen；T7 核酸內(nèi)切酶I（T7 Endonuclease I，T7E1）和NE Buffer 購(gòu)于美國(guó)NEB 公司；DNA 提取試劑盒、DNA 純化試劑盒、PrimeSTAR Max DNA Polymerase 均購(gòu)于日本Takara 公司；FOXQ1 抗體購(gòu)于美國(guó)Santa 公司；HIF-1α 抗體購(gòu)于美國(guó)CST 公司；β-Actin 抗體購(gòu)于武漢ABclonal 公司；transwell 購(gòu)于美國(guó)Corning 公司；結(jié)晶紫染液購(gòu)于上海碧云天公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 crRNA 設(shè)計(jì)合成 從NCBI 中檢索人FOXQ1 基因的外顯子序列，根據(jù)Cas9 靶點(diǎn)設(shè)計(jì)原則，即待編輯的區(qū)域附近存在相對(duì)保守的PAM 序列（NGG），并針對(duì)其外顯子堿基序列設(shè)計(jì)3 個(gè)敲除位點(diǎn)（表1）。根據(jù)敲除位點(diǎn)設(shè)計(jì)合成相應(yīng)的crRNA以及與之配套的tracrRNA，KO#1、KO#2 和KO#3 3個(gè)敲除位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的crRNA 分別命名為FOXQ1-crRNA#1、FOXQ1-crRNA#2 和FOXQ1-crRNA#3。

表1 敲除位點(diǎn)識(shí)別序列Tab 1 Knockout site recognition sequences

1.2.2 構(gòu)建Cas9 工具細(xì)胞株 將1×105個(gè)MCF7細(xì)胞接種于24 孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)到約30%時(shí)，加入2 μL Leti-CAS9-puro 慢病毒。細(xì)胞感染12 h觀察細(xì)胞狀態(tài)，如果沒有明顯的細(xì)胞毒性作用，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后棄去含有病毒的培養(yǎng)基，更換為新鮮DMEM 完全培養(yǎng)基。感染2 d 后更換培養(yǎng)基為含2 μg/mL 嘌呤霉素的DMEM 完全培養(yǎng)基進(jìn)行連續(xù)3 d 的藥物篩選，由此獲得Cas9 穩(wěn)定表達(dá)MCF7細(xì)胞株，作為MCF7-Cas9 工具細(xì)胞待用。

1.2.3 轉(zhuǎn)染FOXQ1-crRNA+tracrRNA 接種1×105個(gè)MCF7-Cas9 工具細(xì)胞于24 孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)到50%~70%時(shí)進(jìn)行FOXQ1-crRNA+tracrRNA的轉(zhuǎn)染。取一支1.5 mL EP 管，加入25 μL Opti-MEM減血清培養(yǎng)基，再分別加入2 μL FOXQ1-crRNA和EP 管，加入25 μL Opti-MEM 減血清培養(yǎng)基，再加入3 μL lipo3000 轉(zhuǎn)染試劑；而后將FOXQ1-cr－RNA+tracrRNA、Opti-MEM 混合物加入到Opti-MEM 減血清培養(yǎng)基稀釋的lipo3000 轉(zhuǎn)染試劑中，室溫孵育5 min。孵育結(jié)束后，將上述制備好的轉(zhuǎn)染混合物加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，48 h 后更換新鮮DMEM 完全培養(yǎng)基，并繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)，供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.2.4 T7EI 酶切檢測(cè)靶位點(diǎn)編輯效率 目的基因片段經(jīng)PCR 擴(kuò)增后重新變性退火變成異源雙鏈DNA，T7EI 酶能夠識(shí)別不完全匹配的雙鏈DNA，從不匹配的位置將其酶切，利用這個(gè)性質(zhì)能夠鑒定CRISPR/Cas9 編輯形成的突變體，評(píng)估crRNA 的編輯效率。轉(zhuǎn)染FOXQ1-crRNA+tracrRNA 的MCF7-Cas9 細(xì)胞擴(kuò)至12 孔板后，取一半細(xì)胞按試劑盒步驟提取基因組DNA，并用微量紫外分光光度計(jì)定量。PCR：吸取50 ng 基因組DNA 用PrimeSTAR Max DNA Polymerase 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增出含crRNA靶序列的片段，其引物信息見表2；PCR 產(chǎn)物用DNA純化試劑盒進(jìn)行純化，并用微量紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量。PCR 產(chǎn)物變性退火：取200 ng 純化后的PCR產(chǎn)物，加入2 μL NE Buffer，并補(bǔ)充無(wú)核酸水至19 μL，并根據(jù)T7E1 試劑盒提供的變溫條件進(jìn)行變性退火。T7EI 酶切：向退火后的PCR 產(chǎn)物加入1 μL T7EI酶，于37℃孵育15 min，加入1 μL 的proteinase K，37℃溫育5 min 終止酶切。2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)退火后的PCR 產(chǎn)物的酶切效率，酶切率越高則細(xì)胞靶位點(diǎn)編輯效率越高。

表2 引物序列Tab 2 Primer sequences

1.2.5 FOXQ1 基因敲除單克隆細(xì)胞株的篩選 用1.2.4 中篩選出的靶位點(diǎn)編輯效率較高的細(xì)胞消化后計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)后按1 cell/孔的量接種按至96 孔板進(jìn)行培養(yǎng)，12 h 內(nèi)于鏡下觀察，舍去多細(xì)胞孔，單細(xì)胞孔繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)；待單克隆細(xì)胞擴(kuò)至12 孔板取一半細(xì)胞提取基因組DNA，再次用T7EI 酶鑒定單克隆細(xì)胞靶基因的編輯狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)方法同1.2.4。將有酶切效率的PCR 產(chǎn)物送至生工生物工程公司進(jìn)行Sanger 測(cè)序，從DNA 水平鑒定FOXQ1 的敲除情況；根據(jù)DNA 測(cè)序結(jié)果篩選出FOXQ1 基因穩(wěn)定敲除的MCF7 單克隆細(xì)胞株。而后，通過(guò)Western 印跡從蛋白水平進(jìn)一步鑒定FOXQ1 的敲除。

1.2.6 Western 印跡 將細(xì)胞種于6 孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后加入適量細(xì)胞裂解液提取總蛋白，用BCA 法測(cè)定細(xì)胞蛋白濃度；各取40 μg 蛋白，用10%的SDS-PAGE 凝膠進(jìn)行電泳，80 V 30 min，100 V 90 min；轉(zhuǎn)膜，80 V 120 min；5%脫脂牛奶室溫封閉1 h；分別加入一抗FOXQ1（1∶1 000）、HIF1-α（1∶1 000）和β-Actin（1∶5 000）4℃孵育過(guò)夜；次日TBST洗膜后加入對(duì)應(yīng)的二抗（1∶2 000），室溫孵育1 h后TBST洗膜，加入ECL 試劑化學(xué)顯色。

1.2.7 劃痕實(shí)驗(yàn) 將MCF7-FOXQ1-/-1 和MCF7-FOXQ1-/+2 及其野生對(duì)照MCF7-WT 細(xì)胞均勻接種于6 孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到100%，用槍頭在每個(gè)孔內(nèi)劃出2×2 橫豎交叉的4 條線，PBS 清洗脫落細(xì)胞，更換新鮮DMEM 培養(yǎng)基，鏡下拍照，記為0 h；常氧組和缺氧組分別置于20%O2和1%O2條件下培養(yǎng)，往后每12 h 拍照記錄一次，并測(cè)量劃痕間距；劃痕愈合率=（0 h 劃痕間距-培養(yǎng)后劃痕間距）/0 h劃痕間距×100%。

1.2.8 transwell 實(shí)驗(yàn) 于24 孔板中加入750 μL 含20%血清的DMEM 培養(yǎng)基，并將transwell 小室置于孔中；分別設(shè)置常氧（20%O2）和缺氧（1%O2）組，每組取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MCF7-FOXQ1-/-1 和MCF7-FOXQ1-/+2 細(xì)胞及其野生對(duì)照MCF7-WT 細(xì)胞各5×104個(gè)，重懸于500 μL DMEM 培養(yǎng)基中并接種于小室內(nèi)，每個(gè)細(xì)胞設(shè)3 個(gè)重復(fù)。48 h 后取出小室，用棉簽輕輕擦拭小室內(nèi)部去除未發(fā)生遷移的細(xì)胞，4%多聚甲醛室溫固定30 min，結(jié)晶紫室溫染色30 min，PBS 清洗后置于室溫風(fēng)干。顯微鏡觀察染色細(xì)胞，隨機(jī)選取5 個(gè)視野拍照并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)。

1.2.9 生物信息學(xué)分析 從METABRIC 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載并整理了1 980 例乳腺癌患者的RNA-seq 數(shù)據(jù)，用于分析FOXQ1 與缺氧相關(guān)基因的表達(dá)相關(guān)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析和t 檢驗(yàn)進(jìn)行差異分析，采用Pearson 相關(guān)性分析評(píng)估基因間mRNA 表達(dá)的相關(guān)性。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FOXQ1 基因敲除單克隆細(xì)胞株的獲取 轉(zhuǎn)染FOXQ1-crRNA+tracrRNA 的MCF7-Cas9 細(xì) 胞 經(jīng)T7E1 酶切檢測(cè)出FOXQ1-crRNA#3 對(duì)細(xì)胞靶位點(diǎn)有最高的編輯效率。用該細(xì)胞進(jìn)行單克隆培養(yǎng)后經(jīng)T7E1 酶切驗(yàn)證出4 株有靶基因編輯效率的單克隆細(xì)胞（圖1A）。通過(guò)進(jìn)一步比對(duì)sanger 測(cè)序結(jié)果，從4 株有FOXQ1 基因編輯效率的單克隆細(xì)胞中鑒定出一株純合子細(xì)胞和3 株雜合子細(xì)胞，依次命 名 為 MCF7 -FOXQ1-/-1、MCF7 -FOXQ1-/+2、MCF7-FOXQ1-/+3 和MCF7-FOXQ1-/+4。純合子細(xì)胞株測(cè)序結(jié)果顯示，與野生型MCF7 相比，其缺失了包括FOXQ1-crRNA#3 識(shí)別區(qū)域在內(nèi)的57 個(gè)堿基，并在缺失序列后的第10 個(gè)堿基位點(diǎn)發(fā)生G-A 堿基突變（圖1B）。

圖1 FOXQ1 基因敲除單克隆細(xì)胞株的獲取Fig 1 Acquisition of FOXQ1 gene knock out monoclonal cell lines

2.2 FOXQ1 基因敲除細(xì)胞株的蛋白表達(dá)驗(yàn)證 盡管基因移碼突變對(duì)翻譯過(guò)程有極大影響，但此4 株FOXQ1 敲除的細(xì)胞株中FOXQ1 蛋白的表達(dá)是否確切受到影響還需進(jìn)一步驗(yàn)證。Western 印跡結(jié)果顯示，與野生型MCF7-WT 細(xì)胞相比，純合子MCF7-FOXQ1-/-1 和雜合子MCF7-FOXQ1-/+2 細(xì)胞株已完全不表達(dá)FOXQ1 蛋白，而雜合子MCF7-FOXQ1-/+3和MCF7-FOXQ1-/+4 還能檢測(cè)到一部分FOXQ1 蛋白的表達(dá)。理論上，基因敲除的雜合子細(xì)胞對(duì)基因的編輯效率應(yīng)為50%，但FOXQ1在MCF7 細(xì)胞中本身是低表達(dá)或不表達(dá)的，因此MCF7-FOXQ1-/+2 可能是一個(gè)FOXQ1 本底表達(dá)足夠低的單克隆。所以，成功構(gòu)建了兩個(gè)FOXQ1 基因穩(wěn)定敲除的MCF7 細(xì)胞，即純合子MCF7-FOXQ1-/-1 和雜合子MCF7-FOXQ1-/+2 細(xì)胞株，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取此兩株進(jìn)行（圖2）。

圖2 FOXQ1 基因敲除細(xì)胞株的蛋白表達(dá)驗(yàn)證Fig 2 Verification of protein expression in FOXQ1 knockout cell lines

2.3 缺氧促進(jìn)MCF7 細(xì)胞中FOXQ1 的表達(dá) Western印跡結(jié)果顯示，與常氧相比，缺氧環(huán)境中，MCF7-WT細(xì)胞FOXQ1 蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。相應(yīng)的，F(xiàn)OXQ1 敲除雜合子細(xì)胞MCF7-FOXQ1-/+2 也顯示出部分FOXQ1 蛋白的上調(diào)（圖3）。

圖3 缺氧促進(jìn)MCF7 細(xì)胞中FOXQ1 的表達(dá)Fig 3 Hypoxia promotes FOXQ1 expression in MCF7 cells

2.4 FOXQ1 介導(dǎo)缺氧引起的MCF7 細(xì)胞遷移能力的增加 劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與常氧相比，缺氧顯著上調(diào)MCF7-WT 的轉(zhuǎn)移能力（t=3.78，P<0.01；t=11.94，P<0.001），而FOXQ1 敲除的純合子細(xì)胞MCF7-FOXQ1-/-1 在缺氧條件下的轉(zhuǎn)移能力基本與常氧條件下持平（t=0.63，P=0.55；t=2.54，P=0.06）。相應(yīng)的，F(xiàn)OXQ1 敲除的雜合子細(xì)胞MCF7-FOXQ1-/+2 其在缺氧條件下的轉(zhuǎn)移能力有一定程度的上調(diào)（t=2.46，P<0.05；t=4.95，P<0.05），但其上調(diào)程度遠(yuǎn)不及MCF7-WT。該結(jié)果表明，F(xiàn)OXQ1 介導(dǎo)了缺氧引起的MCF7 細(xì)胞遷移能力的增加（圖4）。

圖4 FOXQ1 介導(dǎo)缺氧引起的MCF7 細(xì)胞遷移能力的增加Fig 4 FOXQ1 mediates the increased migration of MCF7 cells induced by hypoxia

2.5 HIF-1α 可能直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控FOXQ1 的表達(dá) 分析來(lái)源于METABRIC 數(shù)據(jù)庫(kù)的人類乳腺癌數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)FOXQ1 與HIF1A（r=0.099，P<0.000 1）以及HIF-1α 的代表性下游靶基因LOX[19]（r=0.375，P<0.000 1）、LDHA[20]（r=0.136，P<0.000 1）和GLUT3[21]（r=0.213，P<0.000 1）的mRNA 表達(dá)有顯著相關(guān)性；此外，在FOXQ1 的啟動(dòng)子上存在HIF-1α 的結(jié)合位點(diǎn)（圖5）。

圖5 HIF-1α 可能直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控FOXQ1 的表達(dá)Fig 5 HIF-1α maydirectly regulate the expression of FOXQ1

3 討論

自2013 年首次被應(yīng)用于哺乳動(dòng)物基因組編輯以來(lái)，CRISPR/Cas9 技術(shù)憑借其高效、精準(zhǔn)的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于探索癌癥相關(guān)基因的功能、建立荷瘤動(dòng)物模型、探索藥物靶點(diǎn)等，極大地增進(jìn)了我們對(duì)癌癥基因組學(xué)的認(rèn)識(shí)[22-23]。在本研究中，筆者實(shí)踐了一種更為方便、省時(shí)、高效的CRISPR/Cas9 解決方案，使用商品化Cas9 慢病毒和純化的crRNA、tracrRNA 來(lái)構(gòu)建CRISPR/Cas9 基因編輯體系，省去前期構(gòu)建gRNA 載體或Cas9 載體的工作，極大的簡(jiǎn)化了基因編輯實(shí)驗(yàn)步驟。最終通過(guò)該技術(shù)，成功的構(gòu)建了FOXQ1 基因敲除的MCF7 細(xì)胞株，克服了FOXQ1 在MCF7 中無(wú)法以siRNA 或shRNA 進(jìn)行降表達(dá)的難題，并以此為模型在體外初步探究了FOXQ1 對(duì)缺氧環(huán)境中乳腺癌細(xì)胞遷移能力的影響。結(jié)果表明，缺氧能顯著上調(diào)MCF7 細(xì)胞中FOXQ1的表達(dá)，同時(shí)也能在體外增加MCF7 細(xì)胞的遷移能力，并且該過(guò)程被FOXQ1 所介導(dǎo)。這初步印證了筆者的假設(shè)。

HIF-1α 是介導(dǎo)缺氧反應(yīng)的中心轉(zhuǎn)錄因子，其已被廣泛認(rèn)為在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用[24]。在對(duì)臨床數(shù)據(jù)的研究中發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌中FOXQ1 與HIF1A 的mRNA 表達(dá)具有顯著的相關(guān)性。同時(shí)，筆者還進(jìn)一步分析了HIF-1α 的已知靶基因LOX、LDHA 和GLUT3 與FOXQ1 表達(dá)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)仍然顯著相關(guān)。并且FOXQ1 的啟動(dòng)子上存在HIF-1α的結(jié)合位點(diǎn)，因此推測(cè)FOXQ1 可能作為HIF-1α 的直接靶基因而被調(diào)節(jié)。

研究發(fā)現(xiàn)，Twist1、Snail、Slug、ZEB1 和ZEB2 等EMT 調(diào)節(jié)因子直接或間接受HIF-1α 的調(diào)控[25]。而據(jù)報(bào)道，Twist1、Snail 和ZEB2 也同樣作為FOXQ1的下游因子調(diào)控腫瘤細(xì)胞的遷移侵襲[26-28]。同時(shí)，筆者的結(jié)果表明，F(xiàn)OXQ1 完全敲除后缺氧對(duì)MCF7 遷移能力的促進(jìn)作用幾乎完全被抑制，并且MCF7 細(xì)胞的遷移能力與FOXQ1 的表達(dá)具有一定的劑量依賴性，F(xiàn)OXQ1 在缺氧信號(hào)所調(diào)控的一系列細(xì)胞遷移相關(guān)下游因子中起關(guān)鍵作用。

總之，通過(guò)CRISPR/Cas9 系統(tǒng)成功構(gòu)建了FOXQ1基因穩(wěn)定敲除的乳腺癌MCF7 細(xì)胞株，并發(fā)現(xiàn)FOXQ1 介導(dǎo)了缺氧對(duì)MCF7 細(xì)胞遷移能力的促進(jìn)作用。這些工作為今后深入研究乳腺癌的缺氧微環(huán)境中FOXQ1 的功能及其機(jī)制提供了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。